רצף nanopore מהדור השלישי הוא טכנולוגיית ריצוף חדשנית רבת עוצמה המאפשרת להשיג בקלות רבה מידע רצף ממגוון רחב של דגימות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הניידות של התקן רצף, אורך קריאה ארוך מאוד, ואת הזמינות בזמן אמת של נתונים. רצף Nanopore היא טכנולוגיה מועילה במיוחד במהלך התפרצויות מחלות במקומות מרוחקים.
הוא שימש בהצלחה במעבדות שדה במהלך ואחרי התפרצויות נגיף האבולה במערב ובמרכז אפריקה. באמצעות רצף nanospore והשימוש במכשיר MinION למטרה זו הוא די קל, יש לדאוג במהלך הכנת הספרייה ובמהלך טעינת תאי זרימה. כדי להתחיל בהליך זה, הגדר PCR טאצ'דאון כדי להגביר את cDNA עם ערכת פריימר אחד באמצעות פולימראז DNA באיכות גבוהה התחלה חמה עם מאגר התגובה המתאים בנפח תגובה 50 microliter עם תבנית מיקרוליטר אחת.
במידת האפשר, להגדיר את התגובה על קרח או בבלוק קריר בארבע מעלות צלזיוס. הדגירה את התגובה בתרמוציקלר כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להעביר 50 microliters של המוצר PCR לתוך צינור תגובה 1.5 מיליליטר DNA נמוך מחייב.
תן מחדש את חרוזים מגנטיים ביסודיות על ידי מערבולת. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של חרוזים לתגובת ה-PCR וערבבו היטב. הדגירה את המדגם על מערבל מסתובב במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר תוך סיבוב ב 15 סל"ד.
בקצרה לסובב את המדגם ולאחר מכן למקם את הצינור על מתלה מגנטי כדי גלולה חרוזים מגנטיים. המתן עד שהעל-טבעי יובהר לחלוטין לפני שתמשיך. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור חרוזים והשליך אותו.
פיפטה 200 מיקרוליטרים של 70% אתנול לתוך צינור התגובה ודגירה במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. שאף את האתנול מבלי להפריע לכדור חרוז והשליך אותו. חזור על תהליך כביסה זה עם אתנול פעם נוספת עבור סך של שתי שטיפות.
אוויר לייבש את גלולה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. ואז להסיר את צינור התגובה מן המדף המגנטי. יש להנמיך מחדש את גלולת הכדור ב-30 מיקרוליטרים של מים חופשיים מגרעין ותדוג בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות.
מניחים את צינור התגובה בחזרה על המדף המגנטי ומחכים עד בחנוזי התגובה הם גלולות לחלוטין. לאחר מכן, להסיר את supernatant מבלי להפריע גלולה ולהעביר צינור תגובה חדש 1.5 מיליליטר. אם יש לרצף מספר דגימות בו-זמנית, כעת ניתן להוסיף ברקודים על-ידי שני שלבי PCR נוספים ולאחריהם ניקוי דנ"א כפי שהוצג קודם לכן.
ראשית, לשלב כמות שווה של DNA מקודד מכל דגימה עבור סך של מיקרוגרם אחד של DNA בנפח של 45 microliters בצינור תגובה 0.2 מיליליטר. עבור dA-Tailing, להוסיף שבעה microliters של חיץ תגובת הכנה קצה, שלושה microliters של תערובת אנזים הכנה סוף, וחמישה microliters של מים ללא גרעין. בעדינות להעיף את הצינור כדי לערבב.
בתרמוצ'ילי, הדגירה את התגובה במשך חמש דקות ב 20 מעלות צלזיוס ואחריו חמש דקות ב 65 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בצע טיהור PCR של מוצר התגובה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. באופן אופציונלי, יש ליטול מיקרוליטר אחד כדי לכמת את ריכוז הדגימה באמצעות ספקטרופוטומטר UV.
שלב 22.5 מיקרוליטרים של הדנ"א המטוהר שהושג בעבר עם 2.5 מיקרוליטר של מתאם 1D2 ו-25 מיקרוליטרים של בלאנט/ת"א Ligase Master Mix בצינור תגובה חדש של 1.5 מיליליטר DNA נמוך. בעדינות להעיף את הצינור כדי לערבב. בקצרה לסובב את התערובת דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
לאחר מכן בצע טיהור PCR של מוצר התגובה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שלבו 45 מיקרוליטרים של מוצר התגובה עם חמישה מיקרוליטרים של תערובת מתאמי ברקוד ו-50 מיקרוליטרים של Blunt/TA Ligase Master Mix בצינור תגובה מחייב נמוך של DNA. מצליפים בעדינות כדי לערבב ותדרגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לטהר את מוצר התגובה כמתואר בפרוטוקול הטקסט ולאחסן את המוצר וכתוצאה מכך על קרח או בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. כדי להתחיל, בצע בדיקת איכות בתא הזרימה לפני השימוש. לשם כך, חבר את התקן רצף למחשב המארח ולפתוח את התוכנה.
