Este projeto foi apoio em parte pela Universidade Johns Hopkins, gabinete do reitor através da Gateway ciência iniciativa.

Nota: Metagenomic DNA purified do solo (Condado de Baltimore, Maryland) usando um isolamento genômico solo comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais). Usando um espectrofotômetro UV (veja a Tabela de materiais), o DNA genômico purificado deve ter uma proporção de (nm) 260/280 &#62; 1.8 e um rácio de 260/230 entre 2.0-2.2 para assegurar que a amostra é livre de contaminantes. A quantidade de DNA genômico necessária para NS varia de 200 ng de 2 µ g.
1. método de preparação de biblioteca rápida (protocolo curto)
Nota: Este é um protocolo curto. Consulte Tabela de materiais para o kit de arranjar em sequência rápida.
<ol>
	<li>Em um 0,2 mL tubo de paredes finas (ver Tabela de materiais) adicionar 200 ng de alto peso molecular DNA numa final do volume de 7,5 µ l de água destilada.</li>
	<li>Adicione 2,5 µ l de mistura de fragmentação (FM) do kit de preparação rápida biblioteca e misture gentilmente por inversão. Centrífuga de pulso spin para baixo (1.000 x g durante 5 s).</li>
	<li>Colocar a amostra em um thermocycler (ver Tabela de materiais) para uma rodada em 30 ° C por 1 min, seguido de 75 ° C por 1 min. Retire o tubo e pulso centrifugador girar a amostra.</li>
	<li>Adicione 1 µ l de adaptador rápido e 0,2 µ l de mistura de mestre ligase blunt/TA e em seguida armazenar a biblioteca adaptada e amarrada no gelo. Nota: Se usando o protocolo curto avance para o passo 8</li>
</ol>
2. ligadura sequenciamento (protocolo longo): Fragmentação de DNA Metagenomic
Nota: Consulte Tabela de materiais para o kit de sequenciamento de ligadura.
<ol>
	<li>Dilua 1 µ g de DNA genômico purificado até um volume final de 46 µ l em água desionizada.</li>
	<li>Transferência da amostra a uma fragmentação do ADN do tubo (ver Tabela de materiais) e centrifugar durante 1 minuto na temperatura a 8.000 x g usando microcentrifuga (consulte a Tabela de materiais) para produzir fragmentos genômicos de ~ 8 kb. Certifique-se de que todo o líquido passou para o tubo de coleta.</li>
	<li>Inverta o tubo de fragmentação, retorno à centrífuga e centrifugar por 1 min coletar o DNA genômico fragmentado na câmara baixa.</li>
	<li>Transferir o DNA genômico fragmentado para um tubo de 1,5 mL estéril de baixo-DNA de ligação e analisar uma porção em um gel de agarose de baixo percentual (0,6%) para confirmar a fragmentação para &#62; 30 kb.</li>
</ol>
3. fragmentado fim-preparação de DNA genômico
<ol>
	<li>Usando 800 ng de DNA genômico fragmentado em 45 µ l de água deionizada, adicionar a reação de preparação final 7 µ l (ver Tabela de materiais), mistura de enzima de 3 µ l de buffer (ver Tabela de materiais) e 5 µ l de nuclease água livre.</li>
	<li>Mix por inversão e pulso centrifugador (1.000 x g durante 5 s).</li>
	<li>Transferir a amostra para um tubo de paredes finas de 0,2 mL e incubar a amostra por 5 min a 20 ° C, seguido de incubação a 65 ° C por 5 min.</li>
	<li>Centrífuga de pulso para trazer conteúdo para o fundo do tubo.</li>
	<li>Transferi a amostra para um tubo de microcentrifugadora de ligação de baixa-DNA 1,5 mL.</li>
	<li>Prepare-se grânulos magnéticos (veja a tabela de materiais). Adicione 60 µ l de ressuspensão grânulos para a reação de preparação final da etapa 3.5 e mistura pipetando.</li>
	<li>Incube em um misturador de rotor a 100 rpm (ver Tabela de materiais) por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>O pulso centrifugar a amostra para granular os grânulos e, em seguida, coloque a amostra ao lado do ímã.</li>
	<li>Uma vez que as contas sejam cumpridas ao ímã, pipete sobrenadante e descarte.</li>
