このプロジェクトはサポート部分でジョンズ ・ ホプキンス大学で憲兵のオフィスによって、ゲートウェイ科学イニシアティブ。

注: メタゲノム DNA 市販土壌ゲノム分離を用いた土壌 (ボルティモア郡、メリーランド州) 精製キット (材料の表を参照してください)。紫外線分光光度計を使用して (材料の表を参照)、精製した DNA は 260/280 (nm) の比率を持つ必要があります &#62; 1.8 と 2.0 から 2.2 サンプル確実に比 260/230 汚染物質の無料です。200 NS の範囲に必要な DNA 量 2 μ g に ng。
1. 急な図書館調製法 (短いプロトコル)
注: これは短いプロトコルです。急速なシーケンス キットの材料表を参照してください。
<ol>
	<li>薄肉円管 (材料表参照) 200 を追加 0.2 mL の蒸留水の 7.5 μ L のボリュームの決勝での高分子量 DNA の ng。</li>
	<li>急な図書館準備キットとミックスから優しくインバージョンによる断片化ミックス (FM) の 2.5 μ L を追加します。スピンダウンするパルス遠心分離機 (1,000 x g 5 s)。</li>
	<li>たちにサンプルを配置 (材料の表を参照してください) 30 ° c 1 分後 75 ° C で 1 分間に 1 回の試料のスピンダウンにチューブとパルスの遠心分離機を削除します。</li>
	<li>急速なアダプターの 1 μ L と鈍/TA リガーゼ マスター ミックスの 0.2 μ L を追加し、氷の上適応と連結ライブラリを格納します。 注: 場合は、手順 8 に進みます短いプロトコルを使用して</li>
</ol>
2. 結紮シーケンス プロトコル (長い): メタゲノム DNA 断片化
注: は、結紮シーケンス キットの材料表を参照してください。
<ol>
	<li>46 μ L の脱イオン水での最終巻に浄化された DNA の 1 μ g を希釈します。</li>
	<li>転送 DNA 断片化するサンプル (材料の表を参照) を管、室温遠心機を使用して 8,000 × g で 1 分間遠心 (材料の表を参照) ~ 8 kb のゲノム断片を生成します。すべての液体のコレクションの管に渡されていることを確認します。</li>
	<li>断片化管、遠心分離機、下院に断片化したゲノム DNA を収集するために 1 分間遠心して戻り値を反転します。</li>
	<li>無菌低 DNA 結合 1.5 mL チューブに断片化したゲノム DNA を転送および分析して断片化を確認する割合が低い agarose のゲル (0.6%) の部分 &#62; 30 kb です。</li>
</ol>
3. 断片化 DNA 終わり準備
<ol>
	<li>800 を使用して 45 μ L の脱イオン水で断片化したゲノム DNA の ng 追加 7 μ L 終わり準備反応バッファー (材料の表を参照)、3 μ L の酵素ミックス (材料の表を参照)、およびヌクレアーゼ フリー水 5 μ。</li>
	<li>反転とパルスの遠心分離機によるミックス (1,000 x g 5 s)。</li>
	<li>0.2 mL 薄肉の管にサンプルを転送し、5 分の 65 ° c で 20 の ° C で 5 分間のサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>パルス遠心管の底に内容をもたらす。</li>
	<li>1.5 mL 低 DNA 結合遠心チューブにサンプルを転送します。</li>
	<li>磁気ビーズ (材料の表を参照) を準備します。ピペッティングで終わり準備反応にステップ 3.5 ミックスからの再懸濁のビーズの 60 μ L を追加します。</li>
	<li>室温で 5 分間 100 rpm (材料の表を参照) で回転ミキサーに孵化させなさい。</li>
	<li>パルスは、磁石の横にサンプルを配置し、ビーズ、ペレットにサンプルを遠心分離機します。</li>
	<li>ビーズは磁石に付着した、かつての上澄みと破棄をピペットします。</li>
	<li>作りたての 70% エタノール 200 μ L で磁石と洗浄のビーズからチューブを削除するには、サンプルの上下を軽くピペッティングします。</li>
