Questo progetto è stato di supporto in parte dalla Johns Hopkins University, ufficio del preposto attraverso il Gateway Science Initiative.

Nota: Il DNA di metagenomica è purificato dal suolo (Contea di Baltimore, Maryland) utilizzando un isolamento genomic di terreno disponibili in commercio kit (Vedi Tabella materiali). Utilizzando uno spettrofotometro UV (Vedi Tabella materiali), il DNA genomico purificato dovrebbe avere un rapporto di 260/280 (nm) &#62; 1.8 e un rapporto di 260/230 tra 2.0-2.2 per assicurare che il campione è esente dagli agenti inquinanti. La quantità di DNA genomico richiesto per NS varia da 200 ng a 2 µ g.
1. metodo di preparazione rapida libreria (protocollo corto)
Nota: Si tratta di un protocollo corto. Vedi Tabella materiali per il kit di sequenziamento rapido.
<ol>
	<li>In un 0,2 mL tubo con pareti sottili (Vedi Tabella materiali) aggiungere 200 ng di alto peso molecolare del DNA in una finale del volume di 7,5 µ l di acqua distillata.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 µ l di miscela di frammentazione (FM) dal kit di preparazione rapida libreria e mescolare delicatamente per inversione. Centrifuga di impulsi per rotazione verso il basso (1.000 x g per 5 s).</li>
	<li>Il campione viene posto in un termociclatore (Vedi Tabella materiali) per un round a 30 ° C per 1 min seguita da 75 ° C per un minimo di 1 rimuovere la centrifuga tubo e impulso a girare giù il campione.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di adattatore rapido e 0,2 µ l di mix master ligasi di blunt/TA e quindi memorizzare la libreria adattata e legata sul ghiaccio. Nota: Se si utilizza il protocollo corto procedere al passaggio 8</li>
</ol>
2. legatura sequenziamento Protocol (protocollo lungo): Metagenomica frammentazione del DNA
Nota: Vedi Tabella materiali per il kit di sequenziamento di legatura.
<ol>
	<li>Diluire 1 µ g di DNA genomico purificato ad un volume finale di 46 µ l in acqua deionizzata.</li>
	<li>Trasferimento il campione da una frammentazione del DNA del tubo (Vedi Tabella materiali) e centrifugare per 1 min a temperatura ambiente a 8.000 x g usando un microcentrifuge (Vedi Tabella materiali) per produrre frammenti genomic ~ 8 kb. Assicurarsi che tutto il liquido è passato nel tubo di raccolta.</li>
	<li>Capovolgere la provetta di frammentazione, ritorna alla centrifuga e centrifugare per 1 min raccogliere il DNA genomic frammentato nella camera inferiore.</li>
	<li>Trasferire il DNA genomic frammentato in una provetta di 1,5 mL sterile basso-DNA binding e analizzare una porzione su gel di agarosio (0,6%) bassa percentuale di frammentazione di confermare a &#62; 30 kb.</li>
</ol>
3. frammentazione DNA Genomic fine-preparazione
<ol>
	<li>Utilizzando 800 ng di DNA genomico frammentato in 45 µ l di acqua deionizzata, aggiungere 7 reazione di fine-prep µ l tampone (Vedi Tabella materiali), mix di enzima 3 µ l (Vedi Tabella materiali) e 5 µ l di nucleasi acqua gratis.</li>
	<li>Mix di inversione e impulso centrifuga (1.000 x g per 5 s).</li>
	<li>Trasferire il campione in una provetta di sottili di 0,2 mL e incubare il campione per 5 min a 20 ° C, seguita da incubazione a 65 ° C per 5 min.</li>
	<li>Centrifuga di impulso per portare contenuti verso il basso del tubo.</li>
	<li>Esempio di trasferimento di un tubo del microcentrifuge basso-DNA binding di 1,5 mL.</li>
	<li>Preparare biglie magnetiche (Vedi tabella dei materiali). Aggiungere 60 µ l di sedimento perline per la reazione di preparazione di fine da passo 3.5 e mescolare pipettando.</li>
	<li>Incubare su un mixer di rotatore a 100 giri/min (Vedi Tabella materiali) per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Impulso di centrifugare il campione per le perle di pellet, quindi posizionare il campione accanto a magnete.</li>
	<li>Una volta che le perle siano rispettate il magnete, pipettare off surnatante e scartare.</li>