	<li>Retire o tubo dos grânulos de ímã e lavagem com 200 µ l de etanol a 70% acabadas pipetando suavemente a amostra de altos e baixos.</li>
	<li>Centrífuga de pulso para granular os grânulos e retornar ao ímã.</li>
	<li>Retire o sobrenadante e descarte. Repita a etapa de lavagem novamente usando 200 µ l de etanol 70%.</li>
	<li>O pulso centrifugar o tubo de retorno para o ímã e remover toda a lavagem de etanol 70%.</li>
	<li>Com a tampa do tubo de microcentrifuga aberto, permitir que os grânulos para o ar seco por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire o tubo do ímã e suspender o sedimento em 31 µ l de água estéril, livre de nuclease. Incube durante 2 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Retorne o tubo ao ímã, até que todas as contas têm peletizado e o eluato é claro.</li>
	<li>Transferi o eluato para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Usando 1 µ l de amostra, quantificar o DNA de final-preparado usando um espectrofotômetro UV a 260 nm (ver Tabela de materiais). Nota: A recuperação por cento deve ser ~ 70% (700 ng) de uma concentração inicial de 1 µ g de DNA genômico.</li>
</ol>
4. adaptador e Tether além de fragmentos de DNA genômico de final-preparado
<ol>
	<li>Misture todos o ligase do blunt/TA mestre mistura tubos por inversão, e então pulse centrífuga para trazer conteúdo para o fundo.</li>
	<li>Usando 30 µ l de DNA final-preparado, adicione 20 µ l do mix de adaptador e 50 µ l de mistura de mestre sem corte/TA da ligadura.</li>
	<li>Misturar por inversão, centrífuga de pulso e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
</ol>
5. magnético Bead preparação
<ol>
	<li>Vórtice os grânulos e então transferência 50 µ l de grânulos suspensos para uma microcentrífuga de 1,5 mL do tubo.</li>
	<li>Coloca o tubo sobre o ímã para granular os grânulos até o eluato limpa.</li>
	<li>Retire o sobrenadante e descarte.</li>
	<li>Adicionar 100 µ l de tampão de ligação do grânulo (consulte Tabela de materiais para kit de) aos talões, vórtice para Ressuspender os grânulos, os grânulos sobre o ímã de Pelotas, remover o sobrenadante e descarte. Repita a lavagem com 100 µ l de tampão de ligação.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de tampão de ligação do grânulo aos talões lavados. Vórtice para Ressuspender os grânulos.</li>
</ol>
6. Biblioteca purificação
<ol>
	<li>Utilizando uma micropipeta P200, adicione 40 µ l de grânulos da etapa anterior para o DNA genômico adaptado/amarrados. Misture a amostra cuidadosamente por pipetagem.</li>
	<li>Incube a amostra em um misturador de rotor a 100 rpm durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Colocar a amostra sobre o ímã e permitir que as contas a acertar. Pipetar fora o sobrenadante e descarte.</li>
	<li>Resuspenda as contas em 140 µ l de tampão de ligação do grânulo pipetando. Colocar a amostra contra o ímã, desprezar o sobrenadante e lavar novamente com outro 140 ml de tampão de ligação do grânulo.</li>
	<li>Pulso, centrifugar o tubo, colocar o tubo sobre o ímã para o buffer de vinculação do grânulo restantes 2 min. Retire a pelota.</li>
</ol>
7. eluição da biblioteca de ímã missanga
<ol>
	<li>Resuspenda as esferas magnéticas em 15 µ l de tampão de eluição por pipetagem. Incube a amostra durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque o tubo contra o ímã para granular os grânulos.</li></ol>Quando a solução limpa, retire 15 µ l de eluato e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e coloque a amostra no gelo.
	<li>Quantificar a biblioteca usando um espectrofotômetro UV. Nota: A recuperação por cento deve ser ~ 25% (250 ng) de uma concentração inicial de 1 µ g de DNA genômico.</li>

