עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (DK55743, DK087377, DK102716 ו- HG006398 כדי S.A.D). ברצוננו להודות ד ר Behshad Pournasr, ד ר ג'יימס Heslop, רן ג'ינג על תרומתם.

1. התרבות של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent
<ol><li>
ציפוי רקומביננטי חלבון כימרי Fc E-קדהרין אנושי (E-cad-Fc) או אחרים מטריצות מתאים לתרבות hPSC 6<ol>
<li>לדלל E-cad-Fc כדי 15 μg/mL עם Dulbecco Phosphate-Buffered מלוחים המכילים סידן ומגנזיום (DPBS (+)).</li>
		<li>מעיל 100-מ מ הבולם מנות תרביות רקמה עם 5 מיליליטר מדולל E-cad-Fc, דגירה-37 הלעפה תרוטרפמט לפחות 1 ה' הסר המצע ולהחליף עם 5 מיליליטר בינונית (למשל, mTeSR1 כאל M-בינוני מעתה ואילך)7. הערה: המדיום תרבות בשימוש פרוטוקול זה מוכן לאחר שפורסמה בפרוטוקולים7. עם זאת, מספר תכשירים מדיה אחרים שתוארו, או זמינים מסחרית, כי הם כנראה תואם ההליך.</li>
		<li>אחזר בקבוקון של cryopreserved iPSCs של חנקן נוזלי. הפשרת-הלעפה תרוטרפמט 37 עד גביש קרח קטן נשאר. בעדינות פיפטה תאים לתוך סטרילי 15-mL חרוט צינור המכיל 4 מ"ל של M-המדיום.</li>
		<li>צנטריפוגה ב g 300 x 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע, בעדינות להשעות מחדש תאים עם 5 מ של המדיום בתוספת 10 מיקרומטר של Y-27632, מעכב סלקטיבי של רו-הקשורים, סליל מפותל המכילה חלבון (רוק).</li>
		<li>להסיר את M-בינוני שלב 1.1.2, ולהעביר 5 מ של תאים מהשלב 1.1.4 ל ההשעיה 100-מ מ E-cad-Fc-מצופה תרביות רקמה מנות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
שמירה על iPSCs האדם בתרבות
	<ol>
<li>ברגע iPSCs מגיע סביב 80% confluency, הסר בינוני תרבות ולשטוף פעם עם סידן, מגנזיום חופשית DPBS (-). האחות של DPBS (-) ומוסיפים כמות מספקת של 0.02% פתרון EDTA לכסות את הלוחות, ולאחר מכן תקופת דגירה של עד 3 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: ב- 80% הנהרות, הצלחת להכיל בסביבות 2 x 107 תאים. חשוב לא לגדול פרא ולהשתלט על התאים, וכדי להבטיח כי התאים שומרים על מורפולוגיה מובחן. Pluripotency של התאים יכול להיקבע על ידי צביעת תאי גזע סמן העכבר ל- 1-60 או שוות ערך8.</li>
		<li>ברגע והתאים מתחילים לשחרר, הסר את הפתרון EDTA 0.02%, להציף את המנה עם 10 מ"ל של M-מדיום כדי לשחרר את התאים. הסיוע של הניתוק בין iPSCs על ידי בעדינות pipetting. הערה: זמן הדגירה הממוצע עבור תאים לנתק בסביבות 3 דקות, אבל זה צריך להיקבע מדעית עבור כל קו iPSC. התאים שאמור להתפרסם בתור בקבוצות קטנות המכילות סביב 5-10 iPSCs לכל אשכול.</li>
		<li>העברת 1/10 של התאים על תנאי לכל טריים E-cad-Fc 100 מ מ מצופה ההשעיה מאכל תרביות רקמה המכיל 5 מ של M-המדיום. דגירה התרבויות-37 הלעפה תרוטרפמט מתחת לגיל 4% או2/5% CO2 ושינוי המדיום מדי יום. הערה: למרות iPSCs באופן שגרתי מתורבתים בתנאים פיסיולוגיים חמצן כדי לקדם את pluripotency, iPSCs ניתן גם לגדל באמצעות חמצן סביבתי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הבידול של האדם iPSCs לתאי Hepatocyte כמו צלחות 96-ובכן
הערה: סעיף זה מתאר את הבידול של iPSCs בתבנית התואמת ההקרנה. באמצעות גישה זו, זה אפשרי לגרום iPSCs האנושי כדי להבדיל ויוצרים תאים דמויי hepatocyte ב- 20 ימים. אמנם זה מתאים עבור רוב מבחני, ניתן להרחיב את האורך של תרבות כדי לשפר את הבגרות של התאים.
<ol><li>
ציפוי תרביות רקמה 96-ובכן צלחות עם מטריקס קרום המרתף מופחת גורם גידול
	<ol>
<li>הכן את המניה על ידי דילול המטריקס כדי 2 מ"ג/מ"ל עם קרח DMEM/F12 תרביות רקמה בבסיס, אמצעי סטרילי. לחלק את המטריצה 250 μL aliquots ולאחסן ב-80 הלעפה תרוטרפמט עד הנדרש. מקררים 10 מ"ל של DMEM/F12 בקרח במשך 30 דקות אחזר, μL aliquot של מניות מטריקס 2 מ"ג/מ"ל 250 ו הפשרה על קרח.</li>