	<li>Rimuovere la provetta dalle perline magnete e lavare con 200 µ l di etanolo al 70% preparata pipettando delicatamente il campione di alti e bassi.</li>
	<li>Centrifuga di impulso per pellet le perline e tornare al magnete.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e scartare. Ripetere la fase di lavaggio utilizzando 200 µ l di etanolo al 70%.</li>
	<li>Impulso di centrifugare la provetta, ritorna al magnete e rimuovere tutto il lavaggio di etanolo 70%.</li>
	<li>Aprire il coperchio del tubo del microcentrifuge, asciugare le perline per aria per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la provetta dal magnete e sospendere il pellet in 31 µ l di acqua sterile, privo di nucleasi. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Restituire il tubo al magnete fino a quando tutte le perline hanno pellettato e l'eluato è chiaro.</li>
	<li>Trasferire l'eluato in una microcentrifuga da 1,5 mL. Utilizzando 1 µ l di campione, quantificare il DNA fine-preparata utilizzando uno spettrofotometro UV a 260 nm (Vedi Tabella materiali). Nota: Il recupero percentuale deve essere ~ 70% (700 ng) da una concentrazione iniziale di 1 µ g di DNA genomic.</li>
</ol>
4. adattatore e Tether aggiunta di frammenti di DNA Genomic fine-prepped
<ol>
	<li>Mescolare tutti la ligasi di blunt/TA mix master tubi di inversione, e quindi di impulso centrifuga per portare il contenuto verso il basso.</li>
	<li>Utilizzando 30 µ l di DNA fine-prepped, aggiungere 20 µ l di miscela di adattatore e 50 µ l di mix master di legatura di blunt/TA.</li>
	<li>Mescolare per inversione, centrifuga di impulso e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
</ol>
5. magnetico Bead preparazione
<ol>
	<li>Vortice le perline e poi trasferire 50 µ l di perle sospese a un microfuge 1,5 mL tubo.</li>
	<li>Posizionare il tubo sul magnete per appallottolare le perline fino a quando l'eluato Cancella.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e scartare.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di associazione di tallone (Vedi Tabella materiali per kit per microsfere) ai talloni, vortice per risospendere le perle, a pellet le perline sul magnete, rimuovere il supernatante e scartare. Ripetere il lavaggio con 100 µ l di tampone di associazione.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di associazione di perlina ai branelli lavati. Vortice per risospendere le perline.</li>
</ol>
6. Biblioteca purificazione
<ol>
	<li>Utilizzando una micropipetta P200, aggiungere 40 µ l di perline dal passaggio precedente per il DNA di genomic adattato/tethered. Mescolare accuratamente il campione di pipettaggio.</li>
	<li>Incubare il campione su un mixer di rotatore a 100 giri/min per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Posizionare il campione sul magnete e consentire le perline a stabilirsi. Pipettare il sovranatante e scartare.</li>
	<li>Risospendere le perline in 140 µ l di tampone di associazione di perlina di pipettaggio. Posizionare il campione contro il magnete, scartare il surnatante e lavare nuovamente con un altro 140 µ l di tampone di associazione di tallone.</li>
	<li>Impulso Centrifugare la provetta, posizionare il tubo sul magnete per 2 min, rimuovere il buffer di associazione perlina rimanenti dal pellet.</li>
</ol>
7. eluizione della biblioteca dal magnete perline
<ol>
	<li>Risospendere i branelli magnetici in 15 µ l di tampone di eluizione di pipettaggio. Incubare il campione per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Posizionare il tubo contro il magnete per appallottolare le perline.</li></ol>Quando la soluzione consente di cancellare, rimuovere 15 µ l di eluato e trasferirlo in una provetta di microfuge 1,5 mL e posizionare il campione sul ghiaccio.
	<li>Quantificare la libreria utilizzando uno spettrofotometro UV. Nota: Il recupero percentuale dovrebbe essere ~ 25% (250 ng) da una concentrazione iniziale di 1 µ g di DNA genomic.</li>