8. a partir de um controle de gerência de qualidade
<ol>
	<li>Remova a célula de fluxo da embalagem e anexar a célula de fluxo para o sequencer portátil, em tempo real (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Anexar o sequencer para um computador via cabo USB e inicie o software de sequenciamento (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Clique em "Connect" dispositivo através do software de sequenciamento, selecione "NC_Platform_QC.py" e clique em "Iniciar".</li>
	<li>O controle de qualidade (QC) leva aproximadamente 6-7 min para terminar; Procure por um 'mar verde' (grandes áreas de saída) na leitura do QC para confirmar que não há suficiente poros ativos (&#62; 800) para o sequenciamento de DNA.</li>
</ol>
9. iniciando uma corrida de sequenciamento
<ol>
	<li>Abra o programa de sequenciamento; uma caixa de diálogo será exibida. Na caixa ID de amostra, nome da amostra.</li>
	<li>Clique na caixa "Identificação de célula de fluxo" e digite o código encontrado na etiqueta na parte superior da célula de fluxo.</li>
	<li>Abra a tampa de célula de fluxo e então deslize a tampa de porta de amostra para a direita (sentido horário) para que a porta de amostra é visível. Uma vez que a porta está aberta, verifique por uma pequena bolha. Remova alguns microlitros de buffer incluindo a bolha.</li>
	<li>Verifique se que não há reserva em todo o sistema de radar. Fazer o buffer de escorva misturando 480 µ l de tampão em execução com mistura de combustível (RBF-1, consulte a Tabela de materiais) (certifique-se de misturar primeiro) com água de nuclease livre 520 µ l.</li>
	<li>Adicione 800 µ l de buffer de escorva para o porto de escorva. Levante com cuidado a tampa "SpotOn" para torná-lo acessível.</li>
	<li>Depois de 5 min, adicione um adicionais 200 µ l de tampão de escorva para o porto de escorva.</li>
</ol>
10. carregar a biblioteca
<ol>
	<li>Antes de preparar o local de biblioteca os seguintes reagentes no gelo: RBF-1 (do kit de sequenciamento), adaptado e amarrados a biblioteca e grânulos de carregamento da biblioteca (LLB; do kit de sequenciamento).</li>
	<li>Para um tubo de centrifugação de 0,2 mL, adicione µ l 25.5 da RBF e 12 µ l de água livre de nuclease mantida à temperatura ambiente.</li>
	<li>Misture o LLB pipetando altos e baixos. Adicione 26.5 µ l do LLB ao tubo de 0,2 µ l. Misture os reagentes pipetando altos e baixos. Nota: O LLB tende a resolver fora da mistura.</li>
	<li>Adicione 11 µ l da biblioteca adaptada e amarrada ao tubo de 0,2 µ l. Misturar por inversão e rotação para baixo por centrifugação de pulso.</li>
	<li>Adicione 75 µ l de amostra da etapa 9,4 à porta "SpotOn" gota a gota. Certifique-se de que cada gota flui na porta antes de adicionar a próxima.</li>
	<li>Cuidadosamente Recoloque a tampa de porta de amostra para que a rolha entra no porto e feche a tampa do dispositivo.</li>
</ol>
11. a partir de um roteiro de protocolo de Software de sequenciamento
<ol>
	<li>Abra o menu suspenso sob 'Select Program' e selecione "sequenciamento de 48 horas."</li>
	<li>Clique no botão "Executar" para iniciar o script.</li>
	<li>Verificar os resultados da Mux scan relatado no fluxo de notificação para o número de poros ativos o MUX scan. Nota: Este número pode ser diferente do número de poros em executar o QC e uma diferença grande pode indicar um problema.<ol>
		<li>Se houver uma redução significativa dos poros ativos da execução do QC, reiniciar o software e se ainda há uma diferença significativa, reinicie o computador.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verifique a temperatura do dissipador de calor é 34 ° C conforme relatado pelo script software de sequenciamento. Nota: Se a temperatura está não a 34 ° C e então não haverá bastante ativos poros para a corrida.</li>
	<li>Verifica o histograma de leitura comprimentos para determinar se os comprimentos de sequência são esperados e apropriado para o delineamento experimental.</li>
	<li>Feche o agente desktop usando 'fechar x.' Quit o software de sequenciamento por fechar a web GUI. Desconecte o dispositivo do computador.</li>
</ol>
12. análise da execução e resultados
Nota: Durante a execução de sequenciamento, os dados podem ser monitorados usando o programa "Ver relatório" usando o agente de área de trabalho. Durante ou após a execução completa, arquivos estão disponíveis em um formato de arquivo no → dados lê → passar pasta (padrão) de FAST5. Se esta pasta é aberta enquanto sequenciamento está ativo, o computador pode congelar.
<ol>
	<li>Para exibir e manipular sequências, baixe um "HDFViewer".</li>
	<li>Para exibir os arquivos de sequenciamento, diretamente aberto HDF visualizador → abrir dados pasta → selecionar que todos arquivo tipos → selecione c: unidade (padrão) → Selecione dados → selecione leituras → selecione pass.</li>
	<li>Encontre e selecione o arquivo FASTQ no menu suspenso à esquerda; arquivos serão aberta e podem ser salvos no formato FASTQ. Nota: A experiência do aluno, com a finalidade de sequências de 350 nucleotídeos ou mais foram selecionadas para uma análise mais aprofundada. Saída da chamada base permite ao usuário classificar leituras de sequência com base no tamanho. Arquivos FASTQ podem ser analisados via BLAST (NCBI) ou outros programas de Bioinformática.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+metagenomics+identification+of+viral+pathogens+in+clinical+samples+by+real-time+nanopore+sequencing+analysis.">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99 (2015).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella.">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114 (2015).</li><li>Ashton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+a+bacterial+antibiotic+resistance+island.">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.</a> Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).</li><li>Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+bacterial+genome+assembled+de+novo.+using+only+nanopore+sequencing+data.">A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data.</a> Nat Method. 12, 733-735 (2015).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Outbreak+Tool.">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool.</a> Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).</li><li>Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+for+Microbial+Identification+and+Characterization.">Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization.</a> J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).</li><li>Rothberg, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li><li>Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+discrimination+in+immobilized+DNA+oligonucleotides+with+a+biological+nanopore.">Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.</a> PNAS. 106, 7702-7707 (2009).</li><li>Shendure, J., Hanlee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+DNA+sequencing.">Next generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Metagenomics+of+Soil.">The Metagenomics of Soil.</a> Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).</li></ol>