		<li>משלבים את המטריקס עם 10 מ"ל של DMEM קר/F12 על ידי ערבוב בעדינות בעזרת פיפטה צוננת מראש כדי להפוך הריכוז הסופי של 0.05 מ"ג/מ"ל.</li>
		<li>העברת μL 100 של מטריקס מדולל כל טוב של צלחת תרביות רקמה 96-ובכן. דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2 לפחות 1 ה למחוק את המטריקס, להחליף μL 50 מ'-בינוני לכל טוב. לאחסן ב 37 מעלות צלזיוס, 4% או2/5% CO2 עד שהוא נדרש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צלחת תאים עבור בידול
	<ol>
<li>תרבות של iPSCs על צלחות 100-מ מ עד תאי זרימה 80%. ודא כי הצלחת מכיל 2 x 107 תאים. לקבוע את מספרי הטלפון הנייד על-ידי תאים זרימה cytometer או hemocytometer. הערה: עם ניסיון, האיכות של התאים iPSCs יכולה להישפט על ידי מיקרוסקופ; עם זאת, קרוב 98% של התאים צריך לבטא סמנים pluripotency כמו epitope טרה-1-60 כאשר נמדדת FACS או immunostaining. חשוב כי התאים נשארים החלוקה באופן פעיל, הם לא מגודלת.</li>
		<li>כדי לקצור את iPSCs של כל צלחת 100-מ מ, תשאף המדיום תרבות ולשטוף עם 5 מ של DPBS (-). החלף את השטיפה 3 מ"ל של פתרון ניתוק התא (למשל, accutase), תקופת דגירה של בערך 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 4% או2/5% CO2. הערה: חשוב לעקוב אחרי הניתוק של תאים באמצעות מיקרוסקופ. לא מעל תקציר עם accutase. המטרה היא לשחרר את התאים כמו בקבוצות קטנות עם טיפול מינימלי.</li>
		<li>ברגע התאים נתחיל לנתק, הקציר על-ידי הוספת 7 מ של M-המדיום. פיפטה מספר פעמים מביצועם המושבות תא לתוך בקבוצות קטנות של סביב 3-6 תאים (איור 1 א').</li>
		<li>לאסוף את iPSCs לתוך צנטריפוגה סטרילי 15-mL צינור צנטריפוגה ב g 300 x במשך 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע מחדש להשעות בגדר תא ב 5 מ ל ז-בינוני.</li>
		<li>פזר באופן שווה את התאים על גבי לוחות מצופים מטריצה 96-ובכן מאת pipetting 50 μL של תאים ההשעיה לבאר כל. כדי להגדיר את כל צלחת 96-ובכן, להשתמש בצלחת 100-מ מ אחד של iPSCs עם תאים על 80% confluency המכיל בסביבות 5 x 106 תאים כדי להתקין את הבידול. השתמש פיפטה רב-ערוצי כדי לזרז תהליך זה. התרבות התאים בן לילה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2. הערה: חשוב כי מספר שווה של תאים נצבר בכל טוב על מנת להבטיח differentiations לשחזור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
זירוז התמיינות של תאים
	<ol>
<li>לבחון את הצלחות 96-ובכן על ידי מיקרוסקופ כדי להבטיח תאים לפחות 70% מפני השטח של כל אדם טוב. אם הכיסוי הוא פחות מ- 70%, להחליף את המדיום בינונית טרייה, תקופת דגירה של h 24 נוספים הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2. הערה: המקננת תאים עבור יותר מ- 48 שעות לאחר ציפוי ללא גרימת בדרך כלל התמיינות מפחית את היעילות של בידול. בידול תתרחש גם באמצעות חמצן סביבתי, למרות היעילות עשוי להיות מושפע.
</li>
		<li>עבור 1 יום 2 יום של בידול, להחליף את המדיום תרבות RPMI בתוספת 2% B27 (ללא אינסולין), 100 ננוגרם למ"ל Activin A, 10 ננוגרם למ"ל BMP4 ו- 20 ng/mL FGF2. להוסיף 100 μL בינוני לכל טוב, דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, אמביינט O2/5% CO2 עם שינוי בינונית מדי יום במשך יומיים. הערה: התמודדות עם מספר גדול של צלחות 96-ובכן מחייבות השימוש של פיפטה בסיוע או רובוט. פיפטות 12 ערוצים וערוץ 96 הינם אידיאליים עבור שינוי בינונית מדי יום.</li>
		<li>יום 3-יום 5 של בידול, החלף המדיום תרבות עם RPMI בתוספת 2% B27 (ללא אינסולין) ו- 100 ננוגרם למ"ל Activin א התרבות תאים בחלק הלעפה תרוטרפמט 37, אמביינט O2/5% CO2 עם שינוי יומי בינונית למשך 3 ימים.</li>
		<li>ביום בידול 5, לפני החלפת טריים תרבות בינונית, לטפל בכל טוב עם 100 μL 0.02% EDTA פתרון עבור 30 s, אז הסרה והחלפה של טרי תרבות בינונית. הערה: אם בידול האנדודרם יעיל, טפט להבדיל תאים הוא נוטה פילינג מהצלחת. טיפול קצר עם פתרון EDTA 0.02% מסייע להקל על ניתוק התא. טיפול זה לא משפיע על בידול hepatocytes.</li>