	<li>パルス遠心するビーズをペレットし、磁石に戻ります。</li>
	<li>上澄みを除去し、破棄します。200 μ L の 70% のエタノールを使用して洗浄手順を繰り返します。</li>
	<li>パルスは磁石にリターン チューブを遠心し、すべての 70% エタノール洗浄を削除します。</li>
	<li>遠心チューブのふたが開いたら、室温で 5 分間乾燥空気にビーズを許可します。</li>
	<li>磁石からチューブを外し、滅菌、ヌクレアーゼ フリー水の 31 μ L でペレットを中断します。常温で 2 分間インキュベートします。</li>
	<li>すべてのビーズ、ペレット、溶出液がクリアまでチューブを磁石に戻ります。</li>
	<li>溶出液を 1.5 mL 遠心チューブに転送します。260 紫外線分光光度計を使用して端準備中の DNA の定量化 1 μ L のサンプルを使用して nm (材料の表を参照してください)。 注: パーセント回復 〜 70% をする必要があります (700 ng) 1 μ g の DNA の開始の集中から。</li>
</ol>
4. アダプターとテザーに加えて、終了準備のゲノム DNA のフラグメント
<ol>
	<li>反転してすべての鈍/TA リガーゼ マスター ミックス チューブをミックスし、下部に内容をもたらすに遠心分離機をパルスします。</li>
	<li>DNA の端準備中の 30 μ L を使用すると、アダプターのミックスの 20 μ L と鈍/TA 結紮マスター ミックスの 50 μ L を追加します。</li>
	<li>パルスの遠心分離機、反転してミックスし、室温で 10 分間インキュベートします。</li>
</ol>
5. 磁気Bead の準備
<ol>
	<li>渦ビーズと 1.5 mL および microfuge に中断されたビーズの転送 50 μ 管します。</li>
	<li>溶出液をクリアするまでビーズをペレットに磁石にチューブを置きます。</li>
	<li>上澄みを除去し、破棄します。</li>
	<li>ビーズ結合バッファーを 100 μ l 添加ビーズ、ビーズ、再懸濁しますに渦に磁石のビーズをペレット、上澄みを除去し、破棄 (ビーズ キットの材料表を参照してください)。100 μ L の結合バッファーで洗浄を繰り返します。</li>
	<li>洗浄のビーズにビーズ結合バッファーの 100 μ L を追加します。渦にビードを再停止しなさい。</li>
</ol>
6. ライブラリの浄化
<ol>
	<li>P200 ピペットを使用して、適応テザーのゲノム DNA を前の手順からビーズの 40 μ L を追加します。ピペッティングで慎重にこのサンプルをミックスします。</li>
	<li>室温で 5 分間で 100 rpm 回転ミキサーでサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>磁石にサンプルを置き、解決するビーズを許可します。上澄みをピペットおよび破棄します。</li>
	<li>ピペッティングでビーズ結合バッファーの 140 μ L でビーズを再懸濁します。磁石に対してサンプルを置き、上澄みを廃棄ビーズ結合バッファーの 140 μ L 別でもう一度洗います。</li>
	<li>パルスは、チューブを遠心分離機、2 分ペレットから残りのビーズ結合バッファーを削除するため、磁石にチューブを配置します。</li>
</ol>
7. マグネット ビーズからライブラリの溶出
<ol>
	<li>磁気ビーズは、ピペッティングにより 15 μ L の溶出バッファーで再懸濁します。室温で 10 分間のサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>ビーズをペレットに磁石に対してチューブを配置します。</li></ol>ソリューションをクリアしたとき 15 μ L の溶出液と 1.5 の mL および microfuge の管への転送を削除し、氷の上、サンプルを置きます。
	<li>紫外線分光光度計を使用してライブラリを定量化します。 注: パーセント回復必要があります 〜 25% (250 ng) 1 μ g の DNA の開始の集中から。</li>

