המחברים רוצים להכיר בירגיט ד&quot;ר ורנר על עזרתה בהפקת עם המאמר הזה וידאו. מחקר זה מומן על ידי פרס קריירה NSF.

חלק 1: הכנת ניסויית הפרוצדורות שבוצעו על סרטני הפרסה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש באוניברסיטת בוסטון. בעלי חיים שנקנו מעבדות לביולוגיה ימית (וודס הול, מסצ&#39;וסטס) או ספק אחר ושוכנו טנק מים מלוחים סודה בחדר חשוף מחזור אור כהה מוסדר. משטר תאורה חשוב entraining שעון היממה של סרטן ורכיבה על אופניים העין יומי בין מדינות יום ולילה שלה. מיד לפני תחילת כל הליכים פולשניים, החיה הוא מקורר בדלי קרח במשך 10-15 דקות, עד תנועה שלה היא האטה מאובטח אז אל במת עץ עם שני ברגים נירוסטה הוכנס prosoma ושניים opisthosoma. הפלטפורמה היא משוקלל מתחת עם גרניט, כך שוקע במים. לאחר ניסויים בבעלי חיים הוא מסוף מורדמים ידי טבילה לתוך slurry קרח שוב pithing המוח, הנמצאת מעל הפה, באמצעות אזמל מנתחים. חלק 2: פתרונות פתרון Limulus רינגר מורכב 430 mM NaCl, 9.56 mM KCl, 9.52 mM CaCl2, 9.97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50μM TES, HEPES 50μM, ו 10 מ&quot;ל / L עט סטרפטוקוקוס לערבב (פניצילין, סטרפטומיצין, 10,000 יחידות / מ&quot;ל) . חלק 3: הקלטה Electroretinogram כלים הדרושים הליך זה כולל מברג, וזלין, הפתרון של רינגר, פיפטה העברה, הנורית הירוקה, חדר הקלטה, ברגים נירוסטה, ו ספוגית כותנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא בעבודת יד משמש כדי להקליט את ERG (איור 1A). גוף תא נועד להחזיק מאגר מלוחים במגע עם העין. המכסה מכיל חוט כסף כלורי עבור צימוד הפתרון מוליך למגבר ואת חור קטן בגודל כדי להתאים LED. Ultrabright LED עם פליטת שיא סביב 520nm עובד הכי טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל, החלק התחתון של החדר מצופה וזלין ומאובטחת על העין עם שני ברגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדר מתמלא אז עם מליחים כתרים עם המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתקשרות לתא סרטן ממוקם בכלוב אור חזק בתוך טנק מלא במי ים על פני הזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבל ה-LED מוכנס לתוך המכסה קאמרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוביל אות הוא מוצמד חוט כלוריד, ואת להוביל התייחסות נחתך לאחד הברגים המושתלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוביל הן מחוברות לבמה ראש מגבר גבוהה עכבה ההפרש (X-cell 3x4, fhc Inc) עבור הגברה האות המסנן מגבר מוגדר להעביר תדרים 10Hz להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפלט מגבר מוזן על אוסצילוסקופ לצפייה ללוח נתונים הרכישה לניתוח המחשב ואחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתקנה דלת הכלוב סגורה כדי לחסום אור בחדר מלהגיע בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים נאספים עם תוכנית אישית כתובה LabVIEW. התוכנית גלי ה-LED, הרשומות עורר ERG האות, מודדת את המשרעת שיא אל שיא התגובה. הבחירה הפרדיגמה פלאש תלוי אובייקטיבי הניסוי. כך, למשל, להחיל קצרה (100ms) הדופק של 5V כל 10 דקות אל LED ימנע תופעות של הסתגלות אור כאשר ניטור שינויים היממה ברגישות העין. </li></ol> חלק 4: הקלטה עצב הראייה כלים הדרושים הליך זה כולל מברג, חוט, מקדחה, הפתרון של רינגר, rongeurs, מספריים vannas, חדר הקלטה, מלקחיים מעוקל, בדיקות מחט בסדר, עמום אזמל, מספריים כירורגיות, ו אלקטרודה יניקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא בעבודת יד משמש שיא התגובות עצב הראייה (איור 1B). פנים החדר הוא 2cm בקוטר היטב כי יש לפתוח פתח דק מחוררת חצי עגול בקיר התחתון כדי להכיל את העצב ולבודד אותו לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההתקשרות קאמרית מחט 16-מד מוכנס בין השרירים הציר לתוך הלב ~ 20cc של דם מנוקז מן החיה. Exsanguination לא הכרחי אבל עושה דיסקציה עצב הראייה קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המיקום של עצב הראייה נאמדת על ידי ציור על שריון קו מעוקל מעט בין העיניים לרוחב חציון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חור עגול הוא חתך אז שריון עם מקדחה. החור הוא בקוטר זהה החדר היטב. המרכז של החור ממוקם 2-3 ס&quot;מ הקדמי לעין לרוחב הגב מעט לקו, כך עצב העובר לאורך החלק הגחוני של הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת חיבור מנוקה עד עצב גלוי לגמרי וללא שמסביב הבסיסית רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדיל של חוט הוא כרך סביב העצב ומשך החדרה דרך חריץ בתחתית. דרך פתח זה אותו עצב מונחה בעדינות על ידי משיכת החוט אל תוך החדר. במקביל החדר היטב מוכנס לתוך החור. החדר היא מודבקת אז שריוןעם ברגים היטב מתמלא הפתרון של רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתקשרות לתא החי ממוקמת בתוך כלוב אור חזק בתוך טנק מלא במי ים על פני הזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם היא דמיינו תחת stereoscope (SMZ-168, ג&#39;ד פלה Inc) וכותנה הוא מרופד סביב פתח בתחתית כדי למנוע דליפה של דם לתוך מלוחים מתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת חיבור שיורית סביב העצב יוסר עם מספריים פינצטה בסדר, הוא מילא את החדר עם פתרון Ringer של טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינוי מורכב מכלי הדם כי מתמצת את העצבים דרך הפתח הזה העצב הוא desheathed בקפידה לאורכו בעזרת מספריים בסדר, פינצטה, ועל בדיקות מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרור סיבים זעירים מופרד מן העצב באמצעות בדיקה לחתוך בקצה הרחוק מן העין הקלטה סיב מביא ובסוף הקרוב לעין הקלטה סיבים efferent. בסרטון בסוף להקלטות סיב מביא נחתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודה מיקרו (AM Systems Inc) מלא פתרון האצבעות משמש להקלטת עצב הראייה. קצה האלקטרודה הוא מצויד צרור העצבים מאש ליטוש סוף זכוכית בקוטר 1mm בורוסיליקט נימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצה האלקטרודה יורדת לתוך תא היטב עם מניפולטור ידני (WPI Inc), ואת חבילת סיבי לחתוך הוא נשאב לתוך קצה. יניקה מסופק על ידי מזרק Gilmont מחובר האלקטרודה דרך צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור BNC מספק את האות להוביל כלוריד כסף תיל סביב אלקטרודה כדי להפחית את הרעש מספק להוביל התייחסות. שני מוביל מחוברים שלב ראש מגבר ההפרש עבור הגברה אות ורעש סינון (X-cell 3x4, fhc Inc). הפלט מגבר נשלח אוסצילוסקופ לצפייה כרטיס רכישת נתונים לניתוח המחשב ואחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים נאספים עם תוכנית אישית כתובה LabVIEW. התוכנית שולטת גירויים אור דרך מעבד וידאו דיגיטלי (Bits + +, קיימברידג&#39; למחקר Systems Inc) וממשקים עם ספייק דיגיטלי מאבחן (APM, fhc Inc) כי רשומות רכבות ספייק. אור יכול להיות מועברת על תאים בודדים בעין באמצעות צינור אור בסיבים אופטיים או לעין כל דרך להציג מבוקרת מחשב וידאו. </li></ol> חלק 5: הקלטה Intraretinal כלים הדרושים הליך זה כולל מברג, בצורת פלטפורמה פייברגלס עם חורי הברגים הליכי, בעל microelectrode עם פיפטה זכוכית, ברגים נירוסטה, פינצטה, ו אזמל בסדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת עבודת יד פייברגלס עם חורי הברגים מראש משמש שיא התגובות תאיים. החורים הם במרווחים עבור הרכבה micromanipulator ממונע (PPM5000, Inc WPI). הצלחת מחוברת החיה עם שני ברגים בצד אחד על גבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלחת קובץ מצורף החיה ממוקם בכלוב אור חזק בתוך טנק מלא במי ים על פני הזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropositioner הוא מוברג לתוך הצלחת, עם זרוע מטלטלין שלה מיושר מעל העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אצווה של micropipettes זכוכית נמשכים מ -1 מ&quot;מ OD בורוסיליקט זכוכית את הטיפים הם backfilled דרך פעולה נימי ידי הנחת micropipettes בבקבוקון קטן של פתרון KCl 3M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאר pipettes מתמלאים באופן ידני את הפתרון מלח ונוסף בעל אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעל אלקטרודה מחוברת בשלב ראש מגבר תאיים (IR-283, Cygnus טכנולוגיה Inc) מודבקת הזרוע micropositioner. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטע קטן של הרשתית (~ 1mm2) נחשף על ידי חיתוך משם את ממשק הקרנית עם סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה של הפתרון של רינגר מושם על הרשתית חשוף כדי למנוע ייבוש קצה micropipette מתקדמת דרך הפתח לתוך רקמת הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קצה נכנס הפתרון, במצב הנוכחי הזרקה של המגבר תאיים עוסקת ואת עכבה אלקטרודה נמדד. Micropipettes עם עכבה מחוץ לטווח של 20-70 מגוואט מבוטלים. אלה בטווח זה הם מתקדמים בצעדים מיקרון משופדת לתוך התאים על ידי רוטט קצה פיפטה אלקטרונית או מכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה סוגים של תאים עשויים להיות נתקל בעיניים. תאים Retinular להציג רק תגובה depolarizing לאור, תאים אקסצנטרי להראות רכבת של פוטנציאל פעולה רכיבה על תגובה depolarizing, ותאי הפיגמנט להראות אין תגובה אור בכלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים נאספים עם תוכנית אישית כתובה LabVIEW. התוכנית שולטת גירויים אור דרך מעבד וידאו דיגיטלי (Bits + +, קיימברידג&#39; מערכות מחקר). הגירויים מועברים לתאי משופדת עם צינור סיב אופטי או להציג וידאו. התגובות מתח הם נצפו על אוסצילוסקופ ואת דיגיטציה על ידי התוכנית למחשב. </li></ol> חלק 6: תוצאות נציג ERG נציג מוצג בתרשים 2A. הגל מייצג את החשמל סיכםבתגובה לאור בעיקר בתאי retinular photoreceptive, כפי שהם עולים במספרם בהרבה על התאים אקסצנטרית הם מצמידים חשמלית להם. אין רכיבים waveform מרובים סוגי תאים שונים ברשתית כמו עם ERG יונקים. משוב מן היממה שעון במוח Limulus מודולציה את המאפיינים הפיזיולוגיים של תאים ברשתית על בסיס יומי, גורם כמובן משרעת וזמן של ERG להשתנות לאורך זמן (1). כפי שניתן לראות בתרשים 2B, ERG המשרעת היא הגבוהה ביותר במהלך הלילה הסובייקטיבית של בעלי החיים הנמוכה ביותר במהלך היום סובייקטיבי. עקבות נציג תגובה עצב יחיד סיבים אופטיים לאור מוצג באיור 3. תאים אקסצנטרי כל להתנהג בערך אותו הדבר, מראה עלייה חולף בשיעור הפרשות ספייק ואחריו דעיכה לרמה מתמשכת. קצב הדעיכה משקפת את הפעולה המשולבת של הסתגלות אור ספייק תלויי עצמית עיכוב על תאים אקסצנטרי (2). אחר דפוסי ספייק, כגון אור תלויי יורדת בשיעור, נתפסים במוח Limulus אך לא את העין (3). עקבות נציג התגובה מתח של תא תא פיגמנט, תא retinular ו אקסצנטרי לאור מוצגים באיור 4. רק שני האחרונים סוגי תאים ברשתית הם חזותיים. הקורס משרעת וזמן התגובה שלהם תלוי באיכות ההקלטה ואת מיקום האלקטרודה בתוך התא. בדרך כלל, האלקטרודה חודר לתאי פיגמנט או תאים retinular בגלל גודל גדול שלהם מספר. אם זה האחרון, שלילת קוטביות חולף כי דועך לרמה מתמשכת מוקלט. עששת היא בשל הסתגלות לאור על ידי תאים retinular (2). אם האלקטרודה נכנס לתא אקסצנטרי, פוטנציאל פעולה גדול נרשמים האקסון (40-70mV) פוטנציאל פעולה קטן רוכב על הגל depolarizing (&lt;25mV) ליד סומה. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="דמות 1" /> באיור 1. דיאגרמות סכמטי של תאים המשמשים הקלטה electroretinogram (א) ו הקלטה עצב הראייה (B). בר שווה 7mm ב A ו B. ב 5mm <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="דמות 2" /> איור 2. עקבות דוגמה ERG Limulus שעורר 100ms LED הדופק של 5V בחושך (א) ואת תנודות שיא אל שיא ERG אמפליטודה לאורך זמן בחשכה מתמדת (B). החושך היה יזם בזמן המצוין על ידי המשולש הלבן. הגידול ERG משרעת בזמן המצוין על ידי המשולש השחור בשל הסתגלות אור, אשר מגדילה את רגישות העין בחושך. וריאציה מחזוריים ERG משרעת לאחר מכן בשל השעון הביולוגי הפנימי של בעלי חיים. נקודות זמן ב &#39;הם כל 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="דמות 3" /> איור 3. עקבות דוגמה תגובה עצב סיב אופטי אל האור הבזיק על הקולטן ommatidial יחיד. Waveform מעל זכר מראה עיתוי הגירוי. תאים אקסצנטרי, אשר אקסונים להצמיח סיבי עצב, כל להראות דפוס דומה של ירי כמו זה בתנאי תאורה של הניסוי (5sec פלאש בחשיכה מוחלטת). קידוד רשתית עם קוצים הוא Limulus יש רכוש משותף עם יונקים, בניגוד חסרי חוליות אחרים. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="דמות 4" /> איור 4 עקבות דוגמה התגובה מתח לאור של שלושה סוגי תאים הנמצאים בעין לרוחב Limulus:. תא פיגמנט (A), תא retinular (ב), ותא אקסצנטרי (C). התא הראשון הוא אי - ראייה. שני האחרונים depolarize על הבזק אור. שלילת קוטביות היא הגדולה ביותר עבור תאים retinular כי הם transduce את האור לשלוח את האות דרך צמתים הפער לתא אקסצנטרי, עם הפסד כלשהו לאורך הדרך. בתא אקסצנטרי, פוטנציאל פעולה שנורו על ידי האקסון נראים רכיבה על שלילת קוטביות עקב backpropagation ספייק לתוך סומה. משרעת של פוטנציאל פעולה כבר נחלש באיור עבור צפייה טובה יותר של הפוטנציאל depolarizing. פוטנציאל המנוחה של התאים הוא-50mV.

