עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית עבור חוקרים צעירים מכובד (81625002), הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (81470389, 81270282, 81601238), התוכנית של שנגחאי אקדמי למחקר מנהיג (18XD1402400), שנגחאי העירוני חינוך הנציבות Gaofeng ברפואה קלינית גרנט תמיכה (20152209), מרכז פיתוח בית החולים של שנגחאי Shenkang (16CR3034A), אוניברסיטת ג'יאו טונג שאנגחאי (YG2013MS42), שנגחאי ג'יאו טונג אוניברסיטת בית הספר לרפואה (15ZH1003 ו- 14XJ10019), שנגחאי שיט התוכנית (18YF1413000), ואת התוכנית חדשנות לתואר שני במכללה לרפואה Bengbu (Byycx1722). אנו מודים ד ר Erhe גאו לעזרתו קודמים במעבדה שלנו.

כל הניסויים בוצעו על פי מוסדות לאומיים של הבריאות הנחיות על שימוש של חיות מעבדה, אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעל חיים של המכון. עכברים C57BL/6J זכר (בגילאי 8-10 שבועות) שימשו כל הניסויים. עכברים שוכנו בתנאים ללא הפתוגן ב 24 ° C ± 4 ° C, תחת מחזור/כהה 12-h, עם גישה חופשית מים ומזון.
1. הכנת אדנו פתרון
<ol><li>עם ההגעה של הפתרון אדנו מטוהרים, לאחסן את הפתרון במקפיא-80 ° C. הערה: הזריקה אדנו בוצעה בעכברים קיימא. כדי להבטיח העקרות של וקטור אדנו, אדנו (לוציפראז קידוד, VDR או shRNA מיקוד VDR) הוכנו וטיהרו מסחרית9,10.</li>
	<li>ביום של הניתוח, להוציא את הפתרון אדנו מטוהרים (3 x 1010 פלאק ויוצרים יחידות [pfu] /mL) מהמקפיא-80 ° C, להפשיר פתרון וקטור אדנו על קרח.</li>
	<li>לשים על facemask כפפות סטריליות, שמלת סטרילי.</li>
	<li>הכנת 50-µL של מזרק המילטון אשר יש עברו עיקור כפוי יום לפני הניתוח. הערה: עבור עיקור, המזרק המילטון היה עטוף גזה והניח מעקר לחץ טמפרטורה גבוהה/גבוהה. המצב של "עיקור עבור המוצק" נבחר והחלה עיקור היה על-ידי לחיצה על כפתור "התחל".</li>
	<li>לאחר מלאה הפשרתו של הפתרון אדנו מטוהרים, לרסס את הצינור המכיל אדנו פתרון עם 75% אתנול, להעביר את הפתרון אדנו לתוך תא סטרילי למינארי.</li>
	<li>ב תא סטרילי למינארי, תשאף 50 µL אדנו פתרון באמצעות המזרק המילטון ללא מחט, ואחריו מצורף של מחט 30 G כדי המזרק המילטון.</li>
	<li>. תחזיק את המזרק עם המחט 30 G כלפי מעלה, דחף בעדינות את הבוכנה של המזרק עד המחט מתמלא פתרון אדנו (אושר על ידי הופעת הטיפות הפתרון הראשון מהקצה מחט). הערה: זה לוקח כ 45 µL פתרון כדי למלא את המחט 30 G, אז עכשיו כמעט אין פתרון מוצגת במזרק.</li>
	<li>משתמשת במזרק מוכן לעיל לרוקן בזהירות אחר פתרון אדנו µL 30 ולמקם את המזרק רצ'ט באופן רופף על הקרח לשימוש עוקבות.</li>
</ol>2. הרדמה והכנות פעיל
<ol><li>להוסיף 20 מ"ל איזופלוריין לתוך מכשיר אידוי איזופלוריין, והתחבר מאדה איזופלוריין את מיכל חמצן.</li>
	<li>פתח את השסתום. ותן את החמצן זרימת ממיכל חמצן מאדה איזופלוריין. לשמור על קצב הזרימה חמצן ב 2 ל'/דקה באמצעות צג זרימת חמצן במאדה איזופלוריין.</li>
	<li>לגרום הרדמה של העכבר עם 4% איזופלוריין 100% חמצן (2 ל'/דקה) למשך 2 דקות בתוך כלוב מפלסטיק מחובר מאדה איזופלוריין.</li>
	<li>להוציא את העכבר anesthetized מן הכלוב פלסטיק, לאבטח אותו על משטח פלסטיק במצב שכיבה ב תא סטרילי למינארי ו לשמור על הרדמה עם 2% איזופלוריין 100% חמצן (2 ל'/דקה) באמצעות קונוס האף.</li>
	<li>לאשר הרדמה נאותה על ידי העדר תגובה קמצוץ הבוהן.</li>
	<li>קרם עיניים סטרילי חלות על כל עין כדי להגן על הקרנית מפני ייבוש.</li>
	<li>מגלח את החזה והבטן העליונה. להחיל קרם depilatory הנמכרים באתר מגולח עבור מינימלית 1 להסיר את הקרם depilatory, שנותרו פרווה עם פדים רטוב.</li>
	<li>לחטא באתר כירורגית (החלק התחתון השמאלי של החזה) עם 3 קרצוף של חיטוי יוד-chlorhexidine מבוסס (למשל entoiodine). מכסים באתר כירורגית עם תלוי סטרילי.</li>
</ol>3. Intramyocardial הזרקה של אדנו בלב העכבר
<ol><li>. תוריד את הכפפות ולהניח על זוג חדש של כפפות סטריליות.</li>
	<li>לחטא מלקחיים, עוצר דימום מיקרו-יתושים, זוג מספריים כירורגיים, ולחץ בעל מחט ביום שלפני הניתוח בקול רם טמפרטורה/גבוהה מעקר (ראה הערה שלב 1.4).</li>
