Name: generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי החברה יפן הקידום של המדע [מספרים גרנט 16 K 15860 אל ט. מ ו- 15 K 15777 כדי N.H.].

1. פריימר עיצוב <ol><li>להתכונן תחל 2-שלב פיוז ' ן PCR ואימות של שיבוש גנטי. 
	הערה: טבלה 1 מציגה את רצפי פריימר בשימוש בפרוטוקול זה. איור 1 מראה של איור סכמטי של שיטת ה-PCR 2-שלב פיוז ' ן המשמש ליצירת Δ ס mutans gtfC.
	<ol><li>תחל עיצוב עבור התחליף של אזור היעד הגנום עם ג'ין (spc r) ההתנגדות spectinomycin 7. פרוטוקול זה מחליף את כל האזור קידוד של הגן gtfC spc r.</li>
		<li>לכלול 15 בסיסים משלימים בקצוות העליונים והתחתונים של spc r ב- 5 &#39; מחוזות היפוך למעלה, למטה-קדימה תחל בהתאמה. באופן דומה, כולל 15 בסיסים משלימים לקצה התחתון של האזורים איגוף במעלה הזרם של gtfC, בקצה העליון של האזורים איגוף במורד הזרם של gtfC-5 &#39; מחוזות spc r-קדימה ואת spc r -הפוך תחל בהתאמה ( איור 1 א'). 
		הערה: רצפים של היפוך למעלה, למטה-קדימה, spc r - קדימה, ו- spc r - הפוך תחל נקבעים באופן אוטומטי בהתאם אתר מסמכי התאגדות של הבונה הפרעה של.</li>
		<li>לעצב את תחל למעלה-קדימה, למטה-הפוך מעגנת &#62; 1-kb במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים של הגן gtfC, בהתאמה. להגדיר את טמפרטורת ההיתוך (T m) של מעלה-קדימה, למטה-הפוך תחל בהתאם טמפרטורת ההיתוך של היפוך למעלה, למטה-קדימה תחל בהתאמה ( איור 1 א'). 
		הערה: להפנות הנוסחה הבאה כדי לקבוע T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, היכן * N מייצג את מספר נוקלאוטידים תחל עם הזהות המצוינת (A, T, C או G)-</li>
		<li>עיצוב תחל מקוננים (N_up-קדימה ואת היפוך N_up) עבור 2 nd PCR ( איור 1B). 
		הערה: למרות הזוג תחל החיצוני (up-קדימה, למטה-אחורי) עשויה לשמש תחל 2 nd PCR, תחל מקוננים (N_up-קדימה ו- N_up-אחורי) עוצבו ב פרוטוקול זה. תחל מקוננים נדרשים לעתים קרובות עבור 2 nd PCR, כמפורט נציג תוצאות.</li>
		<li>תחל עיצוב ספציפי עבור spc r. תחל משמשים המושבה PCR למסך להפרעה gtfC.</li>
		הפרעה <li>תחל עיצוב עבור האימות של gtfC. 
		הערה: המוצרים PCR מוגבר באמצעות תחל אלה שנושקות לגבול בין gtfC או spc r במעלה או במורד הזרם איגוף מחוזות gtfC. ערכות פריימר &#39; gtfC up-קדימה ואת gtfC up-הפוך &#39;, &#39; gtfC למטה-קדימה, gtfC למטה-הפוך &#39; ספציפיות עבור gtfC, ו &#39; gtfC up-קדימה ו- spc r 2 -הפוך &#39;, &#39; spc r 2-קדימה ו- gtfC למטה-הפוך &#39; ספציפיות עבור spc r.</li>
	</ol></li></ol> 2. הפקת דנ א גנומי מ ס mutans <ol><li>המניות פס ס המוטנטים לפני שהם י s UA159 על צלחת אגר המוח אינפוזיה (BHI) הלב. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>שמושבה בודדת באמצעות קיסם סטיריליים ולקלוט לחסן אותו לתוך מ ל מרק BHI. דגירה התרבות s S. המוטנטים לפני שהם י בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>צנטריפוגה התרבות תא החיידק למשך 15 דקות ב ג' × 2,000 Resuspend בגדר תא ב 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 15 דקות ב ג' × 2,000 Resuspend בגדר תא ב- µL 200 ל- PBS.</li>
	<li>לחלץ דנ א גנומי התליה באמצעות של חרוז-מכות-בסיס גנומי DNA ערכת חילוץ בהתאם להוראות היצרן-