8. 実行/品質管理を開始
<ol>
	<li>包装からフローセルを取り外し、ポータブル、リアルタイムのシーケンサーにフローセルを取り付けます (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>USB ケーブル経由でコンピューターにシーケンサーを接続し、起動シーケンス ソフトウェア (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>シーケンス ソフトウェアを介してデバイスを「接続」をクリックして、"NC_Platform_QC.py"を選択し、「スタート」をクリックします。</li>
	<li>品質管理 (QC) は完了する約 6-7 分緑の海の見える (出力の領域が大きい) QC 読み出し十分なアクティブな毛穴があることを確認するために (&#62; 800) DNA シークエンシングのため。</li>
</ol>
9. シーケンス実行の開始
<ol>
	<li>シーケンス プログラムを開くダイアログ ボックスが表示されます。[サンプル ID] ボックスで、名前のサンプルを実行します。</li>
	<li>"フロー セル ID"ボックスをクリックし、フロー ・ セルの上にステッカーに記載のコードを入力します。</li>
	<li>フロー電池蓋を開くし、サンプル ポート カバーを右にスライドさせて (時計回りに) してサンプル ポートが表示されます。一度のポートが開いて、小さなバブルをチェックしてください。バブルを含むバッファーの数マイクロリットルを削除します。</li>
	<li>センサー アレイ全体のバッファーがあることを確認します。バッファーを搭載した燃料ミックスの 480 μ L を混合することによってプライミング バッファーを作る (RBF-1、材料の表を参照してください) (ミックス必ず徹底的に最初) 520 μ L ヌクレアーゼ フリー水で。</li>
	<li>プライミング ポートにプライミング バッファーの 800 μ L を追加します。慎重にアクセスできるように「生き残る」カバーを持ち上げます。</li>
	<li>5 分後プライミング ポートにプライミング バッファーの追加 200 μ L を追加します。</li>
</ol>
10. ライブラリの読み込み
<ol>
	<li>ライブラリの場所に氷の上次の試薬を準備する前に: RBF-1 シーケンス キット) (から適応し、ライブラリ、およびライブラリのロードのビーズをつないだ (LLB; シーケンス キットから)。</li>
	<li>0.2 mL の遠心管に RBF の 25.5 μ L と部屋の温度で保たれるヌクレアーゼ フリー水の 12 μ L を追加します。</li>
	<li>上下ピペッティングで LLB をミックスします。0.2 μ L チューブに LLB の 26.5 μ L を追加します。上下ピペッティングによる試薬を混ぜます。 注: LLB は、混合物の解決する傾向があります。</li>
	<li>0.2 μ L 管に適応し、つなぎ縄でつながれた図書館の 11 μ L を追加します。パルス遠心分離によって反転してスピン ミックスします。</li>
	<li>9.4 のステップからの 75 μ L のサンプルを「生き残る」ポートに滴下し追加します。各ドロップは、次を追加する前にポートに流れていることを確認します。</li>
	<li>慎重に、栓が入港できるようにサンプル ポート カバーを取り付けて、デバイスふた。</li>
</ol>
11. シーケンス ソフトウェア プロトコル スクリプトを開始
<ol>
	<li>「プログラムの選択」下のドロップ ダウン メニューを開き、「48 時間シーケンス」を選択</li>
	<li>スクリプトを起動する「実行」ボタンをクリックします。</li>
	<li>MUX をスキャンでアクティブな毛穴の数の通知ストリームで報告Mux のスキャンの結果を確認します。 注: この数は実行 QC で毛穴の数から異なる場合があり、大きな違いは、問題を示すことがあります。<ol>
		<li>ある場合 QC 実行からアクティブな毛穴の大幅な削減はソフトウェアを再起動し、有意な差がある場合は、コンピューターを再起動します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>シーケンス ソフトウェア スクリプトによって報告されるよう、ヒートシンク温度が 34 ° C であることを確認します。 注: 温度は 34 ° C でない場合、あるされません実行十分なアクティブな毛穴です。</li>
	<li>シーケンスの長さが予想されると実験的なデザインの適切なかどうかを判断する読み取りの長さのヒストグラムを確認してください。</li>
	<li>'近くに ' 終了シーケンス ソフトウェア web GUI を閉鎖を使用してデスクトップのエージェントを閉じます。コンピューターからデバイスを取り外します。</li>
</ol>
12. 実行と結果の解析
注: シーケンスの実行中にデータを監視できますデスクトップ エージェントを使用して、「レポートの表示」プログラムを使用しています。中に実行が完了すると、ファイル、ファイル形式でデータ → 読み取り → フォルダー (既定値) を渡す FAST5 で使用できますか。シーケンスがアクティブな間、このフォルダーが開いている場合、コンピューターがフリーズします。
<ol>
	<li>表示し、シーケンスを操作するには、"HDFViewer"をダウンロードします。</li>
	<li>シーケンス ファイルを表示するには、直接開いて HDF ビューアー → オープン データ フォルダー → 選択すべてのファイルの種類 → 選択 c: ドライブ (デフォルト) → 選択 → 選択読み取り → 選択渡す。</li>
	<li>検索して左のドロップ ダウン メニューに FASTQ ファイルを選択ファイルが開き、FASTQ 形式で保存することができます。 注: 学生実験の目的のため、以上 350 ヌクレオチドのシーケンスは、さらに分析に選ばれました。基本の呼び出しからの出力では、サイズに基づいてシーケンス リードを並べ替えできます。ブラスト (NCBI) やその他の生物情報学プログラムを介して FASTQ ファイルを分析できます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+metagenomics+identification+of+viral+pathogens+in+clinical+samples+by+real-time+nanopore+sequencing+analysis.">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99 (2015).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella.">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114 (2015).</li><li>Ashton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+a+bacterial+antibiotic+resistance+island.">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.</a> Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).</li><li>Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+bacterial+genome+assembled+de+novo.+using+only+nanopore+sequencing+data.">A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data.</a> Nat Method. 12, 733-735 (2015).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Outbreak+Tool.">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool.</a> Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).</li><li>Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+for+Microbial+Identification+and+Characterization.">Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization.</a> J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).</li><li>Rothberg, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li><li>Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+discrimination+in+immobilized+DNA+oligonucleotides+with+a+biological+nanopore.">Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.</a> PNAS. 106, 7702-7707 (2009).</li><li>Shendure, J., Hanlee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+DNA+sequencing.">Next generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Metagenomics+of+Soil.">The Metagenomics of Soil.</a> Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).</li></ol>