	<li>עושים חתך בעור 0.5 ס מ לאורך הקו המחבר בין מצאתי את בית השחי. בלשון בוטה לנתח את החזה הגדולים ואת שרירי החזה קטן עם מלקחיים, עוצר דימום מיקרו-יתושים.</li>
	<li>לחשוף את בצלעות על ידי מפסק את החזה הגדולים ואת שרירי החזה משנית. . נקבי ופתח לחלל הבין-צלעי הרביעי (או לחלל הבין-צלעי הרחב באמצעות התבוננות) עם עוצר דימום מיקרו-יתושים.</li>
	<li>לדחוף הלב לכיוון החתך כדי להחצין את הלב עם האצבע המורה. של היד-הדומיננטי בהקשת בעדינות כנגד הצד הימני של הקיר החזה.</li>
	<li>בעדינות לאבטח את הלב מוחצן עם האצבע והאגודל של היד האחרת.</li>
	<li>להזריק סך של 30 µL אדנו פתרון לתוך שריר הלב של החדר השמאלי בשלושה אתרים (הגחון, הגבי ו לרוחב הקיר של החדר השמאלי) באמצעות המזרק המילטון מלא עם אדנו (איור 1C) עם היד הדומיננטית.</li>
	<li>לאחר סיום הזרקה, מיד מקום הלב בחזרה לחלל intrathoracic.</li>
	<li>לפנות באופן ידני את האוויר בחלל intrathoracic בהקשת קיר החזה בעדינות לכיוון מקום החתך בעור. הערה: פינוי אוויר מוצלח יכול להיות שמעידים נפנוף של החזה גדול, שרירי החזה קטין הנגרמת על ידי האוויר גורשו.</li>
	<li>לסגור את העור על ידי מזרון אופקי תפר בתפר משי 5-0. הערה: החזה הגדולים ואת שרירי החזה קטן צריך לא להיות sutured, כי הם רק בלשון בוטה ביתר מבנים אנטומיים שלהם ניזוקו במהלך הפעולה.</li>
</ol>4. לאחר הניתוח ניהול
<ol><li>לנהל הבופרנורפין (3 מ"ג/ק"ג) פעמיים מדי יום באמצעות הזרקה תת-עוריים כדי להפחית את הכאב עבור ה 48 הראשון אחרי מבצע11.</li>
	<li>לאחר המבצע, מיד לשמור על העכברים על משטח חום (37 מעלות צלזיוס) עד החלים לחלוטין. הנח את העכבר בחזרה לכלוב לאחר מלא התאוששות מתקלה.</li>
	<li>לחטא את המזרק המילטון בשימוש ואת מחט מזרק 30 G מעקר לחץ טמפרטורה גבוהה/גבוהה (ראה הערה שלב 1.4). לאסוף את המחט מזרק 30 G סטיריליים במיכל החדים.</li>
</ol>5. דימות in Vivo למדידת ביטוי לוציפראז הלב
<ol><li>ביום 5 לאחר ההזרקה אדנו, להכין פתרון מניות טריים של luciferin ב- 15 מ ג/מ ל תמיסת מלח פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). לסנן את הפתרון דרך מסנן 0.2 µm.</li>
	<li>Intra-peritoneally להזריק העכברים ער הפתרון luciferin-150 מ"ג/ק"ג משקל גוף.</li>
	<li>הפעל את מערכת הדמיה.</li>
	<li>לאחר אוטומטי בדיקה עצמית של מערכת ההדמייה, לבחור את מצב הדמיה כמו "זורח" ובצע את ההגדרות הבאות: חשיפה: אוטומטי; Binning: 8; FStop: 1; עירור: לחסום; פליטה: פתוח.</li>
	<li>ב- 10 דקות לאחר ההזרקה luciferin, עזים ומתנגד העכברים בזריקה כלורין (300 מ"ג/ק"ג משקל גוף). לאשר הרדמה נאותה על ידי העדר תגובה קמצוץ הבוהן.</li>
	<li>לאבטח העכברים anesthetized על הבמה הדמיה מחומם במצב שכיבה, עם החזה לכיוון המצלמה.</li>
	<li>לאסוף תמונות (תמונה 1 עבור כל עכבר) ולכמת את עוצמת האותות על ידי ציור זהה מדידה מעגלית אזורים מעניינים (ROI) סביב בית החזה.</li>
	<li>לאחר האוסף של תמונות, להקריב את העכברים ולאסוף את הרקמות כאמור בסעיף הבא.</li>
</ol>6. קצירת רקמות
<ol><li>בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת וירוס (איור 1B), עזים ומתנגד העכברים עם 4% איזופלוריין, ו לשמור על הרדמה עם 2% איזופלוריין באמצעות קונוס האף ואבטח אותו על משטח פלסטיק במצב שכיבה.</li>
	<li>עושים חתך הגחון קו האמצע בצוואר הקדמי. חושפים את עורק תרדמני של ממש על ידי מפסק השרירים omohyoid, שריר הצוואר.</li>
	<li>להקריב את העכברים מאת transecting עורק תרדמני נכון, וגומר את הדם.</li>
	<li>עושים חתך הגחון קו האמצע בבטן. לחתוך את הצלעות משני צידי הצלעות לאורך הקו midclavicular, ו transect הסרעפת.</li>
	<li>לחשוף את הלב על-ידי הרמת מצאתי. לאתר של אבי העורקים ולהסיר בעדינות את רקמת השומן perivascular.</li>
	<li>נקרר אבי העורקים, retrogradely perfuse את הלב עם מחט 30 G המצורפת מזרק 1 מ"ל מלא 0.5 מ של 4 ° C בופר פוספט (PBS).</li>
	<li>לאחר זלוף, לסלק את הלב, ומחלקים אותו לתוך מתגלה ימינה ושמאלה. לסלק את הכבד, הריאות, הטחול.</li>