Os autores têm sem divulgações.

Muitos métodos de sequenciamento de geração seguinte foram gerados e cada um depende de sequenciamento por síntese mas as plataformas de deteção para a identificação de nucleotídeos diferem. NS, a mais recente adição ao mercado, usa um método diferente inteiramente, que não exige uma reação de sequenciamento ou rotulados de nucleotídeos. Este método aproveita-se de diferenciais de carga de nucleotídeos já incorporados como eles passam através de um poro eletrificado. A identificação de cada nucleotídeo ocorre pela modulação da corrente elétrica por diferentes bases como passam através do nanopore. Este sistema multiplexado permite ao usuário sequenciar muitos fragmentos de cada vez. Por sequenciamento ambos os filamentos do DNA, a precisão da sequência é significativamente maior e o software de sequenciamento, o que pode ser carregado em um computador portátil, processa os sinais e fornece as informações de sequência que podem ser analisadas.
Em pyrosequencing, um sequenciamento pelo método de síntese (SBS), deteção da base específica incorporada o modelo varia de acordo com o ensaio do luciferase e a geração de sinais quimioluminescente8. No sequenciamento do semicondutor de íon, o íon de hidrogênio liberado, que diminui o pH é detectado por um sensor de íon9. Sequenciamento em tempo real única molécula depende o zero modo onda guia (ZMW)10, que se acende para a deteção de uma molécula fluorescente etiquetada para o nucleotídeo incorporado. SBS utiliza um método exclusivo para amplificar o DNA alvo tal que clusters de sequências únicas são gerados13. Detecção do nucleotide adicionado é obtida quando a fluorescência do nucleotide etiquetado é gravada. NS por outro lado tem a única vantagem sobre outros métodos em que requer recursos técnicos limitados, é portátil, produz o tempo sequenciamento leituras, requer sem prévia amplificação de DNA e pode ser operado a um custo reduzido em comparação com outros métodos. Nossos alunos encontraram o protocolo de preparação de biblioteca nova, rápida para ser simples e passível de uma classe de laboratório de três horas. Alguns dos problemas que encontramos eram bolhas na célula de fluxo que eram difíceis de remover, é necessário poder significativos do computador (um terabyte de armazenamento), a corrente de saída de dados está em um arquivo de FAST5 e a célula de fluxo de sequenciamento tem uma vida útil limitada antes se deteriora. Além disso, outras desvantagens da ligadura NS sequenciamento (protocolo longo) é que requer várias etapas de preparação de biblioteca, requer conhecimentos em técnicas de biologia molecular e gera fidelidade sequenciamento reduzido quando comparado a alguns metodologias de sequenciamento3. No entanto, recentes avanços com o novo kit de preparação rápida biblioteca requer apenas 10 min para a preparação de biblioteca e demonstrou uma taxa de erro de sequenciamento reduzida. O novo método de preparação de biblioteca foi muito favorável para uso em uma classe de laboratório.
Existem vários passos críticos no protocolo, nomeadamente o QC da célula de fluxo. Isso inclui realizando um QC inicial no prazo de cinco dias a contar da recepção da célula de fluxo e usá-los no prazo de 8 semanas. Embora nós usamos células de fluxo que eram além de 8 semanas, o número de poros aberto/ativo é muito reduzido. É importante que as experiências são planejadas para encaixar uma linha do tempo onde a utilização máxima das células de fluxo é alcançada. Nós temos usado o protocolo de limpeza e reutilizado as células de fluxo com sucesso.
Investigando a metagenômica de representam solo um reservatório genético inexplorado da diversidade microbiana. Por exemplo, um grama de solo é estimado para conter entre 107 - 109 células procarióticas14. Além disso, os organismos do solo são a principal fonte de novos produtos naturais, enzimas e antibióticos. Análise de sequência de DNA do solo metagenomics representa, assim, uma valiosa ferramenta instrucional para estudantes em todos os níveis da educação. A tecnologia NS facilidade de uso e baixo custo fazem deste sistema uma ferramenta muito eficaz de ensino. Os alunos podem de sequência de amostras ambientais e após a conclusão da sequência de usar ferramentas de Bioinformática disponíveis para identificar e caracterizar os micróbios e metagenômica sequências em amostras do teste. Usando a tecnologia NS, os alunos têm a verdadeira experiência hands-on, que tem até agora sido de alcance para utilização em cursos de laboratório por causa da perícia técnica avançada e custos elevados de reagente, equipamentos e manutenção em outras plataformas de sequenciamento. Recentemente, um dos nossos alunos (J. Harrison, comunicação pessoal) relatou o uso desta tecnologia em um projeto de monitoramento ambiental de solos agrícolas. Esperamos que haverá muitas mais aplicações para esta tecnologia na área de educação.