	<ol><li>העברת ההשעיה מדגם 2.0-mL שפופרת המכילה חרוזי זכוכית (כלול בערכה). להוסיף µL 750 בפתרון פירוק (כלול בערכה) התליה תא.</li>
		<li>קאפ בחוזקה ולמקם הצינורות באופן סימטרי בעל שפופרת של מנגנון השיבוש חרוז-מכות. תהליך במהירות המרבית עבור 5 דקות. צנטריפוגה הוכה חרוז הדוגמאות עבור 1 דקות ב- 10,000 ג' × להעביר את תגובת שיקוע המסנן ספין (כלול בערכה) 2.0-mL אוסף שפופרת, צנטריפוגה עבור 1 דקות ב × 7,000 g .</li>
		<li>µL 1,200 להוסיף איגוד ה-DNA של מאגר (כלול בערכה) פילטרט. העברת µL 800 של התערובת לעמודה ספין (כלול בערכה) 2.0-mL אוסף שפופרת, צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 10,000 ג' ×</li>
		<li>להשליך הזרימה דרך, להוסיף 200 µL מאגר קדם כביסה (כלול בערכה) העמודה ספין כדי לשטוף את המטריצה עמודה, ו צנטריפוגה עבור 1 דקות בג' 10,000 × להשליך הזרימה דרך, להוסיף 500 µL מאגר לשטוף (כלול בערכה) ספין עמודה כדי לשטוף את המטריצה עמודה ולאחר צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 10,000 ג' ×</li>
		<li>למקם את העמודה ספין לתוך צינור 1.5-mL microcentrifuge ולהוסיף 100 µL מאגר • תנאי (כלול בערכה) אל המטריקס עמודה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב-30 s ב × 10,000 g כדי elute את הדנ א הגנומי. מעריכים את ריכוז הדנ א ואת טוהר על ידי מדידת את ספיגת ב-260 nm ו 280 nmusing ספקטרופוטומטרים לאשר כי היחס 280 /A 260 A גדול מ- 1.8.</li>
	</ol></li></ol> 3. PCR-הגברה <ol><li>בצע 1 סנט PCR באמצעות הגנום s WT המוטנטים לפני שהם י ס והגן סינתטי spc r כתבניות PCR (ראה טבלה 1). להגביר את האזור איגוף במעלה הזרם של הגן gtfC, אזור איגוף במורד הזרם של הגן gtfC, הגן spc r באמצעות שלושה זוגות תחל שתוארו לעיל ( איור 1 א'), לפי בטבלה 2 ו- 3 בטבלה. 
	הערה: תחל PCR, ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.</li>
	<li>Fractionate כל מוצר ה-PCR על ג'ל agarose 1% ו בלו הלהקות המתאימים שימוש בחותך הלהקה ג'ל.</li>
	<li>לטהר כל מוצר ה-DNA מוגבר של ג'לים שימוש של ספין עמודה, סיליקה ג'ל המבוסס על רפידה ערכת חילוץ.
	<ol><li>העברת הפרוסות ג'ל כדי microcentrifuge נקי צינור ומערבבים עם 500 µL של איגוד מאגר (כלול בערכה). דגירה התערובת ב 55 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד הפרוסות ג'ל התפרקה לחלוטין.</li>
		<li>למקם את העמודה ספין (כלול בערכה) לתוך צינור אוסף (כלול בערכה) לטעון את הדגימה אל העמודה ספין, צנטריפוגה ב-30 s ב 11,000 × g. למחוק את הזרימה דרך, להוסיף את µL 600 מאגר לשטוף (כלול בערכה) העמודה ספין כדי לשטוף את הקרום סיליקה, צנטריפוגה ב-30 s ב 11,000 × g.</li>
		<li>להיפטר זרימה דרך של צנטריפוגה למשך 2 דקות ב × 11,000 g כדי לייבש את הקרום סיליקה.</li>
		<li>במקום העמודה ספין לתוך צינור microcentrifuge 1.5-mL החדש, להוסיף 50 µL מאגר • תנאי (כלול בערכה), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 דק</li>
		<li>צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 11,000 × g כדי elute את ה-DNA מוגבר. מעריכים את ריכוז הדנ א ואת טוהר על ידי מדידת את ספיגת ב-260 nm ו 280 nmusing ספקטרופוטומטרים לאשר כי היחס 280 /A 260 A גדול מ- 1.8.</li>
	</ol></li> <li>לבצע 2 nd PCR של 2-שלב פיוז ' ן PCR באמצעות שלושה שברי כ equimolar כתבניות PCR, לפי בטבלה 2 < /stרונג > ו לטבלה 3. 