		<li>עבור בידול בין 6 ימים ל- 10, להחליף את תרבות המדיום עם RPMI / 2% B27 (עם אינסולין) בתוספת 20 ng/mL BMP4 ו 10 ננוגרם למ"ל FGF2, דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2 במשך 5 ימים עם שינוי בינונית מדי יום. בשלב זה גורם לתאים להתמיין ובתאים הכבד.</li>
		<li>עבור בידול בין הימים 11 עד 15, החלף המדיום תרבות עם RPMI / 2% B27 (עם אינסולין) בתוספת 20 ng/mL דבורה שחר. דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2 במשך 5 ימים עם שינוי בינונית מדי יום.</li>
		<li>עבור בידול בין ימים 16 ל-20, החלף המדיום תרבות hepatocyte תא תרבות בינוני (HCM) בתוספת 20 ng/mL של Oncostatin-M (OSM). דגירה התאים-הלעפה תרוטרפמט 37, אמביינט O2/5% CO2 בשינוי בינונית מדי יום במשך 5 ימים. הערה: הפארמצבטית אבחנה בין בארות בודדים ביעילות יכול להיקבע על ידי מדידה לרמת אלבומין, AFP או APOB ומופרש אל המדיום מאת אליסה (ראה 3.2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ההקרנה מולקולה קטנה
הערה: להלן תיאור ההליך המשמש לזיהוי תרכובות יכול לשמש כדי להוריד את רמת APOB במדיום של תאים hepatocyte דמוי נגזר היפרכולסטרולמיה משפחתית iPSCs. תיאור של הדגם והשימוש הזיהוי של תרופות להורדת כולסטרול שתיארנו ב פירוט בעבר5,9. בדוגמה הנוכחית, הוקרנו תרכובות 1,000 מתוך ספריית אוסף במתחם דרום קרוליינה (SC3). כל המתחם נבחנה על ריכוז של 2 μg/mL.
<ol><li>
טיפול iPSC - נגזר hepatocytes עם מולקולות קטנות
	<ol>
<li>לדלל הספרייה מתחם ראשיים לייצר הצלחות של מניות לעבוד עם תרכובות-ריכוז של 20 μg/mL 2% דימתיל סולפוקסיד וחנות ב-20 הלעפה תרוטרפמט.</li>
		<li>להכין מספיק צלחות 96-ובכן נגזר iPSC hepatocytes כדי לאפשר לכל מתחם להיבדק. הערה: מספר תרכובות שיוקרנו יכתיב את מספר הצלחות 96-ובכן הנדרשים. באופן כללי, סינגל טוב צריכים להיות מוכנים כל בארות מורכבים, בתוספת נוספים עבור כל דגימות הבקרה. הבארות החיצוני ביותר של הצלחת הם נמנעו בדרך כלל כדי לצמצם את האפשרות של אפקטים קצה יכולים להשחית פרשנות. ניתן לזהות פגיעות בשיטת ניקוד-z ללא הצורך להשתמש משכפל. אם משכפל כלולים, זה מתאים יותר להשתמש במבחן t.</li>
		<li>בסיום בידול (יום 20, ראה 2.3.7), להחליף את המדיום תרבות μL 100 של HCM טריבתוספת 20 ng/mL של Oncostatin-M. דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, 4% או2/5% CO2 עבור בדיוק 24 ח' לאחזר המדיום תרבות לתוך צלחת 96-ובכן טריים בחנות ב-20 הלעפה תרוטרפמט. להשתמש דגימה זו כדי לחשב את רמת APOB במדיום לפני התוספת של סמים.</li>
		<li>הוסף μL 90 של HCM טרי בתוספת 20 ng/mL של Oncostatin-M כל טוב. להוסיף 10 μL של כל המתחם מן המלאי לעבוד לאחר ערבוב על-ידי pipetting. להוסיף דימתיל סולפוקסיד 0.2% כדי לשלוט בארות כדי להתאים את הריכוז הסופי הדגימות שטופלו ואת דגירה-הלעפה תרוטרפמט 37, אמביינט O2/5% CO2 עבור בדיוק 24 ה לאסוף המדיום תרבות ולאחסן ב-20 הלעפה תרוטרפמט. השתמש דגימה זו כדי לקבוע את מידת APOB לאחר הטיפול עם תרכובות.</li>
		<li>אופציונלי - ניתן לעבד את התאים הנותרים עבור immunostaining, תא הכדאיות או ניתוחים של רמות ה-mRNA באמצעות גישות סטנדרטי. הערה: מסך זה נועד לזהות תרופות הייתה השפעה מהירה על APOB רמות. עם זאת, בהתאם המודל של המחלות, מבחני במורד הזרם, או מנגנון הפעולה של התרופה, זה עשוי להיות מועיל להתייחס המדגם במשך מספר ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לקבוע רמות APOB מאת אליסה
	<ol>
<li>לקבוע אפוליפופרוטאין B (APOB) ריכוז של שתי התרופות שלאחר קדם, דגימות שטופלו באמצעות ערכת פיתוח אנושי APOB אליסה בעקבות הפרוטוקולים של היצרן.</li>
		<li>
הכנת את הפתרונות הבאים
		<ol>
<li>מאגר לשטוף, המורכב 0.05% 20 Tween ב- PBS, pH 7.4. חנות-הלעפה תרוטרפמט 4 עד השימוש.</li>