O objetivo deste procedimento é para demonstrar as etapas necessárias para a preparação de uma biblioteca de DNA ambiental para sequenciamento, utilização de um dispositivo de sequenciamento de célula de fluxo nanopore e realizar a análise das sequências DNA geradas usando o software de sistema e Centro Nacional de ferramentas de Bioinformática Biotechnology Information (NCBI) para identificar a espécie microbiana no solo. Atualmente, a maioria das plataformas de sequenciamento de DNA requerem um grande investimento em formação técnica e instrumentação complexa, que não é viável em ambientes pobres de recursos ou em aplicações de campo. A plataforma de sequenciamento (NS) nanopore elimina estas questões com um custo-eficaz, simples de usar protocolo de preparação de biblioteca e um dispositivo portátil para sequenciar e analisar uma variedade de diferentes tipos de ácidos nucleicos1,3. Nós incorporamos a plataforma de NS para várias classes de laboratório para alunos de mestrado.
Nanopore tecnologia de sequenciamento biomoléculas demonstrou aplicações largas nas ciências da vida, incluindo a identificação de patógenos bacterianos e virais1,2,6, biodiversidade ambiental estudos, monitorização da segurança dos alimentos, análise genômica3,5e caracterização da resistência antibiótica bacteriana4. NS é um método rápido e preciso de ácidos nucleicos de sequência que é baseado no princípio da "vertente sequenciamento" detectando perturbações eléctricas de nucleótidos individuais quando solteiro encalhado DNA passa por uma nanopore inserido uma eletrificado membrana de polímero sintético. As etapas envolvidas na preparação de DNA para NS incluem a fragmentação do genoma, reparação final e 3' dA-tailing de fragmentos genômicos, adaptador e baraço recozimento ao DNA, DNA Biblioteca purificação e carregar a biblioteca para o dispositivo de célula de fluxo nanopore. Fragmentação do genoma em tamanhos ~ 8 kb é realizada por 1-2 µ g de DNA genômico através de um tubo de fragmentação g-tubo de centrifugação. As extremidades genomic fragmentadas são reparadas e caudas com dA poli usando um kit disponível comercialmente. Sequências de adaptador único encalhado, que são compatíveis com a proteína de motor nanopore, são adicionadas às extremidades do DNA que são usadas para orientar a sequência de DNA através do nanopore (Figura 1). As sequências de baraço são necessárias para a purificação de DNA e para localizando as moléculas de DNA para a membrana dos poros. O grampo é gerado por ligar um adaptador de gancho para uma extremidade da cauda dA biblioteca. As estruturas de gancho nas extremidades do DNA permite a leitura das fibras sentido e antisentido como o DNA passa a nanopore (Figura 2). A biblioteca genômica preparada é então purificada da reação usando streptavidin grânulos usando um campo magnético, seguido por carregar a amostra dentro da célula de fluxo de nanopore para análise.
O DNA sequenciado é avaliado pela qualidade e leituras de sequenciamento que são aceitáveis para análise são sujeito a várias ferramentas de Bioinformática para identificar os micróbios. As sequências são "convertidas" em um FASTQ de um formato de FAST5. No formato FASTQ, as sequências podem ser usadas na análise de explosão.