	הערה: קטעים אלה היו מוגבר, משולבים באמצעות תחל מקוננים על &#39; N_up-קדימה ואת היפוך N_down &#39; או את תחל החיצוני &#39; up-קדימה, למטה-הפוך &#39; ( איור 1B). PCR תחל ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.</li>
	<li>לטעון עשירית של תערובת התגובה PCR (5 µL) ב- 0.8% agarose ג'ל ולהשוות את גודל הלהקה מוגבר עם גודל הלהקה צפויה לאשר את הדור של אמפליקון המתאים ( איור 1C).</li>
	<li>להתרכז המוצר PCR הסופי שנותרו על ידי משקעים אתנול ללא טיהור.
	<ol><li>µL להוסיף 55 של אולטרה טהור מים לתערובת PCR הנותרים כדי לכוונן את העוצמה הכוללת כדי 100 µL.Add נפח עשירית של 3 מ' סודיום אצטט (10 µL), pH 5.2, ואחריו 2.5 בנפחים של 100% אתנול (250 µL). לערבב ומקפיאים למשך 30 דקות ב-80 מעלות צלזיוס</li>
		<li>צנטריפוגה כעשרים דקות ב × 15,000 g ב- 4 ° C, בדוק בגדר בתחתית של התחתית, ולמחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את גלולה עם 1 מ"ל של 70% אתנול, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב × 15,000 g ב- 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע. מילה נהדרת בגדר כ 30 דקות, להמיס עם 10 µL של מים אולטרא טהורים.</li>
	</ol></li></ol> 4. הכנה תא המוסמכת וטרנספורמציה תא <ol><li>המניות פס ס המוטנטים לפני שהם י s UA159 על צלחת אגר BHI. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>שמושבה בודדת באמצעות קיסם סטיריליים ולקלוט לחסן אותו לתוך מ ל מרק BHI. דגירה התרבות s S. המוטנטים לפני שהם י בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>להעביר 2 מ"ל של התרבות s S. המוטנטים לפני שהם י 50 מ ל מרק BHI, תקופת דגירה של 6-8 h ב- 37 ° C עד צפיפות אופטית על 600 nm (OD 600) של 0.2-0.4 בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>Centrifuge התאים למשך 15 דקות ב × 2,000 g ב 4 ° C, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים פעמיים עם 40 מ של קרח מים ואחריו 40 מיליליטר 10% גליצרול. 
	הערה: חומרים שיורית משפיע אלקטרופורציה עוקבות.</li>
	<li>וארוקן את תגובת שיקוע בזהירות עם פיפטה פסטר כמו דבקותה של בגדר תא גליצרול 10% מצטמצם. Resuspend תאי 1 מ"ל של גליצרול 10% טרי, לוותר על 50 µL של ההשעיה לתוך כל שפופרת microcentrifuge 1.5-mL ו לאחסן ב- 80 ° C עד לפני שימוש.</li>
	<li>מערבבים את aliquot 50 µL של תאים המוסמכת קפואים עם 5 µL של הבונה הפרעה שתוארו לעיל בסעיף 3. להוסיף את התערובת אלקטרופורציה וואקום (עם מרחק 0.2 ס מ בין האלקטרודות). להעסיק את מצב Staphylococcus aureus (1.8 kV, 600 Ω, 10 µF, הדופק 1) על מנגנוני אלקטרופורציה כדי electroporate.</li>
	<li>להשעות את התאים µL 500 BHI מרק מיד לאחר אלקטרופורציה ולהוסיף 50 µL של ההשעיה ללוחות BHI-אגר המכילות spectinomycin. 
	הערה: הדגירה תוספת הזמן לאחר אלקטרופורציה אינה נדרשת. עם זאת, דגירה עבור h 1-2 לאחר אלקטרופורציה עשוי לשפר את יעילות טרנספורמציה.</li>
	<li>תקופת דגירה לצלחת של 2-6 ימים ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים. 
	הערה: S. mutans Δ gtfB נבנה כמתואר לעיל. כל האזור קידוד של הגן gtfB מוחלף עם אריתרומיצין ההתנגדות ג'ין 8 ב Δ mutans ס gtfB. כל זן mutans ס הוא תרבותי ב- BHI מרק ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