8. un controllo di qualità/Run a partire
<ol>
	<li>Rimuovere la cella di flusso dalla confezione e collegare la cella di flusso per il sequencer portatile, in tempo reale (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Collegare il sequencer in un computer tramite cavo USB e avviare il software di sequencing (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Fare clic su "Connetti" dispositivo attraverso il software di sequencing, selezionare "NC_Platform_QC.py" e cliccare su "Start".</li>
	<li>Il controllo qualità (QC) dura circa 6-7 min per completare; cercare un 'mare di verde' (ampie zone di uscita) sulla lettura QC per confermare che ci sono abbastanza attivi pori (&#62; 800) sequenziamento del DNA.</li>
</ol>
9. iniziare una corsa di sequenziamento
<ol>
	<li>Aprire il programma di sequenziamento; verrà visualizzata una finestra di dialogo. Nella casella ID del campione, il nome del campione.</li>
	<li>Fare clic sulla casella "Flusso Cell ID" e inserire il codice trovato sull'adesivo sulla parte superiore della cella di flusso.</li>
	<li>Aprire il coperchio di cella di flusso e quindi far scorrere il coperchio della porta a destra (senso orario) affinché nel pozzetto del campione è visibile. Una volta che la porta è aperta, verifica per una piccola bolla. Rimuovere alcuni microlitri di buffer inclusa la bolla.</li>
	<li>Controllare per essere sicuri che c'è buffer in tutta la matrice del sensore. Fare il buffer di adescamento mescolando 480 µ l di tampone di corsa con mix di combustibili (RBF-1, vedere la Tabella materiali) (essere sicuri di mescolare accuratamente prima) con acqua priva di nucleasi di 520 µ l.</li>
	<li>Aggiungere 800 µ l di buffer di adescamento per il porto di adescamento. Sollevare con cautela il coperchio "SpotOn" per renderlo accessibile.</li>
	<li>Dopo 5 minuti, aggiungere un ulteriore 200 µ l di tampone di adescamento per il porto di adescamento.</li>
</ol>
10. caricamento della libreria
<ol>
	<li>Prima di preparare il posto di biblioteca i seguenti reagenti sul ghiaccio: RBF-1 (dal kit di sequenziamento), adattato e tethered libreria e libreria di caricamento Perline (LLB; dal kit di sequenziamento).</li>
	<li>In una provetta da centrifuga 0,2 mL, aggiungere µ l 25,5 di RBF e 12 µ l di acqua priva di nucleasi conservato a temperatura ambiente.</li>
	<li>Miscelare la LLB pipettando alti e bassi. Aggiungere 26,5 µ l di LLB al tubo 0.2 µ l. Mescolare i reagenti pipettando alti e bassi. Nota: La LLB tende a depositarsi fuori la miscela.</li>
	<li>Aggiungere 11 µ l della biblioteca adattata e legata al tubo 0.2 µ l. Mescolare per inversione e spin mediante centrifugazione di impulso.</li>
	<li>Aggiungere 75 µ l di campione dal passaggio 9.4 alla porta "SpotOn" goccia a goccia. Assicurarsi che ogni goccia scorre nella porta prima di aggiungere il successivo.</li>
	<li>Con attenzione sostituire il coperchio porta campione in modo che il tappo entra nel porto e sostituire il coperchio del dispositivo.</li>
</ol>
11. a partire uno Script di protocollo Software di Sequencing
<ol>
	<li>Aprire il menu a discesa sotto 'Selezionare Program' e selezionare "sequenziamento di 48 ore."</li>
	<li>Fare clic sul pulsante "Esegui" per avviare lo script.</li>
	<li>Controllare i risultati di scansione Mux segnalato nel flusso di notifica per il numero di pori attivi la scansione MUX. Nota: Questo numero può essere diverso dal numero di pori nel CQ e una grande differenza potrebbe indicare un problema.<ol>
		<li>Se c'è una significativa riduzione dei pori attivi dalla pista di QC, riavviare il software e se c'è ancora una differenza significativa, riavviare il computer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Controllare che la temperatura del dissipatore è 34 ° C, come riportato dallo script di software di sequencing. Nota: Se la temperatura è non a 34 ° C quindi ci non sarà abbastanza attivi pori per la corsa.</li>
	<li>Controllare l'istogramma di lettura lunghezze per determinare se le lunghezze di sequenza sono attesi e appropriato per il disegno sperimentale.</li>
	<li>Chiudere l'agente desktop utilizzando 'Chiudi x.' Quit il software di sequencing chiudendo il web GUI. Scollegare il dispositivo dal computer.</li>
</ol>
12. analisi dell'esecuzione e i risultati
Nota: Durante l'esecuzione di sequenziamento, i dati possono essere monitorati utilizzando il programma di "Visualizza REPORT" utilizzando l'agente di desktop. Durante o dopo che viene completata l'esecuzione, i file sono disponibili in un formato di file di dati → legge → passare cartella (default) di FAST5. Se questa cartella è aperta mentre è attivo il sequenziamento, potrebbe bloccare il computer.
<ol>
	<li>Per visualizzare e manipolare sequenze, scaricare un "HDFViewer".</li>
	<li>Per visualizzare i file di sequenziamento, aprire direttamente l'HDF visualizzatore → Apri dati cartella → Seleziona che tutti i file tipi → selezionare c: auto (impostazione predefinita) → selezionare dati → selezionare letture → selezionare pass.</li>
	<li>Trovare e selezionare il file FASTQ nel menu a discesa di sinistra; file verranno aperto e possono essere salvati in formato FASTQ. Nota: Ai fini dell'esperimento di studente, sequenze di 350 nucleotidi o più sono stati selezionati per ulteriori analisi. Uscita dalla chiamata base permette all'utente di ordinare letture sequenza basate sulla dimensione. I file FASTQ possono essere analizzati tramite BLAST (NCBI) o altri programmi di bioinformatica.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+metagenomics+identification+of+viral+pathogens+in+clinical+samples+by+real-time+nanopore+sequencing+analysis.">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99 (2015).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella.">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114 (2015).</li><li>Ashton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+a+bacterial+antibiotic+resistance+island.">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.</a> Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).</li><li>Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+bacterial+genome+assembled+de+novo.+using+only+nanopore+sequencing+data.">A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data.</a> Nat Method. 12, 733-735 (2015).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Outbreak+Tool.">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool.</a> Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).</li><li>Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+for+Microbial+Identification+and+Characterization.">Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization.</a> J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).</li><li>Rothberg, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li><li>Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+discrimination+in+immobilized+DNA+oligonucleotides+with+a+biological+nanopore.">Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.</a> PNAS. 106, 7702-7707 (2009).</li><li>Shendure, J., Hanlee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+DNA+sequencing.">Next generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Metagenomics+of+Soil.">The Metagenomics of Soil.</a> Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).</li></ol>

Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.

Molti metodi di sequenziamento di generazione successiva sono stati generati e ognuno dipende dal sequenziamento di sintesi ma le piattaforme di rilevamento per l'identificazione dei nucleotidi differiscono. NS, la più recente aggiunta al marketplace, utilizza un metodo diverso completamente, che non richiede una reazione di sequenziamento o etichettati nucleotidi. Questo metodo si avvale del differenziale di costo di nucleotidi già incorporati che passano attraverso un poro elettrificato. L'identificazione di ogni nucleotide si verifica da una modulazione della corrente elettrica dalle basi diverse che passano attraverso il nanoporo. Questo sistema multiplex consente all'utente di molti frammenti di sequenza in un momento. Sequenziando entrambi i filamenti del DNA, la precisione della sequenza è aumentata significativamente e il software di sequencing, che possa essere caricato su un computer portatile, elabora i segnali e fornisce le informazioni di sequenza che possono essere analizzate.
Nel pyrosequencing, una sequenza di metodo di sintesi (SBS), rilevamento della base specifica incorporata nel modello dipende l'analisi di luciferase e la generazione di segnali chemiluminescente8. Nel sequenziamento di semiconduttore di ioni, gli ioni di idrogeno liberato, che fa diminuire il pH viene rilevato da un sensore di ioni9. Sequenziamento in tempo reale di singola molecola dipende la zero modalità onda guida (ZWD)10, che si illumina per il rilevamento di una molecola fluorescente contrassegnata per il nucleotide incorporato. SBS utilizza un metodo unico per amplificare il DNA dell'obiettivo tale che sono aggregati di sequenze uniche generato13. Rilevamento del nucleotide aggiunto si ottiene quando viene registrata la fluorescenza del nucleotide taggato. NS ha d'altra parte il vantaggio unico rispetto ad altri metodi in quanto richiede risorse tecniche limitate, è portatile, produce lunghe letture di sequenziamento, non richiede nessuna previa amplificazione di DNA e può essere azionato a costi ridotti rispetto ad altri metodi. I nostri studenti hanno trovato il protocollo di preparazione più recente, rapido libreria per essere semplice e suscettibili di una classe di laboratorio di tre ore. Alcuni dei problemi che abbiamo incontrato erano bolle nella cella di flusso che erano difficili da rimuovere, ha richiesto la potenza del computer significativo (un terabyte di spazio di archiviazione), la corrente di uscita dei dati è in un file di FAST5 e la cella di flusso di sequenziamento ha una durata limitata prima di esso si deteriora. Inoltre, altri svantaggi del NS legatura sequenziamento protocollo (protocollo lungo) è che richiede diversi passaggi di preparazione di biblioteca, richiede competenze nelle tecniche di biologia molecolare e genera la fedeltà di sequenziamento ridotta rispetto ad alcuni metodologie di sequenziamento3. Tuttavia, recenti progressi con il nuovo kit di preparazione rapida libreria richiede solo 10 minuti per la preparazione di biblioteca e ha dimostrato un tasso di errore ridotto sequenziamento. Il nuovo metodo di preparazione di biblioteca era molto favorevole per l'uso in una classe di laboratorio.
Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo, in particolare in QC di cella di flusso. Questo include l'esecuzione di un controllo di qualità iniziale entro cinque giorni dal ricevimento della cella di flusso e il loro utilizzo entro 8 settimane. Anche se abbiamo usato le cellule di flusso sono stati oltre 8 settimane, il numero di pori aperti/attivo è notevolmente ridotto. È importante che gli esperimenti sono programmati per un diario dove si ottiene il massimo utilizzo di celle di flusso. Abbiamo utilizzato il protocollo di pulizia e riutilizzato le cellule di flusso con successo.
Studiando la metagenomica del rappresentano terreno un serbatoio genetico non sfruttato della diversità microbica. Ad esempio, un grammo di suolo si stima che contenga tra 107 - 109 cellule procariotiche14. Inoltre, gli organismi del terreno sono la principale fonte di nuovi prodotti naturali, enzimi e antibiotici. Così, analisi di sequenza del DNA Metagenomica del suolo rappresenta un prezioso strumento didattico per studenti di ogni livello di istruzione. La tecnologia di NS facilità d'uso e basso costo rendono questo sistema uno strumento didattico molto efficace. Gli studenti possono campioni ambientali di sequenza e al completamento della sequenza di utilizzare strumenti di bioinformatica disponibili per identificare e caratterizzare i microbi e metagenomica sequenze in campioni di prova. Utilizzando la tecnologia di NS, gli studenti hanno vera esperienza hands-on, che ha fino ad ora stato di raggiungere per uso nei corsi di laboratorio a causa delle competenze tecniche avanzate e alti costi di reagente, attrezzature e manutenzione in altre piattaforme di sequenziamento. Recentemente, uno dei nostri studenti (J. Harrison, comunicazione personale) ha riferito l'uso di questa tecnologia in un progetto di monitoraggio ambientale dei suoli di fattoria. Ci aspettiamo che ci saranno molte altre applicazioni per questa tecnologia nello spazio di formazione.