<table><tbody><tr><td>Thermal Cycler</td><td>LifeECO</td><td>BTC42096</td><td></td></tr><tr><td>Covaris g-TUBE</td><td>Covaris</td><td>520079</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext End Repair Module</td><td>New England BioLab</td><td>E7546</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>MyOne C1 Strepavidin Beads</td><td>Thermo Fisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Model 5420</td></tr><tr><td>Nanodrop UV spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Model 2000</td></tr><tr><td>Belly Dancer Orbital Shaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z768499</td><td></td></tr><tr><td>Power Soil DNA Isolation Kit</td><td>MO BIO</td><td>12888-50</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Sequencing Kit 2D</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-LSK208</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td></td></tr><tr><td>End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>AmPure XP Magnetic Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Basic Starter Pack&amp;nbsp;</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td></td><td>Includes MinION&amp;nbsp; Sequencing Device and Flow Cell</td></tr><tr><td>MinKNOW software</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td><td>Oxford Nanopore&amp;nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td>Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB)</td></tr></tbody></table>

nanopore dna sequencing for metagenomic soil analysis

Este artigo descreve as etapas para a construção de uma biblioteca de DNA do solo, preparação e uso da célula de fluxo de nanopore e a análise das sequências de DNA identificado usando software de computador. Sequenciamento de DNA de Nanopore é uma técnica flexível que permite o sequenciamento de genoma microbiano rápido identificar espécies bacterianas e virais, para caracterizar as cepas bacterianas e para detectar mutações genéticas que conferem resistência a antibióticos. As vantagens da nanopore (NS) de sequenciamento para Ciências da vida incluem sua baixa complexidade, custo reduzido e rápida em tempo real sequenciamento de DNA genômico purificado, PCR amplicons, amostras de cDNA ou RNA. NS é um exemplo de "sequenciamento da vertente" que envolve o sequenciamento DNA, orientando uma única molécula de DNA encalhada por meio de um nanopore que é inserido em uma membrana de polímero sintético. A membrana tem uma corrente elétrica aplicada através dele, assim como as bases individuais passam a nanopore a corrente elétrica é interrompida em diferentes graus pelos quatro nucleótidos. A identificação de cada nucleotídeo ocorre através da detecção da modulação característica da corrente elétrica por diferentes bases como passam através do nanopore. O sistema de NS consiste de um portátil, USB powered dispositivo portátil e uma célula de fluxo descartáveis que contém uma matriz de nanopore. O dispositivo portátil conecta a um computador portátil padrão que lê e grava a sequência de DNA usando software de computador.