<ol>
	<li>Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system.">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li><li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye.">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li><li>Snodderly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus.">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li><li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+a+neural+code+for+vision.">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li><li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limulus+lateral+eye:+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye.">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li><li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye.">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li></ol>

יש לנו להדגים כיצד לבצע הקלטות ERG, הקלטות עצב הראייה, והקלטות intraretinal על סרטני הפרסה in vivo. טכניקות הקלטה כל לספק תובנות שונות לתוך הבסיס העצבי של חזון, והם יכולים לשמש כדי לחקור פונקציה הרשתית הודות בבעלי חיים כדי עיניים גדולות של סרטן ו שריון קשה. פעילות עצב הראייה יכול...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>LED</td>
<td>Light source</td>
<td>Newark Inc</td>
<td>33C1292</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suction electrode</td>
<td>Electrode</td>
<td>A-M Systems, Inc</td>
<td>573000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier</td>
<td>Amplifier</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>40-40-8B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intracellular Recording</td>
<td>Amplifier</td>
<td>Cygnus</td>
<td>IR-283A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>APM</td>
<td>Neural Spike Discriminator</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>APM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bits++</td>
<td>Video Board</td>
<td>Cambridge Research Systems Inc</td>
<td>Bits++</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Piezopatch Manipulator</td>
<td>Micropositioner</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>PPM5000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square Pulse Stimulator</td>
<td>Nerve Stimulator</td>
<td>Grass Instrument Division, Astro-Med, Inc.</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillary</td>
<td>Electrode glass</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>1B150-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horseshoe crab (Limulus polyphemus)</td>
<td>Animal</td>
<td>Marine Biological Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Glass Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zoom Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Jed Pella Inc.</td>
<td>SMZ-168</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the horseshoe crab, limulus polyphemus, in vision research