			<li>מאגר דגירה, מורכב של 0.05% Tween 20 ו- 0.1% שור אלבומין (BSA) ב- PBS, pH 7.4. חנות-הלעפה תרוטרפמט 4 עד השימוש.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין נוגדן APOB (mAB 20/17) על ידי דילול עד 2 µg/מ"ל ב- PBS, pH 7.4. להוסיף 100 μL של הנוגדן מדולל לכל טוב, דגירה-הלעפה תרוטרפמט 4 בן לילה.</li>
		<li>להסיר את הנוגדן הלוחות assay ולשטוף היטב פעמיים עם μL 200 ל- PBS, pH 7.4.</li>
		<li>להוסיף 200 μL/טוב של 0.05% Tween 20, 0.1% שור אלבומין (BSA) ב- PBS, pH 7.4 דגירה על פלטפורמה חזק לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להכין מעגל מתומן רגיל באמצעות BSA Tween 20 ו- 0.1% 0.05% ב- PBS, pH 7.4 עם ריכוזי APOB הבאים: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ננוגרם למ"ל, 150 ng/mL, ננוגרם למ"ל 125, 100 ננוגרם למ"ל, 75 ng/mL, ו 50 ng/mL.</li>
		<li>לדלל את הבדיקה דגימות 1:4 עם BSA Tween 20 ו- 0.1% 0.05% ב- PBS, pH 7.4.</li>
		<li>לאחר h 1 של חסימת עם מאגר דגירה, לבטל את המאגר, לשטוף צלחות assay חמש פעמים עם 200 μL של 0.05% 20 Tween ב- PBS, pH 7.4.</li>
		<li>לחלוטין להסיר כל מאגר כביסה שיורית, להעביר 90 μL של הדגימות מדולל ותקנים APOB הלוחות וזמינותו. דגירה בטמפרטורת החדר על מטרף לשעה.</li>
		<li>למחוק את הדגימה. ולשטוף עם 200 μL 0.05% 20 Tween ב- PBS, pH 7.4 לכל טוב. חזור שוטף סך של 5 פעמים. הוסף μL 100 לכל טוב של LDL mAB 11-ביוטין 1:1,000 מדולל ב- BSA Tween 20 ו- 0.1% 0.05% ב- PBS, pH 7.4. דגירה בטמפרטורת החדר על פלטפורמה חזק עבור 1 h.</li>
		<li>למחוק הכימית ולשטוף עם μL 200 לאדם טוב כביסה מאגר 5 פעמים. להוסיף μL 100 לכל טוב של נוגדן Streptavidin-HRP (1:1, 000 דילול באמצעות מאגר הדגירה), ואז דגירה בטמפרטורת החדר על פלטפורמה חזק עבור 1 h.</li>
		<li>למחוק הכימית ולשטוף עם 200 μL 0.05% 20 Tween ב- PBS, pH 7.4 לכל טוב. חזור שוטף סך של 5 פעמים. לחלוטין להסיר את המאגר כביסה שיורית הלוחות assay, להוסיף μL 100 לכל טוב של Tetramethylbenzidin (שוייץ) המצע פתרון, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 8 דקות.</li>
		<li>מבלי להסיר את המצע שוייץ, להוסיף ישירות μL 100 לכל טוב של להפסיק פתרון (1N HCl).</li>
		<li>לקבוע את ספיגת ב 450 nm שימוש בקורא צלחת.</li>
		<li>עיקול רגיל ניתן ליצור, באמצעות שיטת ארבע פרמטר רגרסיה לוגיסטית, ואז להשתמש כדי להגדיר את ריכוז APOB כל מדגם10.</li>
		<li>לבחון את התרופה קדם: היחס בין סמים שלאחר APOB בכל מדגם לזהות תרכובות עם פוטנציאל להורדת APOB רמות במדיום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered?.">How were new medicines discovered?.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sources+for+in+vitro+human+liver+cell+culture+models.">Cell sources for in vitro human liver cell culture models.</a> Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).</li><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy.">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drug+Screen+using+Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveals+Cardiac+Glycosides+as+a+Potential+Treatment+for+Hypercholesterolemia.">A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).</li><li>Nagaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin-coated+plates+maintain+pluripotent+ES+cells+without+colony+formation.">E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation.</a> PLoS One. 1, e15 (2006).</li><li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative.</a> Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JD+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+faithfully+recapitulate+the+pathophysiology+of+familial+hypercholesterolemia.">JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia.</a> Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).</li><li>DeSilva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+bioanalytical+method+validation+of+ligand-binding+assays+to+support+pharmacokinetic+assessments+of+macromolecules.">Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules.</a> Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).</li><li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin.">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li><li>Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+pluripotent+stem+cells+using+completely+defined+conditions+on+a+recombinant+E-cadherin+substratum.">Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum.</a> BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo.">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Cell-Surface+N-Glycoproteome+of+Human+Hepatocytes+Reveals+Markers+for+Selecting+a+Homogeneous+Population+of+iPSC-Derived+Hepatocytes.">Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustration+of+SSMD,+z+score,+SSMD*,+z*+score,+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens.">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).</li><li>Lorenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Neural+Progenitors+Are+an+Effective+Drug+Discovery+Model+for+Neurological+mtDNA+Disorders.">Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Lu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+progenitor+cells+of+biliary+origin+with+liver+repopulation+capacity.">Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity.</a> Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+cholangiocytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation.">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).</li><li>Mallanna, S. K., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Pashos, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Population+Cohorts+of+hiPSCs+and+Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveal+Functional+Genetic+Variation+at+Blood+Lipid-Associated+Loci.">Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).</li><li>Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+liver+cells+for+drug+testing+and+disease+modeling.">Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling.</a> Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).</li><li>Choi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+drug+screening+and+gene+correction+for+treating+liver+disease+using+patient-specific+stem+cells.">Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells.</a> Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).</li><li>Tafaleng, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+model+personalized+variations+in+liver+disease+resulting+from+alpha1-antitrypsin+deficiency.">Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency.</a> Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).</li><li>Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+reveals+that+HSP90beta+promotes+the+conversion+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endoderm+to+a+hepatic+fate+and+regulates+HNF4A+turnover.">A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover.</a> Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