הכנס תא זרימה להתקן רצף. לאחר מכן בחר את סוג תא הזרימה מתיבת הבוחר ולחץ על זמין לאישור. בתחתית המסך, לחץ על בדוק תא זרימה ובחר את סוג תא הזרימה הנכון.
לחץ על התחל בדיקה כדי להתחיל בבדיקה האיכותית. נדרש מינימום של 800 ננו-פוטמים פעילים בסך הכל כדי שתא הזרימה יהיה שמיש. ראשית, פתח את כיסוי היציאה על-ידי החלקתו בכיוון השעון.
הגדר פיפטה P1000 ל 200 microliters ולהכניס את הקצה לתוך היציאה priming. לאחר מכן להתאים את פיפטה ל 230 microliters תוך שמירה על הקצה בנמל priming לצייר עד 20 עד 30 microliters של חיץ ולהסיר את כל בועות האוויר. בצינור תגובה חדש של 1.5 מיליליטר DNA נמוך מחייב, הכן את תערובת הפרימינג על ידי שילוב של 576 מיקרוליטרים של חיץ RBF עם 624 מיקרוליטרים של מים חופשיים נוקלאאז.
בזהירות pipette 800 microliters של תערובת priming מוכן לתוך הנמל priming ולחכות חמש דקות. לאחר מכן, הרם את כיסוי היציאה לדוגמה ואת פיפטה 200 מיקרוליטרים נוספים של תערובת priming מוכן לתוך הנמל priming. פיפטה 35 microliters של מאגר RBF לתוך חדש נקי 1.5 מיליליטר DNA צינור תגובה מחייב נמוך.
מערבבים היטב קדילי LLB על ידי צינורות ומוסיפים 25.5 מיקרוליטרים של חרוזים למאגר RBF. לאחר מכן, הוסיפו 2.5 מיקרוליטרים של מים נטולי גרעין ו-12 מיקרוליטרים של ספריית דנ"א וערבבו על ידי צינורות. הוסף 75 microliters של תערובת מדגם בצורה איטית טיפה חכם לתא הזרימה דרך יציאת המדגם.
לאחר מכן החלף את מכסה היציאה לדוגמה, סגור את היציאה המהותית וסגור את המכסה של התקן רצף. בתוך התוכנה, ודא שתא הזרימה עדיין זמין. פתח ניסוי חדש והגדר את פרמטרי הריצה על-ידי בחירת הערכה בה נעשה שימוש.
בחר שיחות בסיס חיות. התחל את רצף הריצוף על-ידי לחיצה על התחל ניסוי. המשך את רצף הריצוף עד לאיסוף מספיק נתונים ניסיוניים.
בניסוי מייצג, ה-RNA מופק מ-10 דגימות דם שונות מחמישה מינים של בעלי חיים. ריכוזי RNA נצפו בין 43 ננוגרם ו 543 ננוגרם למיקרוליטר. לאחר הגברה על ידי RT-PCR, ניתוח ג'ל של מוצרי PCR MPC1 מראה תוצאות שונות עם להקות חלשות משמעותית עבור דגימות BC01 ו- BC02.
הבדלים אלה נגרמים ככל הנראה על ידי הבדלים באיכות המדגם למרות הבדלים ביעילות PCR עקב הבדלים מחייב פריימר לגן MCP1 של מינים שונים לא ניתן לשלול. עם זאת, הבדלים אלה בתפוקה ו/או ביעילות הגברה אינם משפיעים במידה ניכרת על תוצאת רצף כוללת. קבוצת משנה של 10, 000 קריאות שהתקבלו נבחרה לאחר מכן ו demultiplexed לניתוח נוסף.
מתוך 10, 000 קריאות שנותחו, 5, 457 מראות אורך בין 1, 750 ל -2, 000 נוקלאוטידים התואמים את הגדלים הצפויים עבור שברי PCR המוגברים כחלק זרימת העבודה שלנו. שיא נוסף בהפצת אורך של קריאות נצפתה בין 250 ל 500 נוקלאוטידים אשר ניתן לייחס מוצרי PCR ספציפיים. Demultiplexing של קריאות לאפשר את המשימה של 87.6% של קריאות לאחת 10 דגימות נותחו.
בעוד שיטה זו היא אמינה למדי, בתנאי שדה, הגברה PCR הוא הצעד הבעייתי ביותר. במהלך החוויות שלנו, פרוטוקולים מקוננים היו נחוצים לעתים קרובות כדי להגביר את רצפי היעד. מלבד רצף גנים מארחים בעלי חיים, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי רצף כל DNA או RNA כולל פתוגנים ויראליים או חיידקיים.
רצף Nanopore ולכן משמש כעת יותר ויותר לא רק במהלך התפרצויות מחלות או למחקרים מדעיים במקומות מרוחקים, אלא גם במעבדות רגילות שבהן אורכי הקריאה הארוכים פותחים אפשרויות מחקר חדשות ומלהיבות. בעוד אף אחד מהריגטים המשמשים אינם מסוכנים במיוחד, יש לעקוב אחר נוהלי מעבדה סטנדרטיים וטובים. ברור שכאשר רצף סוכני מחלות, יש לשמור על כל אמצעי הזהירות הדרושים לטיפול בסוכנים אלה.