	<li>לאחר שני שוטף ב- PBS קר (4 ° C), לאחסן כל רקמות שנאספו בנפרד בקבוקונים קריוגני בחנקן נוזלי.</li>
</ol>7. קביעה של ביטוי חלבון
<ol><li>להכין מאגר המגון על-ידי הוספת קוקטייל מעכב פרוטאז לתוך מאגר פירוק זמינים מסחרית ביחס של 1: 100. לחשב את הנפח הכולל מבוסס על מספר דוגמאות יעובדו. לשמור על המאגר המגון מוכן ב 4 ° C לשימוש עוקבות.</li>
	<li>להוציא את רקמות ממיכל חנקן נוזלי. שוקלים את הרקמה על סולמות דיוק גבוהה (כ 60 מ"ג עבור כל פיסת הרקמה).</li>
	<li>להעביר את רקמת צינור 1.5-mL microcentrifuge. מיד מוסיפים 200 µL המגון מאגר precooled כדורי ברזל 1.5 מ מ (4 ° C) לתוך הצינור microcentrifuge.</li>
	<li>לאבטח צינורות microcentrifuge precooled (4 ° C) מחזיקי מתכת רקמה אוטומטית מכונת גריסה, ומתחילים המגון על-ידי הפעלת המכונה ההגדרות הבאות: תדירות: 70 הרץ; זמן: 120 s.</li>
	<li>לאחר המגון, centrifuge את homogenate (16,000 × g, 4 ° C), בזהירות להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5-mL עם פיפטה 100 µL.</li>
	<li>להוסיף טעינת מאגר לפתרון החלבון supernatant (5 x) ביחס של 1:4, denature החלבון ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.</li>
	<li>רמות ביטוי חלבון את הלב ואת רקמות איברים אחרים נוספים המפוקחים על-ידי ניתוח תספיג (נציג התוצאות יוצגו ב- 2C איור , איור 3) לפי הפרוטוקול12שתואר קודם לכן.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yancy, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2017+ACC/AHA/HFSA+Focused+Update+of+the+2013+ACCF/AHA+Guideline+for+the+Management+of+Heart+Failure:+A+Report+of+the+American+College+of+Cardiology/American+Heart+Association+Task+Force+on+Clinical+Practice+Guidelines+and+the+Heart+Failure+Society+of+America.">2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America.</a> J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).</li><li>Pu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte-expressed+farnesoid-X-receptor+is+a+novel+apoptosis+mediator+and+contributes+to+myocardial+ischaemia/reperfusion+injury.">Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury.</a> Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+melatonin+receptor+ROR&#945;+is+a+novel+endogenous+defender+against+myocardial+ischemia_reperfusion+injury.">The nuclear melatonin receptor ROR&#945; is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury.</a> J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).</li><li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+receptor+activation+protects+against+myocardial+reperfusion+injury+through+inhibition+of+apoptosis+and+modulation+of+autophagy.">Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy.</a> Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).</li><li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+liver-X-receptor+alpha+but+not+liver-X-receptor+beta+protects+against+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rAAV9+to+Overexpress+or+Knockdown+Genes+in+Mouse+Hearts.">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li><li>Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+delivery+to+the+heart.">Adeno-associated virus vector delivery to the heart.</a> Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).</li><li>Michael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+gene+delivery+with+cardiopulmonary+bypass.">Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass.</a> Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Hepatic+Fatty+Acids+Uptake+and+Oxidation+by+LRPPRC-Driven+Oxidative+Phosphorylation+Reduces+Blood+Lipid+Levels.">Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels.</a> Front Physiol. 7, 270 (2016).