</ol> 5. אימות של שיבוש גנטי ואחסון <ol><li>לאסוף מושבות אקראי ואת לחסן אותם לתוך התערובת PCR לבצע המושבה PCR לפי טבלה 2 ו- 3 בטבלה. PCR תחל ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.</li>
	<li>לטעון את תערובת התגובה PCR על ג'ל agarose 1% כדי לאשר את ה-spc r-להקת ה-DNA ספציפיים.</li>
	<li>לבחור את המושבה חיובי באמצעות קיסם סטיריליים ותאים תת-תרבות ב 10 מ"ל של spectinomycin-המכילים BHI ציר 2 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>לאמת את הדור של ס' mutans Δ gtfC.
	<ol><li>לחלק התליה תא באותה מידה. לחלץ דנ א גנומי מתאי שתוארו לעיל (צעדים 2.3. כדי 2.5.5.). לבצע PCR עם ה-DNA גנומי כתבנית PCR, באמצעות תחל עבור האימות של שיבוש gtfC (טבלה 1) לפי טבלה 2 ו- 3 בטבלה. 
		הערה: ה-PCR תחל ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.</li>
		<li>לטעון את התערובת PCR על 2% agarose ג'ל ולהשוות את גודל הלהקה מוגבר עם גודל הלהקה צפויה לאשר את הדור של אמפליקון המתאים .</li>
		<li>Centrifuge התליה תא הנותרות למשך 15 דקות ב 2,000 × g ב- 4 מעלות צלזיוס Resuspend בגדר תא ב 5 מ של PBS.</li>
		<li>צנטריפוגה למשך 15 דקות ב × 2,000 g ב-4 ° C. Resuspend התא הצניפה ב- 1.5 מ ל מרק BHI המכיל 25% גליצרול ולאחסן ב-80 מעלות קור-20 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 6. ניתוח פנוטיפי <ol><li>פס כל המוטנטים לפני שהם י S. s זן על צלחת אגר BHI. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>שמושבה בודדת באמצעות קיסם סטיריליים ולקלוט לחסן אותו לתוך 2 מ ל מרק BHI עם או בלי אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>לחסן µL 20 של ההשעיה תרבות לילה לתוך 2 מ ל מרק BHI המכיל 1% או 5% סוכרוז ללא אנטיביוטיקה במבחנה זכוכית; התרבות התאים עם מבחנה במצב נוטה ללון ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.</li>
	<li>מערבולת הכוס מבחנות 10 s ו decant תרבות המתלים. רחץ צינורות הבדיקה שלוש פעמים עם מים מזוקקים. להוסיף 1 מ"ל של 0.25% Coomassie מבריק כחול (CBB) כתם biofilms על הקיר צינור ולאחר מכן תקופת דגירה של דק 1</li>
	<li>Decant הפתרון מוכתמים, רוחצים צינורות הבדיקה שלוש פעמים עם מים מזוקקים, ומייבשים את המבחנות.</li>
	<li>להעריך את צפיפות הצבע והן הארכת CBB צבעונית-biofilm באופן חזותי כדי לקבוע את יכולת ניתוח פנוטיפי להיוות biofilm.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors.">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).</li><li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II.">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li><li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis.">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis.">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בפרוטוקול הנוכחי, יש לתכנן את צבעי יסוד 1סנט PCR כדי להגביר כ 1 kb במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים של אזור היעד הגנום. רצפי זמן איגוף כאלה נחוצים לשפר את היעילות של רקומבינציה הומולוגית.
מסדרות תחל (היפוך למעלה, למטה-קדימה, spcr-קדימה, ו- spcr-הפוך) בפרוט...