L'obiettivo di questa procedura è per illustrare i passaggi necessari per la preparazione di una libreria di DNA ambientale per la sequenziazione, l'utilizzo di un dispositivo di sequenziamento nanopore flusso delle cellule e di eseguire analisi delle sequenze del DNA generate utilizzando il software di sistema e Centro nazionale per gli strumenti di bioinformatica Biotechnology Information (NCBI) per identificare la specie microbica nel suolo. Attualmente, la maggior parte delle piattaforme di sequenziamento del DNA richiedono un investimento importante nella formazione tecnica e strumentazione complessa, che non è fattibile in ambienti poveri di risorse o in applicazioni sul campo. La piattaforma di sequenziamento (NS) nanopore elimina questi problemi con un costo conveniente, semplice da utilizzare il protocollo di preparazione di biblioteca e un dispositivo portatile per sequenza e analizzare una varietà di diversi tipi di acidi nucleici1,3. Abbiamo incorporato la piattaforma di NS in diversi corsi di laboratorio per gli studenti di laurea magistrale.
NanoPore tecnologia per sequenziamento biomolecole ha dimostrato ampie applicazioni nelle scienze della vita, compresa l'identificazione di patogeni batterici e virali1,2,6, biodiversità ambientale studi, monitoraggio della sicurezza alimentare, analisi genomic3,5e caratterizzazione di batteri antibiotico-resistenza4. NS è un metodo veloce e preciso per gli acidi nucleici di sequenza che si basa sul principio del "filo di sequenziamento" rilevando perturbazioni elettriche di basi nucleotidiche individuali quando DNA a singola elica passa attraverso una nanopore inserita electrified membrana polimerica sintetica. I passaggi coinvolti nella preparazione di DNA per NS includono frammentazione del genoma, fine riparazione e 3' dA-tailing di frammenti genomic, adattatore e ricottura di legare al DNA, DNA biblioteca purificazione e caricamento della libreria nel dispositivo di cella di flusso nanopore. Frammentazione del genoma in ~ 8 kb di dimensioni avviene mediante centrifugazione 1-2 µ g di DNA genomic attraverso un tubo di frammentazione del g-tubo. Le estremità genomiche frammentate sono poi riparate e dalla coda con dA poli utilizzando un kit disponibile in commercio. Sequenze di singolo adattatore non recuperabili, che sono compatibili con la proteina motore nanoporo, vengono aggiunti alle estremità del DNA che sono usate per guidare la sequenza di DNA attraverso il nanoporo (Figura 1). Le sequenze di tether sono necessari per purificazione del DNA e per localizzare le molecole di DNA alla membrana poro. Il tornante viene generato legando un adattatore tornante a un'estremità della coda dA biblioteca. Le strutture di tornante alle estremità del DNA permette la lettura dei filamenti senso e antisenso come il DNA passa attraverso il nanoporo (Figura 2). La libreria genomica preparata viene quindi purificata dalla reazione utilizzando streptavidina perline usando un campo magnetico, in seguito caricando il campione nella cella di flusso nanoporo per l'analisi.
Il DNA di sequenza è valutato per la qualità e letture di sequenziamento che sono accettabili per l'analisi sono quindi sottoposti a diversi strumenti di bioinformatica per identificare i microbi. Le sequenze sono "tradotti" in un FASTQ da un formato di FAST5. Nel formato FASTQ, le sequenze possono essere utilizzato quindi nell'analisi BLAST.