סרטן פרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס הוא אחד היצורים העתיקים ביותר על פני האדמה, החיה ממשיכה לשחק תפקיד חיוני במחקר ביו. לא רק דמם מכיל תאים מיוחדים המדענים להשתמש כדי לזהות bacteriotoxins בתרופות שלנו, אבל העיניים שלהם מכילים גם רשת עצבית כי סיפקה תובנה הרבה על תהליכים פיזיולוגיים הפועלים מערכת הראייה שלנו, כגון הסתגלות קלה עיכוב לרוחב. סרטן פרסה נשאר מודל אטרקטיבי מחקר חזון כי בעל החיים הוא גדול hardy עבור חסרי חוליות, הנוירונים ברשתית שלה גדולים ונגישים, מערכת הראייה שלה הוא קומפקטי למד בהרחבה, התנהגות החזותי שלה מוגדר היטב. יתר על כן, המבנה והתפקוד של העיניים מווסתת על בסיס יומי על ידי השעון הביולוגי במוח של בעלי חיים. בקיצור, מערכת הראייה של סרטני פרסה היא פשוטה מספיק כדי להבין זאת מורכבת מספיק כדי להיות מעניין. בסרט זה אנו מציגים three פרדיגמות אלקטרו עבור חוקרת את הבסיס העצבי של חזון זה ניתן לבצע in vivo עם Limulus. הם electroretinogram הקלטה, הקלטה עצב הראייה, הקלטה intraretinal. Electroretinogram (ERG) הקלטות למדוד עם משטח אלקטרודה חשמלית סיכם את התגובה של כל התאים בעין אל בהבזק אור. הם יכולים לשמש כדי לפקח על הרגישות הכוללת של העין עבור להאריך את פרקי הזמן. הקלטות עצב הראייה למדוד את פעילות spiking של סיבי עצב בודד באמצעות אלקטרודה מיקרו תאית. הם יכולים לשמש ללמוד העביר מסרים חזותיים מן העין אל המוח, כמו גם היממה לשעון הודעות מוזן חזרה מהמוח אל העין. למדוד הקלטות Intraretinal עם microelectrode תאיים תנודות המתח המושרה על ידי אור תאים בודדים של העין. הם יכולים לשמש להבהיר מנגנוני הסלולר של עיבוד ברשתית.

Watch this Scientific Journal Video about Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research at JoVE.com

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

בסרט זה אנו מבצעים הקלטה electroretinogram, הקלטה עצב הראייה, הקלטה intraretinal עם הסרטן האמריקנית פרסה,<em&gt; Limulus פוליפמוס</em&gt;. פרדיגמות אלו אלקטרו יכול לשמש חוקר את הבסיס העצבי של חזון במחקר מעבדה או הוראה.

שימוש סרטן הפרסה, Limulus פוליפמוס, מחקר חזון

The American horseshoe crab, Limulus Polyphemus is one of the oldest creatures on earth, and the animal continues to play an indispensable role in ...

using-the-horseshoe-crab-limulus-polyphemus-in-vision-research

Research

JoVE Journal

Biology

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

14.2K Views.  Boston University. בסרט זה אנו מבצעים הקלטה electroretinogram, הקלטה עצב הראייה, הקלטה intraretinal עם הסרטן האמריקנית פרסה, Limulus פוליפמוס. פרדיגמות אלו אלקטרו יכול לשמש חוקר את הבסיס העצבי של חזון במחקר מעבדה או הוראה.

Video: Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

דם אוסף של סרטן הפרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1. To achieve this goal 6-10 systematic sections should be probed covering the entire structure. Typically this involves processing 1/5 sections which leaves a significant amount of material unprocessed. In order to maximize the material, we propose an inexpensive method for preserving fixed tissue as part of a long-term storage research plan. As tissue is sliced and processed for the desired stain or antibody, alternate sections should be systematically placed in antigen preserve at -20&deg;C for future processing. Using 24-well plates, sections can be placed in order for future retrieval. Using this method, tissue can be stored and processed for immunohistochemistry over the course of years.

Brain banking and systematic sampling of biological material provides the basis for unbiased stereology and maximizes the potential data obtained from each specimen.

בנקאות המוח: הפיכת רוב דוגמאות המחקר שלך

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1.  To ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

מדידה של תפקוד של שריר חלק ברקמות מבודדות אמבט-היישומים למחקר פרמקולוגיה

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

פרוטוקול להצפנה באמצעות גנים להגדיר העשרה ניתוח כדי לזהות את המודל החייתי המתאים עבור המחקר Translational

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

חקר אינטראקציות חלבון במחקר Autophagy

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

הכנה לדוגמה ליצירת פרופיל מטבולי באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

שימוש סרטן הפרסה, Limulus פוליפמוס, מחקר חזון

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

דם אוסף של סרטן הפרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס

בנקאות המוח: הפיכת רוב דוגמאות המחקר שלך

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

מדידה של תפקוד של שריר חלק ברקמות מבודדות אמבט-היישומים למחקר פרמקולוגיה

טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused

פרוטוקול להצפנה באמצעות גנים להגדיר העשרה ניתוח כדי לזהות את המודל החייתי המתאים עבור המחקר Translational

חקר אינטראקציות חלבון במחקר Autophagy

הכנה לדוגמה ליצירת פרופיל מטבולי באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה MALDI