הפונקציה מפענוח כוללת בדרך כלל השוואה פנוטיפי בין זן פראי-סוג זן שבו גן מסוים של עניין יש נשענה. טכניקה זו ג'ין-הפרעה יש נעזרו ג'ין ניתוחים פונקציה במגוון רחב של taxa, מחיידקים יונקים. מבנה הגן-הפרעה הוא הכרחי עבור הדור של המתח שיבשו-גן; המבנה הזה, חומצה deoxyribonucleic (DNA) מורכב הגן סמן עמידות לאנטיביוטיקה דבוקה את ויוצאת איגוף מחוזות הגן היעד, הוא שולב הגנום באמצעות רקומבינציה הומולוגית. המתח שיבשו גנים עשויים להיות מבודדים באמצעות המדיה סלקטיבי המכילה האנטיביוטיקה. השיטה המקובלת המשמש לבנייה של המתח שיבשו ג'ין דורש צעדים מורכבים, כגון ההגברה של הגן היעד על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), מצדו של הגן לתוך פלסמיד מתאים, מערכת העיכול עם הגבלה אנזימים, religation להוסיף את הגן marker ההתנגדות לאנטיביוטיקה. תהליך זה הוא זמן רב, לוקח מספר ימים עד מספר שבועות, בהתאם להצלחת כל שלב. בנוסף, העיצוב של הפרעה בונה תלויה האתרים אנזים הגבלה של הגן היעד. כדי לפתור בעיות אלה, דווחו DNA מבוססי ה-PCR splicing שיטות1,2 על עיצוב האתר של ג'ין שיבשו מוטציות של Dictyostelium discoideum3 ו- Synechocystis sp. PCC68034 . במחקר הנוכחי, פותחה שיטה ליצור זן streptococcal משובשות ג'ין בצורה מהירה יחסית, נתיישב, וזולה, ניצול שיטה מבוססת-PCR ששונתה (איזור 2-שלב פיוז ' ן PCR) לבנייה של ההפרעה לבנות, אלקטרופורציה לשינוי גנטי.
היתוך גרעיני 2-שלב שה-PCR דורש דנ א גנומי, הגן סמן עמידות לאנטיביוטיקה כתבנית PCR ו- 4 זוגות כראוי מעוצב לנוקלאוטידים. בשלב הראשון (1סנט PCR), אזור במעלה 1-kb איגוף של הגן היעד, אזור במורד הזרם 1-kb איגוף של היעד ג'ין, הגן marker ההתנגדות לאנטיביוטיקה הם מוגבר על ידי ה-PCR. 5' אזורים ומהצמיגים הפוכה והן את קדימה למתחילים, הגברה של במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים, בהתאמה, כוללים משלים הקצוות של הגן סמן 15 בסיסים. 5' אזורים ויוצאים צבעי יסוד סמן גנטי הגברה באופן דומה לכלול 15 בסיסים משלימים לקצה התחתון של האזור איגוף במעלה הזרם של הגן היעד, בקצה העליון של האזור איגוף במורד הזרם של הגן היעד, בהתאמה. לכן, שברי מוגבר שלושה מכילים אזורים חופפים זוג 30-בסיסים באתר פיוז'ן. בשלב השני (2nd PCR), PCR מבוצע עם תחל PCR מקוננות באמצעות שלושה שברי מוגבר על ידי 1סנט PCR כתבניות. האזורים משלימים תבניות בנוסף מקושרים אחד לשני באמצעות 2nd PCR. לבסוף, הבונה על רקומבינציה הומולוגית הוא הכיר את המתח פראי-סוג מאת אלקטרופורציה. ניתן לבירור שיבוש גנטי מוצלחת על ידי ה-PCR באמצעות תחל ספציפיים. למרות הבונה הפרעה מוגבר באמצעות אמינות גבוהה DNA פולימראז, תגובות אנזימטיות נוספים, כגון ה-DNA מצדו או עיכול דנ א, אינם הכרחיים ליצירת הבונה. בנוסף, אזור שנמחקו או משומר על הגנום יכול לבחור בגמישות על פי עיצוב פריימר.
בשנת העבודה הנוכחית, בוצעה מחיקה של כל האזור קידוד של הגן gtfC , שמקודד glucosyltransferase ב mutans סטרפטוקוקוס, כדי להדגים את שיטת שיבוש גנטי מהיר, קל זן streptococcal. בנוסף, gtfB-זן שיבשו נוצר באופן זהה. Glucosyltransferases מקודד על ידי הן gtfC והן gtfB לתרום cariogenic שיניים biofilm פיתוח5,6. היכולות להיוות biofilm הפראי-סוג זן (ס' mutans WT), gtfC-הפרעת המתח (Δס mutans gtfC), gtfB-זן שיבשו (Δס mutans gtfB) הוערכו עבור ניתוחים פנוטיפי השוואתי. פרוטוקול זה מרחיב את היישום של שיטה שני שלבים של הפרעה גן זן נוסף, עשוי להיות שונה עבור מחקרים של ג'ין פונקציה במגוון רחב יותר של taxa.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Streptococus mutans&lt;/em&gt;</td><td>Stock strain in the lab.</td><td></td><td>Wild-type strain (Strain UA159)</td></tr><tr><td>Genomic DNA extraction kit</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>Bead-beating disruption apparatus</td><td>Taitec</td><td>GM-01</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic genes</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Custom-ordered</td><td>Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene</td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Astec</td><td>PC-708</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Custom-ordered</td><td>35 bases in length</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>High-fidelity DNA polymerase</td></tr><tr><td>Gel extraction kit</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>DNA extraction from agarose gel</td></tr><tr><td>Gel band cutter</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU 800</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvette</td><td>Bio-rad</td><td>1652086</td><td>0.2-cm gap</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>Anaerobic culture system</td></tr><tr><td>Brain heart infusion broth</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Bacterial culture media</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Erythromycin</td><td>Wako</td><td>057-07151</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>For biofilm development</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>For biofilm staining</td></tr></tbody></table>

generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning

שיטות טיפוסי הבהרה של הפונקציה של גן מסוים כרוך ניתוח השוואתי פנוטיפי של המתח פראי-סוג של זן אשר שיבשו את הגן עניין. מבנה ה-DNA ג'ין-הפרעה המכיל גן מרקר מתאים עמידות לאנטיביוטיקה היא שימושית לדור של ג'ין-שיבשו זנים של חיידקים. עם זאת, שיטות בנייה קונבנציונלית, אשר דורשים צעדים שיבוט גנטי, כרוכים פרוטוקולים מורכב ולגזול. כאן, מתוארת שיטה יחסית נתיישב, מהירה וחסכונית עבור ג'ין יישוב להפרעה mutans סטרפטוקוקוס . השיטה משתמשת 2-שלב פיוז ' ן תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) כדי ליצור את השיבוש לבנות ואת אלקטרופורציה לשינוי גנטי. שיטה זו אינה דורשת לתגובה אנזימטיות, מלבד PCR, ומציע בנוסף גמישות רבה יותר מבחינת העיצוב של הבונה שיבוש. העסקתם של אלקטרופורציה מקלה על ההכנה של תאים המוסמכת ומשפר את היעילות טרנספורמציה. השיטה הנוכחי עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

איור 2 מציג את הגודל של כל מוצר מ- 1סנט PCR, כפי שנצפה על הג'ל 1% agarose, היה הסכם טוב עם חזה בגודל של 1 kb. איור 3 מראה ג'ל אלקטרופורזה ניתוח של המוצרים של 2nd PCR. איור 4 מראה המושבות ס mutans טרנספורמציה עם הבונה שיבושים, נית...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning at JoVE.com

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

אנו מתארים שיטה נתיישב, מהירה וזולה יחסית לדור של ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זנים; טכניקה זו עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

generation-gene-disrupted-streptococcus-mutans-strain-without-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

7.6K Views.  Tsurumi University School of Dental Medicine. אנו מתארים שיטה נתיישב, מהירה וזולה יחסית לדור של ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זנים; טכניקה זו עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

Video: Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different conditions often leads to the production of new compounds. Therefore, production cultures of the strains are extracted with ethyl acetate and the crude extracts are analyzed by HPLC. Furthermore, the extracts are tested for their bioactivity by different assays. For structure elucidation the compound of interest is purified by a combination of different chromatography methods.
Genome sequencing coupled with genome mining allows the identification of a natural product biosynthetic gene cluster using different computer programs. To confirm that the correct gene cluster has been identified, gene inactivation experiments have to be performed. The resulting mutants are analyzed for the production of the particular natural product. Once the correct gene cluster has been inactivated, the strain should fail to produce the compound.
The workflow is shown for the antibacterial compound polyketomycin produced by Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028. Around ten years ago, when genome sequencing was still very expensive, the cloning and identification of a gene cluster was a very time-consuming process. Fast genome sequencing combined with genome mining accelerates the trial of cluster identification and opens up new ways to explore biosynthesis and to generate novel natural products by genetic methods. The protocol described in this paper can be assigned to any other compound derived from a Streptomyces strain or another microorganism.

Here we present a detailed protocol of (A) the identification of a natural product with antibiotic activity, (B) the purification of the compound, (C) the first model of its biosynthesis, (D) genome sequencing/-mining and the (E) verification of the biosynthetic gene cluster.

ממוצר טבעי כדי המצרר שלו biosynthetic ג&#39;ין: הפגנה שימוש Polyketomycin מ<em&gt; Streptomyces diastatochromogenes</em&gt; Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

תהליך המפלצת הירוקה לדור של זני שמרי נשיאת מחיקות Gene מרובות

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Biology

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

טיהור חלבון המסה המולקולרי הגבוה בסטרפטוקוקוס

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Immunology and Infection

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

בניית מוטנטים בסרוטיפ 1 סטרפטוקוקוס דלקת ריאות זן 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

דור של<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ממוצר טבעי כדי המצרר שלו biosynthetic ג'ין: הפגנה שימוש Polyketomycin מ