著者の開示があります。

多くの次世代シーケンシング メソッドが生成されている、合成によるシーケンスに依存する各ヌクレオチドを識別する検出プラットフォームごとに異なります。NS、市場に最近加わったまたは標識ヌクレオチド シーケンス反応を必要としない完全に別の方法を使用します。このメソッドは、電化の細孔を通過するときに既に組み込まれたヌクレオチドの料金差の利点を受け取ります。各ヌクレオチドの同定、ナノポアを通過するとき、異なる拠点で電流の変調と発生します。この多重化システムでは、一度に多くの断片をシーケンス処理することができます。DNA の両方の鎖を配列することによってシーケンスの精度は大幅に向上し、シーケンス ソフトウェアは、ラップトップ コンピューターに読み込むことができます、信号を処理し、分析することができますシーケンス情報を提供します。
パイロシークエンス、合成 (SBS) 法によるシーケンス テンプレートに組み込まれて特定の塩基の検出はルシフェラーゼ アッセイと化学発光シグナル8世代に依存します。イオン半導体シーケンスで pH が減少リリースの水素イオンはイオン センサー9によって検出されます。1 分子リアルタイム ・ シーケンシング機能はゼロ モード波ガイド (ZMW)10、法人のヌクレオチドにタグ付きの蛍光分子を検出の照らすに依存します。SBS では、ユニークなメソッドを使用して、一意のシーケンスのクラスターが生成された13ターゲット DNA を増幅します。タグのヌクレオチドの蛍光が記録されたとき、追加されたヌクレオチドの検知が可能します。NS その一方では、他の方法に比べてユニークな利点それ限られた技術的な資源を必要とするポータブル、長いシーケンスの読み取りを生成、事前の DNA 増幅を必要としない、他の方法と比較して低コストで運営することができます。生徒たちは、新しい、急速なライブラリ準備プロトコルが単純で、3 時間授業を受けやすいを発見しました。私たちの問題のいくつかがのフロー ・ セルで泡を削除することは困難であった、重要なコンピューターの電源 (1 テラバイトのストレージ) が必要なデータの現在の出力は、FAST5 ファイル、シーケンス フロー ・ セルがそれの前に限られた棚の生活低下します。さらに、NS の Ligation のシーケンス プロトコル (長いプロトコル) の他の不利な点はそれいくつかのライブラリの準備手順が必要です、分子生物学の技術の専門知識を必要とする、いくつかと比較してときに減らされたシーケンス再現性を生成します配列方法論3。ただし、新しい急速なライブラリの準備キットの最近の進歩はライブラリの準備のため 10 分のみを必要とし、減らされたシーケンス エラー率を示しています。新しいライブラリの製法だった演習クラスでの使用に非常に従う義務があります。
フロー ・ セルの QC で特にプロトコルでは、いくつかの重要な手順があります。これは初期の QC を実行するフロー ・ セルの受領後 5 日以内、8 週間以内にそれらを使用して含まれています。8 週を超えていたフローセルを使用しているが、オープン/アクティブ毛穴の数は大幅に削減されます。流れ細胞を最大限に活用を実現して、タイムラインに合わせて実験を計画することが重要です。洗浄のプロトコルを使用し、成功を収めてフローセルを再利用しました。
土壌微生物の多様性の未開発の遺伝的貯留層を表すメタゲノムを調査しています。たとえば、土壌 1 グラムが 10 間で含んでいると推定される7 - 109原核細胞14。また、土の有機体、新規天然、酵素や抗生物質の主な情報源です。したがって、土壌メタゲノム DNA シーケンス解析は、教育のすべてのレベルで学生のための貴重な教育ツールを表します。NS の技術の使いやすさと低コストをこのシステムの非常に効果的な教育ツールです。学生が環境試料のシーケンスし、シーケンスの完了時に利用可能なバイオインフォマティクスのツールを使用して識別し、検体中の微生物とメタゲノム シーケンスを特徴付けます。NS テクノロジーを使用して、学生があるまで今のうちに到達している実験室のコースで使用する高度な技術的専門知識と他のシーケンスのプラットフォームで試薬、機器、およびメンテナンスはコスト高のため真の実践的な経験。最近、(j. ハリソン、パーソナル通信) 私達の生徒の一人は農耕地土壌の環境モニタリング プロジェクトでこの技術の使用を報告しました。教育空間のこの技術の多くのアプリケーションがあることを見込んでいます。