<table><tbody><tr><td>Thermal Cycler</td><td>LifeECO</td><td>BTC42096</td><td></td></tr><tr><td>Covaris g-TUBE</td><td>Covaris</td><td>520079</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext End Repair Module</td><td>New England BioLab</td><td>E7546</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>MyOne C1 Strepavidin Beads</td><td>Thermo Fisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Model 5420</td></tr><tr><td>Nanodrop UV spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Model 2000</td></tr><tr><td>Belly Dancer Orbital Shaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z768499</td><td></td></tr><tr><td>Power Soil DNA Isolation Kit</td><td>MO BIO</td><td>12888-50</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Sequencing Kit 2D</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-LSK208</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td></td></tr><tr><td>End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>AmPure XP Magnetic Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Basic Starter Pack&amp;nbsp;</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td></td><td>Includes MinION&amp;nbsp; Sequencing Device and Flow Cell</td></tr><tr><td>MinKNOW software</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td>Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB)</td></tr></tbody></table>

nanopore dna sequencing for metagenomic soil analysis

In questo articolo vengono descritti i passaggi per la costruzione di una libreria di DNA dal suolo, preparazione e utilizzo di cella di flusso nanoporo e l'analisi delle sequenze del DNA identificato utilizzando software per computer. Sequenziamento del DNA nanopore è una tecnica flessibile che permette il sequenziamento del genoma microbico rapido identificare le specie batteriche e virali, per la caratterizzazione di ceppi batterici e per rilevare le mutazioni genetiche che conferiscono resistenza agli antibiotici. I vantaggi di nanopore sequenziamento (NS) per le scienze biologiche includono la bassa complessità, costi ridotti e in tempo reale rapido sequenziamento del DNA genomico purificato, ampliconi PCR, campioni di cDNA o RNA. NS è un esempio di "sequenziamento strand", che coinvolge il sequenziamento DNA, guidando una singola molecola di DNA incagliata attraverso una nanopore che viene inserita in una membrana di polimero sintetico. La membrana ha una corrente elettrica applicata attraverso di esso, così come le basi individuali passano attraverso il nanoporo la corrente elettrica è interrotta a vari gradi di quattro basi nucleotidiche. L'identificazione di ogni nucleotide si verifica rilevando la caratteristica modulazione della corrente elettrica dalle basi differenti, che passano attraverso il nanoporo. Il NS sistema consiste di un palmare, alimentato via USB dispositivo portatile e una cella di flusso monouso che contiene una matrice di nanopore. Il dispositivo portatile si inserisce in un computer portatile standard che legge e registra la sequenza di DNA mediante software per computer.