</li><li>Zhang, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+the+contractile+phenotype+in+corpus+cavernosum+smooth+muscle+cells+by+Myocardin+gene+therapy+ameliorates+erectile+dysfunction+in+bilateral+cavernous+nerve+injury+rats.">Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats.</a> Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).</li><li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction.">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Gao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse.">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+protective+role+of+nuclear+melatonin+receptor+ROR&#945;+in+diabetic+cardiomyopathy.">Novel protective role of nuclear melatonin receptor ROR&#945; in diabetic cardiomyopathy.</a> J Pineal Res. 62 (3), (2017).</li><li>Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+toll-like+receptor+4+in+melatonin-induced+cardioprotection.">Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection.</a> J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).</li><li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK-TLR9+signal+pathway+mediates+allergic+airway+inflammation+through+suppressing+melatonin+biosynthesis.">JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis.</a> J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).</li><li>de Luxan-Delgado, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+reduces+endoplasmic+reticulum+stress+and+autophagy+in+liver+of+leptin-deficient+mice.">Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice.</a> J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).</li><li>Scofield, S. L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+Myocardial+Ischemia+and+Reperfusion+Injury+in+Mice+Using+Surface+Pad+Electrocardiography.">Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Cai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+H19+mediates+melatonin+inhibition+of+premature+senescence+of+c-kit(+)+cardiac+progenitor+cells+by+promoting+miR-675.">Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675.</a> J Pineal Res. 61 (1), (2016).</li><li>Chua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardioprotective+effect+of+melatonin+and+exendin-4+treatment+in+a+rat+model+of+cardiorenal+syndrome.">The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome.</a> J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).</li><li>Pei, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+attenuates+postmyocardial+infarction+injury+via+increasing+Tom70+expression.">Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+receptor-dependent+Notch1_Hes1+activation+by+melatonin+protects+against+myocardial+ischemia-reperfusion+injury_+in+vivo+and+in+vitro+studies.">Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies.</a> J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+rescues+cardiac+thioredoxin+system+during+ischemia-reperfusion+injury+in+acute+hyperglycemic+state+by+restoring+Notch1/Hes1/Akt+signaling+in+a+membrane+receptor-dependent+manner.">Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li><li>Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramyocardial+cell+delivery:+observations+in+murine+hearts.">Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts.</a> J Vis Exp. (83), e851064 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הדו ח הנוכחי מדגים טכניקה שונה להזרקה intramyocardial של וקטורים נגיפי עבור מניפולציה ג'ין הלב, אשר היה שונה משיטה של אוטם שריר הלב אינדוקציה על-ידי גאו. et al. 13 . כעת, ויוו אפיון של פונקציות גנים ספציפיים לרוב לערב את הדור של העכברים הטרנסגניים3,14</su...