この手順の目的は、シーケンス、ナノポア フロー セル シーケンス デバイスの使用率の環境 DNA ライブラリの準備のために必要な手順を示すとシステム ソフトウェアを使用して生成された DNA シーケンスの解析を実行して土壌中の微生物の種を識別するために国立センター生物工学情報 (NCBI) のバイオインフォマティクス ツール。現在、ほとんどの DNA シーケンスのプラットフォーム技術トレーニングとリソース劣悪環境やフィールド アプリケーションで実現されていない複雑な計測に多大な投資が必要です。ナノ細孔シーケンシング (NS) プラットフォームのコスト、これらの問題を排除簡単にライブラリの準備のプロトコル、およびポータブル デバイスを使用してシーケンスおよび様々 な核酸1,3のさまざまな種類を分析します。修士課程の学生のいくつかの実験室のクラスに NS プラットフォームを組み込みました。
シーケンス生体分子のナノ細孔技術は、細菌やウイルスの病原体1,2,6, 環境生物多様性の識別を含む生命科学の広いアプリケーションを示しています。研究、食品の安全性の監視、ゲノム解析3,5、および細菌の抗生物質耐性4の評価。NS が基づいている主義「シーケンスの繊維」は電気の中断を検出することにより個々 のヌクレオチド塩基の配列によって、電化に挿入されたナノポアを通過する単一鎖 DNA シーケンス核酸を高速かつ正確な方法合成高分子膜。NS、ゲノム断片化、最後修理およびゲノム断片、アダプターとテザー アニーリング dna の 3' dA-テーリングのため DNA の準備手順 DNA ライブラリ精製とナノポア流れ携帯デバイスにライブラリを読み込みます。〜 8 kb のサイズにゲノムの断片化を実現するには、g 管断片化管を通してゲノム DNA の 1-2 μ g を遠心分離します。断片化したゲノムの端は修復し、市販のキットを使用してポリ dA と尾を持ちます。ナノポア モータータンパク質と互換性のある、単一の孤立したアダプターのシーケンスが追加されます (図 1) ナノ細孔を介して DNA シーケンスをガイドに使用される DNA の両端に。テザーのシーケンスは、DNA の浄化および細孔膜への DNA の分子をローカライズするために必要。ヘアピンは、dA 尾ライブラリの 1 つの端にヘアピン アダプターを縛ることによって生成されます。DNA の両端にヘアピン構造 (図 2) ナノポアを通過する DNA センスとアンチセンス鎖の読むことができます。準備のゲノム ライブラリーは、ナノポア フローセル分析のためにサンプルをロードすることによってその後磁場を用いたストレプトアビジン ビーズを用いた反応から浄化されます。
シーケンスの DNA が品質評価し、分析に適した配列読み取り微生物を識別するためにいくつかのバイオインフォマティクスのツールを受けます。シーケンスは、FAST5 形式から FASTQ に「翻訳」。FASTQ 形式でシーケンスを高炉解析で使用できます。

<table><tbody><tr><td>Thermal Cycler</td><td>LifeECO</td><td>BTC42096</td><td></td></tr><tr><td>Covaris g-TUBE</td><td>Covaris</td><td>520079</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext End Repair Module</td><td>New England BioLab</td><td>E7546</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>MyOne C1 Strepavidin Beads</td><td>Thermo Fisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Model 5420</td></tr><tr><td>Nanodrop UV spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Model 2000</td></tr><tr><td>Belly Dancer Orbital Shaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z768499</td><td></td></tr><tr><td>Power Soil DNA Isolation Kit</td><td>MO BIO</td><td>12888-50</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Sequencing Kit 2D</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-LSK208</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td></td></tr><tr><td>End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>AmPure XP Magnetic Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Basic Starter Pack&amp;nbsp;</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td></td><td>Includes MinION&amp;nbsp; Sequencing Device and Flow Cell</td></tr><tr><td>MinKNOW software</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td>Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB)</td></tr></tbody></table>

nanopore dna sequencing for metagenomic soil analysis

土壌、調製とナノ細孔のフロー ・ セルの使用およびコンピュータ ・ ソフトウェアを使用して特定の DNA 配列の解析から DNA ライブラリの構築のための手順について説明します。ナノ細孔中の DNA の配列は、細菌やウイルスの種を識別するために急速な微生物ゲノム細菌の緊張の特徴に、抗生物質への耐性を付与する遺伝子の突然変異を検出することができます柔軟な手法です。ナノポア ライフ サイエンス (NS) を配列の利点には、低複雑さ、コストの削減、およびゲノム DNA の精製、PCR 産物、cDNA サンプル、または RNA の迅速なリアルタイム ・ シーケンシング機能があります。NS は、合成高分子系膜に挿入されているナノ細孔を通して単一鎖 DNA の分子を導くことによって DNA シーケンスを含む「鎖シーケンス"の例です。膜を有する個々 の拠点、ナノポアを通過する電流は 4 つのヌクレオチドの塩基によって程度に破壊されるので、それを渡って適用される電流。各ヌクレオチドの同定は、ナノポアを通過するとき、異なる拠点で電流の特徴的な変調を検出することにより発生します。USB 電源ポータブル デバイス、ナノ細孔アレイを含む使い捨てフローセル、NS システムは、ハンドヘルド機の成っています。ポータブル デバイスは読み込み、コンピューターのソフトウェアを使用して DNA のシーケンスを記録する標準的なラップトップ コンピューターに差し込みます。