A tecnologia de projeto e nanopore experimental forneceu um método rápido e barato para os alunos a sequência de DNA de solo. A gerência representante passados os parâmetros de controle de qualidade, com mais de 800 poros disponíveis para sequenciamento. A execução resultou em mais de 125.000 leituras disponíveis para estudo com um comprimento de sequência mediana de 5,38 kb. Sequências são dadas a um índice de qualidade e somente aquelas sequências com pontuações aceitáveis foram então analisadas. Como a saída da sequenciação de reação é no formato de FAST5, que não é aceito pelos programas tais como BLAST (NCBI), as sequências foram vistas no Visualizador de HDF, que converte as sequências em formato de FASTQ, que é compatível para análise de explosão. No futuro iterações do software, os dados estarão disponíveis como um formato FASTQ, eliminando a necessidade para o visualizador HDF. Ver complementares figuras 1, 2 e 3.
50 sequências de mais de 350 nucleotídeos de comprimento foram objecto de análise por BLASTN (nucleotídeos no banco de nucleotídeo) ou BLASTX (nucleotídeos traduzidos em sequência de aminoácidos) (NCBI) para identificar os organismos na amostra de solo. Dado o tempo restrições de classe e que o foco do curso é sobre métodos laboratoriais e não de bioinformática, temos os alunos analisar sequências dentro desses parâmetros. Nossas aulas de Bioinformática podem usar os dados para o desenvolvimento de ferramentas de análise de pipeline. Este nível de análise bioinformática não é coberto na classe de laboratório com base. A tabela 1 é uma lista dos organismos que foram identificados com valores de menos de 4 e-04. Em geral, e-valores inferiores a 4 e-04 indicam forte similaridade entre a sequência de entrada (consulta) e a sequência correspondente. Os organismos identificados por BLASTN (contra o banco de dados não-redundante (nr)) são de uma grande variedade de espécies e estão disponíveis para mais genômica e análises de proteína. Esta amostra de solo, que veio de um jardim no Condado de Baltimore, MD nunca havia sido testada, então não havia nenhum dados anteriores de que para determinar o que os organismos podem estar no solo. BLASTN (contra o banco de dados nr) análise também indicou que havia sequências com nenhum semelhanças no banco de nr. Para determinar se estas são verdadeiramente novas sequências, é necessário um estudo mais aprofundado. Análise de várias sequências por BLASTX revelou várias proteínas de organismos não representados na análise BLASTN. A tabela 2 lista várias proteínas possíveis incluindo endopeptidases e ATPase, como proteínas. Usando esta biblioteca de sequências, os alunos têm a oportunidade de usar mais sofisticadas ferramentas de Bioinformática para realizar uma análise mais aprofundada, se dirigido pelo instrutor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
Figura 1 : Preparação da biblioteca genômica. Passos para elaboração de biblioteca de DNA genômica de sequenciamento, usando a tecnologia de nanopore. Esta figura foi modificada com as permissões necessárias. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
Figura 2 . Esquemático de sequenciamento de DNA usando um nanopore. DNA, passando através de uma membrana nanopore com identificação de base e de geração de sinal elétrico. Esta figura foi modificada com as permissões necessárias. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organismo</td>
			<td>valor de e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomyces sp.</td>
			<td>3.00E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocardoides sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gordonia sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium nitrativorens</td>
			<td>1.00E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starkeya novela</td>
			<td>1.00E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium denitrificans</td>
			<td>1.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibomicrobium sp.</td>
			<td>5.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas sp.</td>
			<td>2.00E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodothemus marinus</td>
			<td>1.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turneiella parva</td>
			<td>2.00E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>0.00E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradyrhizobium sp.</td>
			<td>3.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemmatirosa kalamazoonesis</td>
			<td>1.00E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burkholderia sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomonas sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellumonas sp.</td>
			<td>6.00E-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: selecionados os resultados da análise BLASTN. Sequências de DNA de metagenômica de solo submetidas a pesquisa de similaridade BLASTN contra o banco de dados do NCBI nucleotídeo não-redundante. Os dados relatados possuem valores e de 4 x e-4 ou menos.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Proteína</td>
			<td>Organismo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteína hipotética</td>
			<td>Acidobacter bactéria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metiltransferase dependente de SAM</td>
			<td>H. denitrificans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPase</td>
			<td>Jannaschia sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endopeptidase</td>
			<td>Shigella sonnei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteína de Lise</td>
			<td>Escherichia coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: selecionados os resultados de análise BLASTX. Sequências de DNA de metagenômica de solo submetidas a pesquisa de similaridade BLASTX contra o banco de dados do NCBI proteína não-redundante.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
Suplementar Figura 1: resultados da plataforma QC. São apresentados os resultados da plataforma do QC. No canto superior direito estão os resultados do QC para poros ativos. Cada quadrante da célula de fluxo é testado para poros ativos. A página principal é dinâmica e muda conforme cada quadrante é testado. Este prazo, 1.414 poros único foram detectados.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
Suplementar Figura 2: FAST5 convertendo arquivos para arquivos FASTQ. Aqui do lado direito, é a saída dos dados da corrida sequenciamento. Cada linha representa uma sequência de individual. O lado esquerdo da figura mostra a sequência de destaque do lado direito, no Visualizador de HDF que converte a sequência de um arquivo FASTQ que pode ser usado para uma análise mais aprofundada. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
Suplementar Figura 3: sequência de exemplo de FASTQ no Visualizador de HDF. Esta sequência (leitura 803) está em um arquivo FASTQ que converte os dados de FAST5 em nucleotídeos. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis at JoVE.com