מחלת לב היא הגורם המוביל של התחלואה והתמותה ברחבי העולם1,2. העדר אסטרטגיות טיפוליות אפקטיביות עבור הלב מסכני כולל אוטם שריר הלב, אי ספיקת לב מושך אינטנסיבית חקר pathomechanisms כבסיס וזיהוי של אפשרויות טיפוליות הרומן3. עבור האלה החקירות מדעי, מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב הוא בשימוש נרחב4,5. מניפולציה ג'ין הלב יכולה להיות מושגת על ידי הגנום עריכת בעזרת נוקלאז activator דמוי אפקטור את תמלול חזק (TALEN), מקובצים באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) / CRISPR הקשורים חלבון 9 (Cas9) כלים, או דרך אספקה של חומרי גנטי חוץ רחמי (למשל, וקטורים וירוס נושאת גנים קידוד חלבונים עניין)6. למרות הגנום עריכה מאפשר שינויים הגנום ייתכן ומדויק בעכברים חי, זה עדיין מהגידולים ועתירת תרגול6. לחלופין, מניפולציה ג'ין הלב ספציפיים על-ידי וירוס וקטוריים או הפרעה קטנה מסירה מורכבת RNA (siRNA) יש לבצע6.
וירוס משלוח וקטור ללב העכבר למבוגרים מושגת על ידי בערך שתי אסטרטגיות: הזרקה מקומית או מערכתית. הזרקת מערכתית של cardiotropic serotype של AAVs כגון AAV9 היא לא פולשנית הלב גנים ספציפיים מניפולציה7. עם זאת, שיטה זו דורשת כמות גבוהה יחסית של וקטור הכרחי עבור התמרה חושית יעילה של ביטוי גנים, עלול לגרום משמעותי התמרה חושית של איברים nontarget כגון שרירים, כבד7. הזרקת וירוס המקומית מושגת על ידי הזרקת intramyocardial או משלוח intracoronary7. משלוח intracoronary מוביל הפצת וירוס בתוך הלב לעומת הזרקה intramyocardial אפילו יותר. עם זאת, החסרונות של שיטה זו הם כביסה מהירה החוצה של וקטורים ויראלי מחזור מערכתי, התמרה חושית איברים nontarget8, וכן את הדרישה של מכשירי מדידת לחץ במהלך המבצע. לעומת זאת, מאפשר הזרקת intramyocardial השמירה וירוסים יותר שריר הלב, כמו גם משלוח באתר מסוים, אבל זה נכשל לפיזור אחיד ויראלי וקטור7. לבעלי-חיים קטנים, משלוח intracoronary קשה מבחינה טכנית לבצע, בעוד הזרקת AAV9 מערכתית, הזרקת intramyocardial הם יותר נפוץ התאמן4,5,7. למרות הזרקת מערכתית הוא קל לביצוע, הזרקת intramyocardial המקובלת דורש אוורור מכני ניקור חזה גורמת נזק לרקמות נרחב, הרבה זמן.
בדו ח זה, אנחנו תיאר שיטה נוחה לחיסכון בזמן, יעילה במיוחד עבור intramyocardial הזרקה. אדנו קידוד לוציפראז VDR, או shRNA מיקוד VDR, הוזרק לתמרן ביטוי גנים הלב. לאחר mastered, ניתן להשתמש בשיטה זו מניפולציה ג'ין, כמו גם הזרקת תאים או חומרים אחרים בלב העכבר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="914">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td colspan="4" height="40" style="height:40px;width:916px;">Equipments</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Laminar flow sterile hood</td>
			<td style="width:267px;">Fengshi Animal Experimental&#160; Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)</td>
			<td style="width:143px;">FS-CJ-2F</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">75005282</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Tissue grinding machine</td>
			<td style="width:267px;">Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td>
			<td style="width:143px;">Scientz-48</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">High temperature/high pressure sterilizer</td>
			<td style="width:267px;">Hirayama (Saitama, Japan)</td>
			<td style="width:143px;">HVE-50</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Isoflurane vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Matrix (Orchard Park, USA)</td>
			<td style="width:143px;">VIP3000</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">IVIS&#160; Lumina III imaging system</td>
			<td style="width:267px;">PerkinElmer (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">CLS136334</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Precision&#160;balance</td>
			<td style="width:267px;">Sartorius (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td style="width:143px;">28091873</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Instruments&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Eppendorf pipette (100 &#181;L)</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf (Westbury, USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;4920000059</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Eppendorf pipette (10 &#181;L)</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf (Westbury, USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;4920000113</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Forceps</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.&#160;</td>
			<td style="width:143px;">JD4020</td>
			<td style="width:156px;">Curved tip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:267px;">Hamilton (Nevada, USA)</td>
			<td style="width:143px;">80501</td>
			<td style="width:156px;">Volume 50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Micro-mosquito hemostat</td>
			<td style="width:267px;">F.S.T (Foster City, USA)</td>
			<td style="width:143px;">13011-12</td>
			<td style="width:156px;">Curved, tip width 1.3mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Needle holder&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">J32110</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:267px;">F.S.T (Foster City, USA)</td>
			<td style="width:143px;">14002-12</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">1-mL Syringe</td>
			<td style="width:267px;">WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Materials and reagents</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:267px;">CST (Danvers,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">#2118</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-Luciferase antibody</td>
			<td style="width:267px;">Abcam (Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:143px;">ab187340</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:267px;">CST (Danvers,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;#7074</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-VDR antibody</td>
			<td style="width:267px;">Abcam (Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;ab109234</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">PA175056</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Chloralic hydras</td>
			<td style="width:267px;">LingFeng Chemical (ShangHai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Cryogenic Vials</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">375418</td>
			<td style="width:156px;">1.8 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Depilatory cream</td>
			<td style="width:267px;">Veet (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Gibco (Grand Island,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">14040133</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Entoiodine</td>
			<td style="width:267px;">LiKang (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">310132</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">EP tube</td>
			<td style="width:267px;">Sarstedt (Newton, USA)</td>
			<td style="width:143px;">PCR001</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Filter</td>
			<td style="width:267px;">Millipore (Bedford, USA)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">Pore size 0.2 &#181;m&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:267px;">Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Luciferin</td>
			<td style="width:267px;">Promega (Madison, USA)</td>
			<td style="width:143px;">P1041</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Lysis buffer for western&#160; blot</td>
			<td style="width:267px;">Beyotime (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">P0013J</td>
			<td style="width:156px;">Without inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Ophthalmic cream</td>
			<td style="width:267px;">Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">PBS</td>
			<td style="width:267px;">Gibco (Grand Island,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">10010023</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">78438</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">5-0 silk suture</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Steel ball</td>
			<td style="width:267px;">Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">Width 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:267px;">Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">30 gauge&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Warm mat</td>
			<td style="width:267px;">Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )</td>
			<td style="width:143px;">NF-GNCW</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice

מניפולציה ג'ין במיוחד בלב פלאטין באופן משמעותי את החקירה של מחלות לב pathomechanisms, הפוטנציאל הטיפולי שלהם. In vivo המסירה הגן הספציפי דום לב מושגת בדרך כלל על ידי משלוח מקומי או סיסטמי. הזרקת מערכתית דרך וריד הזנב היא קלה ויעילה לתמרן את ביטוי גנים הלב באמצעות וירוס רקומביננטי adeno-הקשורים 9 (AAV9). עם זאת, שיטה זו דורשת כמות גבוהה יחסית של וקטור עבור התמרה חושית יעילה, עלול לגרום איברים nontarget ג'ין התמרה חושית. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה, יעילה ו לחיסכון בזמן של הזרקת intramyocardial עבור ויוו מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בעכברים. תחת הרדמה (ללא אוורור), שרירי החזה ראשיות ומשניות היו גזור בלשון בוטה, בלב העכבר נחשף במהירות על-ידי הוצאתו ידני דרך חתך קטן ברווח הבין-צלעי הרביעי. לאחר מכן, אדנו קידוד לוציפראז (לוק), קולטן ויטמין D (VDR), או סיכת ראש קצר RNA (shRNA) מיקוד VDR, הוזרק עם מזרק המילטון לתוך שריר הלב. הדמיה עוקבות ויוו הפגינו שלוציפראז הזה היה בהצלחה overexpressed באופן ספציפי בלב. יתר על כן, ניתוח תספיג אישר את ביטוי מוצלח או להחרשת VDR בלב העכבר. לאחר mastered, ניתן להשתמש בטכניקה זו מניפולציה ג'ין, כמו גם הזרקת תאים או חומרים אחרים כגון nanogels בלב העכבר.

פרוטוקול הניסוי וחלק השלבים המפתח עבור שיטת דיווח מוצגים באיור1. ב- 5 ימים לאחר הזרקת intramyocardial אדנו קידוד לוציפראז (עו ד-לוק), ויוו הדמיה בעכברים עו ד-לוק מוזרק המצוין ביטוי חזקים של לוציפראז במיוחד בלב (איור 2 א, ב'), אשר היה לאשר ...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice at JoVE.com

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בעכברים. תחת הרדמה, הלבבות העכבר היו מוחצן בחלל הבין-צלעי הרביעי. לאחר מכן, adenoviruses גנים ספציפיים קידוד הוזרקו מזרק לתוך שריר הלב, ואחריו מדידה ביטוי חלבון באמצעות הדמיה ויוו ומערביות כתם ניתוח.

שיטה פשוטה ויעילה In Vivo מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב באמצעות הזרקת Intramyocardial בעכברים

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

a-simple-efficient-method-for-vivo-cardiac-specific-gene-manipulation

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

15.7K Views.  The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בעכברים. תחת הרדמה, הלבבות העכבר היו מוחצן בחלל הבין-צלעי הרביעי. לאחר מכן, adenoviruses גנים ספציפיים קידוד הוזרקו מזרק לתוך שריר הלב, ואחריו מדידה ביטוי חלבון באמצעות הדמיה ויוו ומערביות כתם ניתוח.

Video: A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: שיטה פשוטה genotyping מדויק

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

בVivo siRNA Transfection וג&#39;ין מציאה בחוט השדרה באמצעות ראפיד פולשנית מותני intrathecal זריקות בעכברים

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

זריקות תוך ורידים בעכברים בילוד

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.