実験の設計とナノ細孔技術土壌 DNA シーケンス処理する学生のため高速かつ安価な方法を提供します。代表的な実行は、800 以上孔シーケンスに使用可能な品質管理パラメーターを渡されます。5.38 kb の中央値のシーケンスの長さと研究利用可能以上 125,000 の読み取り実行となりました。シーケンスは、品質スコアを与えられているし、許容可能なスコアを持つシーケンスのみを行ったし。シーケンスの出力として反応は FAST5 形式、シーケンスはシーケンスを高炉解析互換性のある FASTQ 形式に変換する HDF ビューアーで表示されたブラスト (NCBI) などのプログラムで受け入れられていないです。将来的にソフトウェアのイテレーション データは HDF ビューアーの必要性を排除 FASTQ 形式として使用できます。参照してください補足数字 1、2、および 3 です。
50 長さ 350 以上のヌクレオチド シーケンスは BLASTN (ヌクレオチド塩基配列データベースに対して) または BLASTX (アミノ酸配列に翻訳のヌクレオチド) による解析の対象となった (NCBI) 土壌試料中の有機体を識別するために。時間を与えられたクラスの制約および実験方法とないバイオインフォマティクスにコースの焦点である、私達はこれらのパラメーター内のシーケンス分析学生があります。私たちの生物情報学のクラスは、パイプライン分析ツールの開発のため、データを使用できます。バイオインフォマティクス解析のこのレベルは、実験室ベースのクラスでは説明しません。表 1より小さい 4 e-04 の e 値と識別された有機体のリストです。通常、4 e-04 未満の e 値は、入力シーケンス (クエリ) と一致したシーケンスの間の強い類似性を示します。(非冗長 (nr) データベース) に対して BLASTN によって識別される生物からさまざまな種があり、さらにゲノム ・ タンパク解析。土壌は、ボルティモア郡、メリーランドの庭から来たのこのサンプルは決して、土壌中に有機体がかもしれないものを決定するための以前のデータがないのでテストされていた。BLASTN (nr データベース) に対して分析分析では、nr データベースでない類似性を持つシーケンスがあったまた示されました。これらは本当に新規シーケンスをあるかどうか、さらなる研究が必要です。BLASTX でいくつかのシーケンス解析は BLASTN 解析で表されていない生物からいくつかのタンパク質を明らかにしました。表 2は、いくつかの可能なタンパク質性エンドペプチグーゼ、Atpase のようなタンパク質などを示します。シーケンスのこのライブラリを使用すると、学生講師が指示された場合は、さらに分析を実行するより高度なバイオインフォマティクスのツールを使用する機会があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
図 1: ゲノム ライブラリー作製。ナノ細孔を用いたシーケンスの genomic DNA ライブラリの準備のための手順を実行します。この図は、必要なアクセス許可が変更されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
図 2.ナノポアを使用して DNA の配列の模式。DNA は電気信号の生成とベースの識別を持つナノ細孔膜を通過します。この図は、必要なアクセス許可が変更されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>生物</td>
			<td>e 値</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>放線菌由来。</td>
			<td>3.00 E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocardoides sp。</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gordonia sp。</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>併せ持つ nitrativorens</td>
			<td>1.00E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starkeya ノヴェッラ</td>
			<td>1.00E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>併せ持つ系</td>
			<td>1.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibomicrobium sp。</td>
			<td>5.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>緑膿菌 sp。</td>
			<td>2.00E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodothemus marinus</td>
			<td>1.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turneiella パルヴァ</td>
			<td>2.00E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>エシェリヒア属大腸菌</td>
			<td>0.00 E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>根粒菌 sp。</td>
			<td>3.00 E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemmatirosa kalamazoonesis</td>
			<td>1.00E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>病菌 sp。</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>スフィンゴモナス sp。</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellumonas sp。</td>
			<td>6.00 E-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: BLASTN 分析の結果を選択します。土壌メタゲノム DNA シーケンス NCBI 非冗長塩基配列データベースに対して BLASTN 類似検索を受けます。報告されたデータは、4 x e-4 以下の e 値を持ちます。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>タンパク質</td>
			<td>生物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>タンパク質</td>
			<td>Acidobacter 菌</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>サム依存メチルトランスフェラーゼ</td>
			<td>H. 系</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atp アーゼ</td>
			<td>Jannaschia sp。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>エンドペプチダーゼ</td>
			<td>赤痢菌体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>溶解タンパク質</td>
			<td>エシェリヒア属大腸菌</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2: BLASTX 分析の結果を選択します。NCBI の重複を除いた蛋白質データベースに対して BLASTX 類似検索を受ける土壌メタゲノムの DNA 配列。
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
補足図 1: プラットフォーム QC 結果します。QC のプラットフォームの結果が掲載されています。右上隅で、アクティブな毛穴の QC の結果です。フロー ・ セルの各象限は、アクティブな毛穴のためテストされます。メインのページは動的であり、各象限のテストを変更します。この実行で 1,414 単一毛穴が検出されました。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
補足図 2: FASTQ ファイルに変換する FAST5 ファイル。ここで、右側にある、シーケンス実行からデータの出力です。それぞれの行は、個々 のシーケンスを表します。図の左側は、シーケンスを詳しく分析するために使える FASTQ ファイルに変換する HDF ビューアーで右サイドから強調表示されているシーケンスを示しています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
補足図 3: HDF ビューアーで例の FASTQ シーケンス。このシーケンス (読み取り 803) は、ヌクレオチドに FAST5 データを変換する FASTQ ファイル。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

シーケンスの生体分子のナノ細孔技術、幅広い病原体、食品安全監視、ゲノム解析、metagenomic 環境の監視、および細菌の特性の識別を含む生命科学で抗生物質耐性。この記事でメタゲノム土壌 DNA 塩基配列ナノ細孔シーケンシング技術を使用して種の同定をする手順について説明します。

ナノポア DNA シーケンス メタゲノム土壌分析用

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

nanopore-dna-sequencing-for-metagenomic-soil-analysis

Research

JoVE Journal

Environment

30.2K ビュー.  Johns Hopkins University. シーケンスの生体分子のナノ細孔技術、幅広い病原体、食品安全監視、ゲノム解析、metagenomic 環境の監視、および細菌の特性の識別を含む生命科学で抗生物質耐性。この記事でメタゲノム土壌 DNA 塩基配列ナノ細孔シーケンシング技術を使用して種の同定をする手順について説明します。

ビデオ: Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

サイレージのメタゲノム解析

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

遺伝学

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

ポータブル リアルタイム PCR を用いた土壌伝染性植物の敷地内の分子の検出

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

環境学

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

実験で多年生の草の根、根、土壌微生物の分離と解析

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and characterize microbial communities in environmental and biological systems. These measurements are even enabling enhanced analyses of complex soil microbial communities, which are the most complex microbial systems known to date. Multi-omic analyses, however, do have sample preparation challenges, since separate extractions are typically needed for each omic study, thereby greatly amplifying the preparation time and amount of sample required. To address this limitation, a 3-in-1 method for the simultaneous extraction of metabolites, proteins, and lipids (MPLEx) from the same soil sample was created by adapting a solvent-based approach. This MPLEx protocol has proven to be both simple and robust for many sample types, even when utilized for limited quantities of complex soil samples. The MPLEx method also greatly enabled the rapid multi-omic measurements needed to gain a better understanding of the members of each microbial community, while evaluating the changes taking place upon biological and environmental perturbations.

A protocol is presented for simultaneously extracting metabolites, proteins, and lipids from a single soil sample, allowing reduced sample preparation times and enabling multi-omic mass spectrometry analyses of samples with limited quantities.

マルチ弔土壌試料の分析のための MPLEx プロトコル

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

化学

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

土壌と堆積物から高分子量のゲノムDNAの抽出

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

生物学

Visualizing Methane-Cycling Microbial Dynamics in Coastal Wetlands

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus playing a critical role in regulating the methane cycle. The wetlands in South Texas, which are subject to frequent weather events, fluctuating salinity levels, and anthropogenic activities due to climate change, influence methane cycling. Despite the ecological importance of these processes, methane cycling in South Texas coastal wetlands remains insufficiently explored. To address this gap, we developed and optimized a method for detecting genes related to methanogens and methanotrophs, including mcrA as a biomarker for methanogens and pmoA1, pmoA2, and mmoX as biomarkers for methanotrophs. Additionally, this study aimed to visualize the spatial and temporal distribution patterns of methanogen and methanotroph abundance utilizing the geographic information system (GIS) software ArcGIS Pro. The integration of these molecular techniques with advanced geospatial visualization provided critical insights into the spatial and temporal distribution of methanogen and methanotroph communities across South Texas wetlands. Thus, the methodology established in this study offers a robust framework for mapping microbial dynamics in wetlands, enhancing our understanding of methane cycling under varying environmental conditions, and supporting broader ecological and environmental change studies.

The protocol detects key methane-cycling genes in South Texas coastal wetlands and visualizes their spatial distribution to enhance understanding of methane regulation and its environmental impacts in these dynamic ecosystems.

沿岸湿地におけるメタン循環微生物動態の可視化

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

全 Genomic DNA 分析のための超長いリード シーケンス

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

生物工学

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

ナノポア DNA シーケンスメタゲノム土壌分析用

要約

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サイレージのメタゲノム解析

探索ルートマイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

ポータブルリアルタイム PCR を用いた土壌伝染性植物の敷地内の分子の検出

実験で多年生の草の根、根、土壌微生物の分離と解析

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

マルチ弔土壌試料の分析のための MPLEx プロトコル

土壌と堆積物から高分子量のゲノムDNAの抽出

沿岸湿地におけるメタン循環微生物動態の可視化

全 Genomic DNA 分析のための超長いリードシーケンス

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

ナノポア DNA シーケンス メタゲノム土壌分析用

要約

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サイレージのメタゲノム解析

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

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実験で多年生の草の根、根、土壌微生物の分離と解析

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マルチ弔土壌試料の分析のための MPLEx プロトコル

土壌と堆積物から高分子量のゲノムDNAの抽出

沿岸湿地におけるメタン循環微生物動態の可視化

全 Genomic DNA 分析のための超長いリード シーケンス

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

ナノポア DNA シーケンスメタゲノム土壌分析用

探索ルートマイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

ポータブルリアルタイム PCR を用いた土壌伝染性植物の敷地内の分子の検出

全 Genomic DNA 分析のための超長いリードシーケンス