היעד המבוסס על גילוי תרופות, שבה מולקולות קטנות מזוהים המשפיעים על הפעילות של חלבון ספציפי, הייתה המוקד של מאמצים רבים ההקרנה הקיים. אף-על-פי גישה זו סיפקה תרופות רבות, מסכי בהתבסס על היפוך של פנוטיפ, פרמקולוגיה קלאסית, היה מוצלח יותר בזיהוי הראשון ב- class שאמורות להיות אפקטיבי קלינית<sup class="xr...

הצלחה בזיהוי סמים יכול לשמש למטרה מחלה נדירה מסתמך על התפתחות מבחני שיכול לשמש להקרנה. ההשערה או מסכי קליעה (פרמקולוגיה הפוכה) שימושיות, אך דורשות הבנה מפורטת של הבסיס המולקולרי של המחלה. מסכי פנוטיפי (פרמקולוגיה קלאסית) למנוע את הצורך הבנה מפורטת של משעולים הביוכימי, אך במקום להסתמך על פיתוח מודלים במדויק במראה הפתופיזיולוגיה של המחלה. למרות ההתלהבות עבור גישות קליעה, ניתוחים של ה-FDA אישר הראשון ב- class סמים חושפים כי המסכים פנוטיפי היה הרבה יותר מוצלח1. המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור פלטפורמה עבור תפוקה גבוהה הקרנת זה יכול לשמש כדי לזהות מולקולות קטנות לטיפול של מחלת כבד מטבולית. מספר מודלים במבחנה תוארו כולל hepatocytes העיקרי, הפטומה היא תאים תאים בכבד קדמון2. אולם, רוב המודלים האלה יש מגבלות, יש צורך עבור דגמים חדשים אשר ניתן לסכם במדויק הפתופיזיולוגיה של חילוף החומרים בכבד ליקויים בתרבות. לאחרונה, תאי גזע pluripotent האדם בשילוב עם ג'ין עריכה הציעו הזדמנות לדגמן אפילו הנדירים של מחלות נדירות בתרבות ללא הצורך לחולים גישה ישירות3. בעת השימוש iPSCs החולה הספציפי כפי כלי כדי לגלות מולקולות קטנות לטיפול של מחלות כבד נדירה סביר מבחינה מושגית, יש רק כמה דוחות הממחיש את הכדאיות של גישה זו4. עם זאת, לאחרונה הקמנו פלטפורמה שהיו הנגזרות iPSC hepatocytes בהצלחה לזהות תרופות שניתן יהיה לשנות את ייעודו לטיפול של ליקויים מטבוליזם בכבד5.
פרוטוקול זה מסביר את התהליך של הבחנה אנושית iPSCs לתאים hepatocyte כמו צלחות 96-ובכן ושימוש בהם למסך ספריה של מולקולות קטנות. הוא גם מתאר את הניתוח קצה היפרכולסטרולמיה כדוגמא של מחלת כבד מטבולית. גישה זו צריך להיות שימושי ללמוד את התפקידים ואת היישום של מולקולות קטנות בהקשר של מחלת כבד זיהומיות, מחלות כבד מטבולית, רעילות התרופה ובהפרעות כבד אחרות.