La tecnologia di progettazione e nanopore sperimentale ha fornito un metodo veloce e poco costoso per studenti al suolo del DNA di sequenza. Il rappresentanza Esegui passati i parametri di controllo di qualità con più di 800 pori disponibili per il sequenziamento. La corsa ha provocato oltre 125.000 letture disponibili per lo studio con una lunghezza di sequenza mediano di 5,38 kb. Sequenze sono dato un punteggio di qualità e quindi sono stati analizzati solo quelle sequenze con punteggi accettabile. Come output il sequenziamento reazione è in formato FAST5, che non è accettato da programmi come BLAST (NCBI), le sequenze sono state visualizzate nel Visualizzatore di HDF che converte le sequenze FASTQ formato, che è compatibile per analisi BLAST. In futuro le iterazioni del software, i dati saranno disponibili come formato FASTQ, eliminando la necessità per il Visualizzatore HDF. Vedi supplementari figure 1, 2 e 3.
Cinquanta sequenze di oltre 350 nucleotidi di lunghezza sono stati oggetto di analisi da BLASTN (nucleotidi nel database del nucleotide) o BLASTX (nucleotidi tradotte in sequenza dell'amminoacido) (NCBI) per identificare gli organismi nel campione di terreno. Dato il tempo vincoli di classe e che l'obiettivo del corso è su metodi di laboratorio e non bioinformatica, abbiamo gli studenti analizzare sequenze all'interno di questi parametri. Le nostre lezioni di bioinformatica possono utilizzare i dati per lo sviluppo di strumenti di analisi della pipeline. Questo livello di analisi bioinformatica non rientra nella classe di tecniche di laboratorio. Tabella 1 è un elenco degli organismi che sono stati identificati con i valori e di meno di 4 e-04. In genere, e-valori inferiori a 4 e-04 indicano forte somiglianza tra la sequenza di input (query) e la sequenza corrispondente. Gli organismi identificati da BLASTN (contro il database non ridondante (nr)) sono da una grande varietà di specie e sono disponibili per ulteriori genomica e analisi di proteine. Questo campione di terreno, che è venuto da un giardino in Contea de Baltimora, MD non era mai stato testato, quindi non c'erano nessun precedente dato da cui partire per determinare che cosa potrebbero essere organismi nel suolo. BLASTN analisi (contro il database nr) analisi inoltre ha indicato c'erano sequenze con alcuna somiglianza nel database nr. Per determinare se questi sono veramente nuove sequenze, ulteriore studio è necessario. L'analisi delle numerose sequenze di BLASTX ha rivelato parecchie proteine da organismi non rappresentati nell'analisi BLASTN. La tabella 2 elenca parecchie proteine possibili compreso endopeptidasi e proteine ATPasi-like. Utilizzando questa libreria di sequenze, gli studenti hanno l'opportunità di utilizzare più sofisticati strumenti di bioinformatica per eseguire ulteriori analisi, se diretto dall'istruttore.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
Figura 1 : Preparazione libreria genomica. Fasi per la preparazione della libreria di DNA genomico per la sequenza utilizzando la tecnologia nanopore. Questa figura è stata modificata con le necessarie autorizzazioni. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
Figura 2 . Schematica di sequenziamento del DNA usando una nanopore. DNA passando attraverso una membrana nanopore con identificazione di base e di generazione di segnale elettrico. Questa figura è stata modificata con le necessarie autorizzazioni. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organismo</td>
			<td>valore e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomyces sp.</td>
			<td>3.00 E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocardoides sp.</td>
			<td>5.00 E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gordonia sp.</td>
			<td>5.00 E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium nitrativorens</td>
			<td>1.00 E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starkeya novella</td>
			<td>1.00 E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium denitrificans</td>
			<td>1.00 E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibomicrobium sp.</td>
			<td>5.00 E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas sp.</td>
			<td>2.00 E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodothemus marinus</td>
			<td>1.00 E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turneiella parva</td>
			<td>2.00 E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>0, 00E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradyrhizobium sp.</td>
			<td>3.00 E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemmatirosa kalamazoonesis</td>
			<td>1.00 E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burkholderia sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomonas sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellumonas sp.</td>
			<td>6.00-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: risultati selezionati di analisi BLASTN. Sequenze di DNA di metagenomica del suolo sottoposte a ricerca per analogia BLASTN contro il database non ridondante del nucleotide NCBI. I dati riportati hanno e-valori di 4 x e-4 o meno.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Proteina</td>
			<td>Organismo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteina ipotetica</td>
			<td>Acidobacter batterio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM dipendente metiltransferasi</td>
			<td>H. denitrificans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPasi</td>
			<td>Jannaschia sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endopeptidasi</td>
			<td>Shigella sonnei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteina di lisi</td>
			<td>E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: risultati selezionati di analisi BLASTX. Sequenze di DNA di metagenomica del suolo sottoposte a ricerca per analogia BLASTX contro il database di proteine non ridondante di NCBI.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
Supplementare figura 1: risultati delle piattaforma QC. Vengono presentati i risultati della piattaforma QC. In alto a destra sono i risultati di QC per pori attivi. Ogni quadrante della cella di flusso è testato per i pori attivi. La pagina principale è dinamica e cambia come ogni quadrante è testato. In questa esecuzione, 1.414 singoli pori sono stati rilevati.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
Supplementare nella figura 2: conversione FAST5 in file FASTQ. Ecco l'output dei dati dalla pista di sequenziamento sul lato destro. Ogni riga rappresenta una sequenza individuale. Il lato sinistro della figura mostra la sequenza evidenziata dal lato destro, nel Visualizzatore di HDF che converte la sequenza in un file FASTQ che può essere utilizzato per ulteriori analisi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
Supplementare nella figura 3: sequenza di esempio di FASTQ nel Visualizzatore HDF. Questa sequenza (leggi 803) è in un file FASTQ che converte i dati di FAST5 in nucleotidi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis at JoVE.com

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

NanoPore tecnologia per sequenziamento biomolecole ha numerose applicazioni nelle scienze della vita, compresa l'identificazione di agenti patogeni, monitoraggio della sicurezza alimentare, analisi genomica, metagenomici monitoraggio ambientale e caratterizzazione di batteri resistenza agli antibiotici. In questo articolo, la procedura per il sequenziamento del DNA di metagenomica del suolo per l'identificazione di specie utilizzando la tecnologia di sequenziamento nanopore è dimostrata.

Sequenziamento del DNA nanoporo per analisi Metagenomica del suolo

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

nanopore-dna-sequencing-for-metagenomic-soil-analysis

Research

JoVE Journal

Environment

30.2K Views.  Johns Hopkins University. NanoPore tecnologia per sequenziamento biomolecole ha numerose applicazioni nelle scienze della vita, compresa l'identificazione di agenti patogeni, monitoraggio della sicurezza alimentare, analisi genomica, metagenomici monitoraggio ambientale e caratterizzazione di batteri resistenza agli antibiotici. In questo articolo, la procedura per il sequenziamento del DNA di metagenomica del suolo per l'identificazione di specie utilizzando la tecnologia di sequenziamento nanopo...

Video: Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

L&#39;analisi metagenomica di insilato

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Ricerca

Genetica

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

Rilevamento in loco molecolare di fitopatogeni terricoli, utilizzando un sistema PCR in tempo reale portatile

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Ambiente

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Isolamento ed analisi di comunità microbiche nel suolo, rizosfera e radici negli esperimenti di erba perenne

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenziamento dell'mRNA da sangue intero utilizzando il sequenziamento di NanoPore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and characterize microbial communities in environmental and biological systems. These measurements are even enabling enhanced analyses of complex soil microbial communities, which are the most complex microbial systems known to date. Multi-omic analyses, however, do have sample preparation challenges, since separate extractions are typically needed for each omic study, thereby greatly amplifying the preparation time and amount of sample required. To address this limitation, a 3-in-1 method for the simultaneous extraction of metabolites, proteins, and lipids (MPLEx) from the same soil sample was created by adapting a solvent-based approach. This MPLEx protocol has proven to be both simple and robust for many sample types, even when utilized for limited quantities of complex soil samples. The MPLEx method also greatly enabled the rapid multi-omic measurements needed to gain a better understanding of the members of each microbial community, while evaluating the changes taking place upon biological and environmental perturbations.

A protocol is presented for simultaneously extracting metabolites, proteins, and lipids from a single soil sample, allowing reduced sample preparation times and enabling multi-omic mass spectrometry analyses of samples with limited quantities.

Il protocollo MPLEx Multi-omic nell'analisi di campioni di terreno

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

Chimica

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Biologia

Visualizing Methane-Cycling Microbial Dynamics in Coastal Wetlands

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus playing a critical role in regulating the methane cycle. The wetlands in South Texas, which are subject to frequent weather events, fluctuating salinity levels, and anthropogenic activities due to climate change, influence methane cycling. Despite the ecological importance of these processes, methane cycling in South Texas coastal wetlands remains insufficiently explored. To address this gap, we developed and optimized a method for detecting genes related to methanogens and methanotrophs, including mcrA as a biomarker for methanogens and pmoA1, pmoA2, and mmoX as biomarkers for methanotrophs. Additionally, this study aimed to visualize the spatial and temporal distribution patterns of methanogen and methanotroph abundance utilizing the geographic information system (GIS) software ArcGIS Pro. The integration of these molecular techniques with advanced geospatial visualization provided critical insights into the spatial and temporal distribution of methanogen and methanotroph communities across South Texas wetlands. Thus, the methodology established in this study offers a robust framework for mapping microbial dynamics in wetlands, enhancing our understanding of methane cycling under varying environmental conditions, and supporting broader ecological and environmental change studies.

The protocol detects key methane-cycling genes in South Texas coastal wetlands and visualizes their spatial distribution to enhance understanding of methane regulation and its environmental impacts in these dynamic ecosystems.

Visualizzazione delle dinamiche microbiche del ciclo del metano nelle zone umide costiere

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

Sequenziamento di lettura ultra-lungo per analisi di DNA Genomic intero

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Bioingegneria

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Sequenziamento del DNA nanoporo per analisi Metagenomica del suolo

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

L'analisi metagenomica di insilato