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Nanopore tecnologia de sequenciamento biomoléculas tem amplas aplicações nas ciências da vida, incluindo a identificação de patógenos, monitorização da segurança dos alimentos, análise genômica, monitoramento ambiental metagenomic e caracterização de bactérias resistência aos antibióticos. Neste artigo, o processo de sequenciamento de DNA de solo metagenomic para identificação de espécies, usando a tecnologia de sequenciamento de nanopore é demonstrado.

Sequenciamento de DNA Nanopore para análise de solo Metagenomic

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

nanopore-dna-sequencing-for-metagenomic-soil-analysis

Research

JoVE Journal

Environment

30.2K visualizações.  Johns Hopkins University. Nanopore tecnologia de sequenciamento biomoléculas tem amplas aplicações nas ciências da vida, incluindo a identificação de patógenos, monitorização da segurança dos alimentos, análise genômica, monitoramento ambiental metagenomic e caracterização de bactérias resistência aos antibióticos. Neste artigo, o processo de sequenciamento de DNA de solo metagenomic para identificação de espécies, usando a tecnologia de sequenciamento de nanopore é demonstrad...

Vídeo: Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Análise metagenômica de Silagem

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Genética

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

Deteção Molecular no local de Phytopathogens solo-carregadas usando um sistema portátil de PCR em tempo real

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Ambiente

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Isolamento e análise de comunidades microbianas na rizosfera, solo e raízes em experiências de grama perene

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenciamento de mRNA de sangue total usando sequenciamento de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and characterize microbial communities in environmental and biological systems. These measurements are even enabling enhanced analyses of complex soil microbial communities, which are the most complex microbial systems known to date. Multi-omic analyses, however, do have sample preparation challenges, since separate extractions are typically needed for each omic study, thereby greatly amplifying the preparation time and amount of sample required. To address this limitation, a 3-in-1 method for the simultaneous extraction of metabolites, proteins, and lipids (MPLEx) from the same soil sample was created by adapting a solvent-based approach. This MPLEx protocol has proven to be both simple and robust for many sample types, even when utilized for limited quantities of complex soil samples. The MPLEx method also greatly enabled the rapid multi-omic measurements needed to gain a better understanding of the members of each microbial community, while evaluating the changes taking place upon biological and environmental perturbations.

A protocol is presented for simultaneously extracting metabolites, proteins, and lipids from a single soil sample, allowing reduced sample preparation times and enabling multi-omic mass spectrometry analyses of samples with limited quantities.

O protocolo de mplexas para Multi-omic análises de amostras de solo

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

Química

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Biologia

Visualizing Methane-Cycling Microbial Dynamics in Coastal Wetlands

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus playing a critical role in regulating the methane cycle. The wetlands in South Texas, which are subject to frequent weather events, fluctuating salinity levels, and anthropogenic activities due to climate change, influence methane cycling. Despite the ecological importance of these processes, methane cycling in South Texas coastal wetlands remains insufficiently explored. To address this gap, we developed and optimized a method for detecting genes related to methanogens and methanotrophs, including mcrA as a biomarker for methanogens and pmoA1, pmoA2, and mmoX as biomarkers for methanotrophs. Additionally, this study aimed to visualize the spatial and temporal distribution patterns of methanogen and methanotroph abundance utilizing the geographic information system (GIS) software ArcGIS Pro. The integration of these molecular techniques with advanced geospatial visualization provided critical insights into the spatial and temporal distribution of methanogen and methanotroph communities across South Texas wetlands. Thus, the methodology established in this study offers a robust framework for mapping microbial dynamics in wetlands, enhancing our understanding of methane cycling under varying environmental conditions, and supporting broader ecological and environmental change studies.

The protocol detects key methane-cycling genes in South Texas coastal wetlands and visualizes their spatial distribution to enhance understanding of methane regulation and its environmental impacts in these dynamic ecosystems.

Visualizando a dinâmica microbiana do ciclo de metano em zonas úmidas costeiras

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

Sequenciamento de leitura ultralonga para análise de DNA genômico completo

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Bioengenharia

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.