<table><tbody><tr><td>100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>96-wells tissue culture plate&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Albumin</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human FOXA2(6C12)</td><td>Novus Biological</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human HNF4 alpha</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Oct-3/4 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human SOX17</td><td>R&amp;amp;D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Activin A Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, minus insulin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serum free&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4 Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent StemPro&amp;nbsp; Accutase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+(calcium, magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-(no calcium, no magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>ELISA human APOB ELISA development kit</td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Growth Factor&amp;nbsp; (HGF)</td><td>Invitrogen</td><td>PHC0321</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc)</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA Substrate Solution</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Versene (EDTA) 0.02%&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK inhibitor</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells for drug discovery

היכולת להבחין בתאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSCs) לתוך תאים, כמו hepatocyte (HLCs) מספק הזדמנויות חדשות ללמוד שגיאות מולדות בחילוף החומרים הכבד. עם זאת, כדי לספק פלטפורמה שתומכת הזיהוי של מולקולות קטנות פוטנציאלי יכול לשמש לטיפול במחלות כבד, ההליך דורש תבנית התרבות תואמת הקרנת אלפי תרכובות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשתמש בתנאים מוגדרים לגמרי תרבות, אשר מאפשרים את הבידול לשחזור של האדם iPSCs לתאים hepatocyte כמו צלחות תרביות רקמה 96-ובכן. אנו מספקים גם דוגמה לשימוש את הפלטפורמה כדי תרכובות מסך בשל יכולתן להוריד אפוליפופרוטאין B (APOB) המופק נגזר iPSC hepatocytes שנוצר מן המטופל היפרכולסטרולמיה משפחתית. הזמינות של פלטפורמה מתאימה ל גילוי תרופות צריך לאפשר לחוקרים לזהות את הריפוי מחלות המשפיעות על הכבד.

דור של hepatocyte - כמו תאים: איור 1 מתאר את פרק הזמן של השינויים המתרחשים במהלך הבידול של iPSCs האנושי לתאים, כמו hepatocyte. התרבות של iPSCs על ה-Cad-Fc מספק כ- 2 מ מ קוטר מושבות המבטאים את סמן pluripotent OCT4 (איור 1 א'-ב'). המורפולו...

Watch this Scientific Journal Video about Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery at JoVE.com

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

פרוטוקול המובאת כאן מתאר פלטפורמה לזיהוי מולקולות קטנות לטיפול של מחלת כבד. תיאור שלב אחר שלב מוצגת המפרט איך להבדיל iPSCs לתוך תאים בעלי מאפיינים hepatocyte ב 96-ובכן צלחות, כדי להשתמש בתאים על המסך עבור מולקולות קטנות עם פוטנציאל פעילות טיפולית.

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K Views.  Medical University of South Carolina. פרוטוקול המובאת כאן מתאר פלטפורמה לזיהוי מולקולות קטנות לטיפול של מחלת כבד. תיאור שלב אחר שלב מוצגת המפרט איך להבדיל iPSCs לתוך תאים בעלי מאפיינים hepatocyte ב 96-ובכן צלחות, כדי להשתמש בתאים על המסך עבור מולקולות קטנות עם פוטנציאל פעילות טיפולית.

Video: Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

יצור אוטומטי למחצה של Hepatocyte כמו תאים מתאי גזע Pluripotent

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

סרום חינם הפקת מימדים תלת-ממדיים של האדם בתאי גזע חזקים

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Biology

Integrative Protocol for Generation of iPSC-Derived 3D Human Hepatic Organoids

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate 3D cultures of human hepatic organoids (HHOs). The utilization of HHOs offers a valuable approach to understanding liver development, unraveling liver diseases, conducting high-throughput studies for drug development, and exploring the potential for liver transplantation. In the former investigation, through immunofluorescence and quantitative RT-PCR techniques, the progression was monitored, identifying the presence of various cell populations, such as hepatoblasts and the two types of hepatoblast-derived cells: cholangiocytes or hepatocyte-like cells, across different developmental stages. This report presents a straightforward 3D protocol starting from hiPSC to acquire HHOs that mirror the stages of human embryo development. The protocol, spanning 46-50 days, encompasses several steps: (i) meticulous management of hiPSC culture to generate HHOs, (ii) initiation of cell differentiation in 2D and the subsequent transition to 3D, and (iii) an optimized dissociation strategy to break down HHOs into single cells for single-cell RNA sequencing. As an illustration of the broad applications of this approach, the present protocol was previously applied to unravel the role of thyroid hormone signaling in developing liver cells.

Human iPSC-derived 3D hepatic organoids constitute a potential tool for understanding the thyroid hormone's action on liver development.

פרוטוקול אינטגרטיבי ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים בכבד אנושי שמקורם ב-iPSC

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Bioengineering

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

שיטה יעילה לאינדוקציה מכוונת של תאים דמויי הפטוציטים מתאי גזע עובריים אנושיים

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Immunology and Infection

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

מפרט פרוגניטור בכבד מתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות מערכת בידול מוגדרת

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

טיהור הפטוציטים שמקורם ב-iPSC בבני אדם על ידי מיון מיטוכונדריאלי-ALCAM

Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely diseased organs due to their unlimited proliferation and pluripotent properties. However, differentiating human ES/iPS cells into 100% pure target cell types is challenging due to their high sensitivity to the environment. Tumorigenesis after transplantation is caused by contaminated, proliferating, and undifferentiated cells, making high-purification technology essential for the safe realization of regenerative medicine. To mitigate the risk of tumorigenesis, a high-purification technology has been developed for human iPS cell-derived hepatocytes. The method employs FACS (fluorescence-activated cell sorting) using a combination of high mitochondrial content and the cell-surface marker ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule) without genetic modification. 97% &plusmn; 0.38% (n = 5) of the purified hepatocytes using this method exhibited albumin protein expression. This article aims to provide detailed procedures for this method, as applied to the most current two-dimensional differentiation method for human iPS cells into hepatocytes.

מחבר זרקור: קידום טיהור הפטוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם לרפואה רגנרטיבית

Hepatocytes derived from pluripotent stem cells can be purified through cell sorting, using a combination of mitochondrial and activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM, also known as CD166) staining.

יישום צביעת מיטוכונדריה חיה במיון תאים לטיהור הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely ...