Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 e HG006398 de S.A.D.). Gostaríamos de agradecer o Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop e Jing Ran pelas suas contribuições.

1. cultura de humanos induzida por células-tronco pluripotentes
<ol><li>
Revestimento recombinante humano E-caderina Fc proteína da fusão (E-cad-Fc) ou outras matrizes apropriados para cultura hPSC 6<ol>
<li>Dilua E-cad-Fc a 15 μg/mL com Phosphate-Buffered salina de Dulbecco contendo cálcio e magnésio (DPBS (+)).</li>
		<li>Casaco pratos de cultura de tecidos de suspensão de 100 mm com 5 mL de diluídos E-cad-Fc e incubar a 37 ˚ c pelo menos 1 h. substrato de remover e substituir com 5 mL de meio (por exemplo, mTeSR1 conhecido como M-médio doravante)7. Nota: O meio de cultura utilizado neste protocolo é preparado seguindo protocolos publicados7. No entanto, várias outras preparações de mídia têm sido descritas, ou estão disponíveis comercialmente, que são provável compatível com o procedimento.</li>
		<li>Recupere um frasco de iPSCs criopreservado de nitrogênio líquido. Descongelar em 37 ˚ c até um cristal de gelo pequeno permanece. Delicadamente, pipete células para um tubo cônico de 15 mL estéril contendo 4 mL do meio-de-M.</li>
		<li>Centrifugar a 300 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e gentilmente re-suspender as células com 5 mL do meio suplementado com 10 µM de Y-27632, um inibidor seletivo de Rho-associado, coiled-coil contendo proteína quinase (ROCK).</li>
		<li>Remova o M-médio da etapa 1.1.2 e transferir 5ml de células da etapa 1.1.4 para pratos de cultura de tecidos E-cad-Fc-revestido-100mm suspensão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Manutenção de iPSCs humano na cultura
	<ol>
<li>Uma vez iPSCs chegar em torno de 80% confluência, remover o meio de cultura e lave uma vez com cálcio e magnésio livre DPBS (-). Aspirar o DPBS (-) e adicionar uma quantidade suficiente de solução de EDTA 0,02% para cobrir as placas e, em seguida, incubar por até 3 min. à temperatura ambiente. Nota: Na confluência de 80%, a placa deve conter em torno de 2 x 107 células. É importante não para overgrow as células e para garantir que as células retêm uma morfologia indiferenciada. A pluripotência das células pode ser determinada pela coloração com marcador de células-tronco Tra-1-60 ou equivalente8.</li>
		<li>Quando as células começam a liberar, a remoção da solução de EDTA 0,02% e inundar o prato com 10 mL do meio-M a liberar as células. Ajuda o desprendimento de iPSCs pipetando suavemente. Nota: O tempo de incubação médio de células desanexar é em torno de 3 min, mas isso precisa ser determinada empiricamente, para cada linha de iPSC. As células devem ser lançadas como pequenos grupos contendo em torno de 5-10 iPSCs por cluster.</li>
		<li>Transferi 1/10 das células suspensas por fresca prato de cultura de tecidos suspensão de E-cad-Fc de revestido 100 mm, contendo 5 mL do meio-de-M. Incubar as culturas a 37 ˚ c abaixo dos 4% O25% CO2 e meio de mudança diariamente. Nota: Embora iPSCs rotineiramente são cultivadas em condições fisiológicas de oxigênio para promover a pluripotência, iPSCs também podem ser cultivadas usando oxigênio ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. diferenciação de iPSCs humana de hepatócitos células em placas de 96 poços
Nota: Esta seção descreve a diferenciação das iPSCs em um formato que é compatível com o rastreio. Usando essa abordagem, é possível induzir iPSCs humana para diferenciar e formar células hepatócito em 20 dias. Enquanto isto é adequado para a maioria dos ensaios, o comprimento da cultura pode ser estendido para melhorar a maturidade das células.
<ol><li>
Revestimento de placas de cultura de tecidos de 96 poços com matriz de membrana basal de fator de crescimento reduzido
	<ol>
<li>Prepare o estoque diluindo a matriz a 2 mg/mL com gelada meio de cultura de tecido DMEM/F12 estéril. Dividir a matriz em 250 alíquotas μL e armazenar no-80 ˚ c Membros até necessária. Fica frio 10 mL de DMEM/F12 no gelo por 30 min. recuperar um 250 μL parte alíquota do estoque de matriz de 2 mg/mL e degelo no gelo.</li>
		<li>Combine a matriz com 10 mL de DMEM/F12 frio, misturando delicadamente com uma pipeta previamente refrigerada tornar-se uma concentração final de 0,05 mg/mL.</li>
		<li>Transferi 100 μL de matriz diluído a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Incubar a 37 ˚ c, 4% O25% CO2 pelo menos 1 h. elimine a matriz e substitua com 50 μL de M-médio por bem. Armazenar a 37 ° C, 4% O25% CO2 até que seja necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Células de placa para diferenciação
	<ol>
<li>Cultura de iPSCs em placas de 100-mm até as células aproximam confluência de 80%. Certifique-se de que o prato contém cerca de 2 x 107 células. Determine o número de células por célula citômetro de fluxo ou hemocytometer. Nota: Com a experiência, a qualidade das células iPSCs pode ser julgada por microscopia; no entanto, cerca de 98% das células deve expressar pluripotência marcadores como o epítopo TRA-1-60, quando medido pela FACS ou immunostaining. É importante que as células permanecem ativamente dividindo e não estão abandonadas.</li>
		<li>Para colher as iPSCs de cada prato 100mm, Aspire o meio de cultura e enxágue com 5 mL de DPBS (-). Substituir o enxágue com 3 mL de solução de desprendimento de células (por exemplo, accutase) e incube por cerca de 2 min a 37 ° C, 4% O25% CO2. Nota: É importante seguir o desprendimento das células por microscopia. Fazer não digerir com accutase. O objetivo é liberar as células como pequenos grupos com tratamento mínimo.</li>
		<li>Quando as células começam a desanexar, colheita, adicionando 7 mL do meio de M. Pipetar várias vezes para dissociar as colônias de células em pequenos grupos de ao redor 3-6 células (figura 1A).</li>
		<li>Colete as iPSCs em um tubo de centrífuga estéril 15 mL e centrifugar a 300 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 5 mL M-médio.</li>
		<li>Distribua uniformemente as células em placas de 96 poços revestidos matriz por pipetagem 50 μL de células de suspensão para cada poço. Para configurar cada placa de 96 poços, use uma placa de 100-mm de iPSCs com células em aproximadamente 80% confluência que contém em torno de 5 x 106 células para configurar a diferenciação. Use uma pipeta multicanal para acelerar este processo. Cultura das células durante a noite em 37 ˚ c, 4% O25% CO2. Nota: É importante que um número igual de células é depositado em cada poço para garantir diferenciações podem ser reproduzidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induzir a diferenciação das células
	<ol>
<li>Examine as placas de 96 poços por microscopia para garantir que as células cobrem pelo menos 70% da superfície de cada bem. Se a cobertura é inferior a 70%, substitua o meio meio fresco e incubar por um adicional 24h em 37 ˚ c, 4% O25% CO2. Nota: Incubar as células para mais de 48 h após chapeamento sem induzir a diferenciação comumente reduz a eficiência de diferenciação. Diferenciação também ocorrerá usando oxigênio ambiente, embora a eficiência pode ser afetado.
</li>
		<li>Para o dia 1 a dia 2 de diferenciação, substitua o meio de cultura RPMI suplementado com 2% B27 (sem insulina), 100 ng/mL Activin A 10 ng/mL BMP4 e 20 ng/mL FGF2. Adicionar 100 μL de médio por bem e incubar a 37 ˚ c, em ambiente O25% CO2 com uma mudança diária média para 2 dias. Nota: Lidar com grandes números de placas de 96 poços requerem o uso de uma pipeta assistida ou robô. pipetas de 12 canais e 96 canais são ideais para mudança de média diária.</li>
		<li>Por dia 3 a 5 dias de diferenciação, a substituir o meio de cultura com RPMI suplementado com 2% B27 (sem insulina) e 100 ng/mL Activin A. Culture células em 37 ˚ c, em ambiente O25% CO2 com mudança média diária por 3 dias.</li>
		<li>No dia de diferenciação 5, antes de substituir com meio de cultura fresco, tratar cada bem com solução EDTA 100 μL 0,02% por 30 s, em seguida, remover e substituir com meio de cultura fresco. Nota: Se a diferenciação a endoderme é eficiente, a monocamada de diferenciar células é propensa a casca da placa. Um breve tratamento com solução de EDTA 0,02% ajuda a aliviar o desprendimento de células. Este tratamento não afeta a diferenciação de hepatócitos.</li>
		<li>Para a diferenciação entre os dias 6 a 10, substitua o meio de cultura com RPMI / 2% B27 (com insulina) suplementado com 20 ng/mL BMP4 e 10 ng/mL FGF2 e incubar a 37 ˚ c, 4% O25% de CO2 por 5 dias com mudança de média diária. Nesta fase induz células de se diferenciar em células progenitoras hepática.</li>
		<li>Para a diferenciação entre os dias 11 a 15, substitua o meio de cultura com RPMI / 2% B27 (com insulina) suplementado com 20 ng/mL HGF. Incube a 37 ˚ c, 4% O25% de CO2 por 5 dias com mudança de média diária.</li>
		<li>Para a diferenciação entre os dias 16 a 20, substitua o meio de cultura com um meio de cultura de células do hepatócito (HCM) suplementado com 20 ng/mL de Oncostatin M (OSM). Incube as celulas em 37 ˚ c, em ambiente O25% CO2 com mudança média diária por 5 dias. Nota: Reprodutibilidade da diferenciação entre poços individuais com eficiência pode ser determinada medindo-se o nível relativo de albumina, AFP ou APOB secretada para o meio por ELISA (ver 3.2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. pequena molécula triagem
Nota: A seguir descreve o procedimento usado para identificar compostos que podem ser usados para diminuir o nível de APOB no meio dos hepatócitos células derivadas de iPSCs hipercolesterolemia familiar. Uma descrição do modelo e seu uso na identificação de drogas para reduzir o colesterol tem sido descrita em detalhe anteriormente5,9. No exemplo atual, 1.000 compostos da biblioteca de coleção de compostos de Carolina do Sul (SC3) foram projectados. Cada composto foi testado em uma concentração de 2 μg/mL.
<ol><li>
Tratamento de iPSC - derivada de hepatócitos com pequenas moléculas
	<ol>
<li>Dilua a mestre biblioteca composta para gerar placas de ações de trabalho com compostos em uma concentração de 20 μg/mL em 2% DMSO e loja-20 ˚ c.</li>
		<li>Prepare-se bastante placas de 96 poços de iPSC-derivado de hepatócitos para permitir que cada composto a ser testado. Nota: O número de compostos será projectado irá ditar o número de placas de 96 poços que são necessárias. Em geral, um único bem deve estar preparado para cada composto, além de adicionais poços para qualquer controle de amostras. Os poços ultraperiféricas da placa geralmente são evitados para reduzir a possibilidade de efeitos de borda que pode corromper a interpretação. Correspondências podem ser identificadas usando o método de pontuação z sem a necessidade de usar repetições. Se réplicas estão incluídas, é mais apropriado usar o teste t.</li>
		<li>Após a conclusão da diferenciação (ver 20, do dia 2.3.7), substituir o meio de cultura com 100 μL de HCM frescosuplementado com 20 ng/mL de Oncostatin M. Incubar a 37 ˚ c, 4% O25% CO2 para exatamente 24 h. recupere o meio de cultura para uma nova placa de 96 poços e loja-20 ˚ c. Use esse exemplo para calcular o nível de APOB no meio antes da adição de drogas.</li>
		<li>Adicione 90 μL do HCM fresco suplementado com 20 ng/mL de Oncostatin M em cada poço. Adicione 10 μL de cada composto do estoque trabalho após a mistura por pipetagem. Adicionar DMSO para 0,2% para controlar os poços para coincidir com a concentração final nas amostras tratadas e incubar a 37 ˚ c, ambiente O25% CO2 para exatamente 24 h. recolher o meio de cultura e armazenar a-20 ˚ c. Use esse exemplo para determinar o nível de APOB após o tratamento com compostos.</li>
		<li>Opcional - as células restantes podem ser processadas por imunocoloração, viabilidade celular ou análises dos níveis de mRNA usando abordagens padrão. Nota: Esta tela foi projetada para identificar drogas que tinham um efeito rápido em níveis APOB. No entanto, dependendo do modelo de doença, ensaios a jusante ou mecanismo de ação de drogas, pode ser benéfico tratar a amostra por vários dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinar os níveis APOB por ELISA
	<ol>
<li>Determine a concentração da apolipoproteína B (APOB) ambos pré e pós-drogas tratadas das amostras de usando um kit de desenvolvimento humano APOB ELISA seguindo o protocolo do fabricante.</li>
		<li>
Preparando as seguintes soluções
		<ol>
<li>Tampão de lavagem, composto de 0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,4. Armazene a 4 ˚ c até o uso.</li>
			<li>Tampão de incubação, composto de 0,05% Tween 20 e 0,1% albumina de soro bovino (BSA) em PBS, pH 7,4. Armazene a 4 ˚ c até o uso.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare o anticorpo APOB (mAB 20/17) diluindo a 2 µ g/mL de PBS, pH 7,4. Adicionar 100 μL do anticorpo diluído por bem e incubar a 4 ˚ c durante a noite.</li>
		<li>Retire o anticorpo as chapas de ensaio e lave cada uma bem duas vezes com 200 µ l de PBS, pH 7,4.</li>
		<li>Adicionar 200 μL/poço de 0,05% Tween 20, 0,1% albumina de soro bovino (BSA) em PBS, pH 7,4 e incubá-los em uma plataforma de agitação por 1h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar uma curva padrão de 8 pontos usando 0,05% Tween 20 e 0,1% BSA em PBS, pH 7,4, com as seguintes concentrações de APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL e 50 ng/mL.</li>
		<li>Dilua as amostras de teste 1:4 com 0,05% de Tween 20 e 0,1% BSA em PBS, pH 7,4.</li>
		<li>Após 1 h de bloqueio com tampão de incubação, descartar o buffer e lave as placas de ensaio cinco vezes com 200 μL de 0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,4.</li>
		<li>Completamente remover qualquer tampão de lavagem residual e transferir 90 μL das amostras diluídas e os padrões APOB para as placas de ensaio. Incube a temperatura ambiente em um agitador por 1h.</li>
		<li>Descartar a amostra e lavar com 200 μL 0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,4 por bem. Repita as lavagens um total de 5 vezes. Adicione 100 μL por poço de mAB LDL 11-biotina 1:1,000 diluído em 0,05% Tween 20 e 0,1% BSA em PBS, pH 7,4. Incube a temperatura ambiente em uma plataforma de agitação por 1h.</li>
		<li>Descartar o reagente e lave com 200 μL por bem buffer de lavar 5 vezes. Adicionar 100 μL por poço de anticorpo Streptavidin HRP (1:1, 000 diluição usando buffer de incubação), então incubar a temperatura ambiente em uma plataforma de agitação por 1h.</li>
		<li>Descartar o reagente e lave com 200 μL 0,05% Tween 20 em PBS, pH 7,4 por bem. Repita as lavagens um total de 5 vezes. Completamente Retire o tampão de lavagem residual as chapas de ensaio adicionar 100 μL por poço da solução de substrato Tetramethylbenzidin (TMB) e incubar a temperatura ambiente por 8 min.</li>
		<li>Sem retirar o substrato TMB, diretamente Adicione 100 μL por poço da solução de paragem (1N HCl).</li>
		<li>Determinar a absorvância a 450 nm, utilizando um leitor de placa.</li>
		<li>Uma curva padrão pode ser estabelecida, usando o método de regressão logística de quatro parâmetro e, em seguida, usado para definir a concentração de APOB em cada amostra10.</li>
		<li>Examinar a pre-droga: pós-droga proporção de APOB em cada amostra para identificar compostos com potencial para diminuir a APOB níveis no meio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Pashos, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Population+Cohorts+of+hiPSCs+and+Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveal+Functional+Genetic+Variation+at+Blood+Lipid-Associated+Loci.">Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).</li><li>Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+liver+cells+for+drug+testing+and+disease+modeling.">Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling.</a> Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).</li><li>Choi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+drug+screening+and+gene+correction+for+treating+liver+disease+using+patient-specific+stem+cells.">Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells.</a> Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).</li><li>Tafaleng, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+model+personalized+variations+in+liver+disease+resulting+from+alpha1-antitrypsin+deficiency.">Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency.</a> Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).</li><li>Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+reveals+that+HSP90beta+promotes+the+conversion+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endoderm+to+a+hepatic+fate+and+regulates+HNF4A+turnover.">A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover.</a> Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).</li></ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Alvo baseado descoberta de drogas, onde as moléculas pequenas são identificadas que influenciam a atividade de uma proteína específica, tem sido o foco de muitos esforços de rastreio existentes. Embora essa abordagem forneceu inúmeros produtos farmacêuticos, telas com base em reverter um fenótipo, farmacologia clássica, têm sido mais bem sucedidos na identificação de compostos de primeira classe que foram clinicamente eficaz1. Uma desvantagem para descoberta de drogas fenotípica é qu...

Sucesso na identificação de drogas que podem ser usadas para uma doença rara de destino baseia-se no desenvolvimento de ensaios que podem ser usados para a seleção. Hipótese ou telas no destino (farmacologia inversa) são úteis, mas exigem um conhecimento detalhado da base molecular da doença. Telas fenotípicas (farmacologia clássica) evitam a necessidade de uma compreensão detalhada das vias bioquímicas, mas em vez disso, contam com o desenvolvimento de modelos que espelham com precisão a fisiopatologia da doença. Apesar do entusiasmo para abordagens baseadas em alvo, análises do FDA aprovado primeiro na sua classe de drogas revelam que telas fenotípicas foram muito mais bem sucedido1. O objectivo geral deste método é estabelecer uma plataforma para alto throughput screening que pode ser usado para identificar moléculas pequenas para o tratamento da doença hepática metabólica. Vários modelos de em vitro têm sido descritos incluindo primários hepatócitos, células de hepatoma e de células progenitoras fígado2. No entanto, a maioria destes modelos têm limitações, e há uma necessidade de novos modelos com precisão pode recapitular a fisiopatologia das deficiências hepáticas metabólicas na cultura. Recentemente, as células-tronco pluripotentes humanas combinadas com a edição de gene ter oferecido uma oportunidade para modelar até os mais raros de doenças raras em cultura sem a necessidade de acesso pacientes diretamente3. Enquanto o uso de iPSCs paciente específico como uma ferramenta para descobrir pequenas moléculas para o tratamento de doenças raras do fígado é conceitualmente razoável, existem apenas alguns relatórios demonstrando a viabilidade desta abordagem4. No entanto, nós temos estabelecido recentemente uma plataforma que costumava iPSC-derivado de hepatócitos com sucesso identificar drogas que podem ser realocadas para o tratamento das deficiências no metabolismo do fígado5.
Este protocolo explica o processo de diferenciação humana iPSCs para hepatócitos células em placas de 96 poços e usá-los para selecionar uma biblioteca de pequenas moléculas. Ele também descreve a análise de ponto de extremidade usando hipercolesterolemia como um exemplo de doença hepática metabólica. Esta abordagem deve ser útil para estudar o papel e a aplicação de pequenas moléculas no contexto de doenças infecciosas do fígado, doença hepática metabólica, toxicidade de drogas e outros distúrbios hepáticos.

<table><tbody><tr><td>100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>96-wells tissue culture plate&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Albumin</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human FOXA2(6C12)</td><td>Novus Biological</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human HNF4 alpha</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Oct-3/4 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human SOX17</td><td>R&amp;amp;D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Activin A Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, minus insulin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serum free&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4 Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent StemPro&amp;nbsp; Accutase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+(calcium, magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-(no calcium, no magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>ELISA human APOB ELISA development kit</td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Growth Factor&amp;nbsp; (HGF)</td><td>Invitrogen</td><td>PHC0321</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc)</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA Substrate Solution</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Versene (EDTA) 0.02%&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK inhibitor</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells for drug discovery

A capacidade de diferenciar as células-tronco humanas pluripotentes induzidas (iPSCs) em hepatócitos células (HLCs) oferece novas oportunidades para estudar erros inatos do metabolismo hepático. No entanto, para fornecer uma plataforma que ofereça suporte a identificação de pequenas moléculas que potencialmente pode ser usado para tratar a doença do fígado, o procedimento requer um formato de cultura que é compatível com milhares de compostos de triagem. Aqui, descrevemos um protocolo utilizando as condições de cultura completamente definidos, que permitem a diferenciação pode ser reproduzida de iPSCs humana de hepatócitos células em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Nós também fornecemos um exemplo de uso da plataforma para compostos de tela para a sua capacidade para reduzir a apolipoproteína B (APOB) produzido a partir de hepatócitos iPSC-derivados gerados a partir de um paciente de hipercolesterolemia familiar. A disponibilidade de uma plataforma que é compatível com a descoberta de medicamentos deve permitir que os investigadores a identificar novas terapêuticas para doenças que afetam o fígado.

Geração de hepatócito - como células: A Figura 1 descreve a cronograma das mudanças que ocorrem durante a diferenciação das iPSCs humano para hepatócitos células. A cultura de iPSCs em E-Cad-Fc fornece aproximadamente 2mm colônias de diâmetro que expressam o marcador pluripotentes OCT4 (figura 1A-B). A morfologia das células cultivadas em uma matriz d...

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Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

O protocolo aqui apresentado descreve uma plataforma para a identificação de moléculas pequenas para o tratamento de doença hepática. Apresenta-se uma descrição passo a passo detalhando como diferenciar iPSCs em células com características de hepatócitos em placas de 96 poços, para usar as células para a tela para pequenas moléculas com potencial atividade terapêutica.

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K visualizações.  Medical University of South Carolina. O protocolo aqui apresentado descreve uma plataforma para a identificação de moléculas pequenas para o tratamento de doença hepática. Apresenta-se uma descrição passo a passo detalhando como diferenciar iPSCs em células com características de hepatócitos em placas de 96 poços, para usar as células para a tela para pequenas moléculas com potencial atividade terapêutica.

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Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Definido e Geração de Scalable de células de hepatócitos-like de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Biologia do Desenvolvimento

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

Produção semi-automática do hepatócito como células de células-tronco pluripotentes

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

Produção livre de soro de Hepatesferas humanas tridimensionais de células-tronco pluripotentes

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Biologia

Integrative Protocol for Generation of iPSC-Derived 3D Human Hepatic Organoids

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate 3D cultures of human hepatic organoids (HHOs). The utilization of HHOs offers a valuable approach to understanding liver development, unraveling liver diseases, conducting high-throughput studies for drug development, and exploring the potential for liver transplantation. In the former investigation, through immunofluorescence and quantitative RT-PCR techniques, the progression was monitored, identifying the presence of various cell populations, such as hepatoblasts and the two types of hepatoblast-derived cells: cholangiocytes or hepatocyte-like cells, across different developmental stages. This report presents a straightforward 3D protocol starting from hiPSC to acquire HHOs that mirror the stages of human embryo development. The protocol, spanning 46-50 days, encompasses several steps: (i) meticulous management of hiPSC culture to generate HHOs, (ii) initiation of cell differentiation in 2D and the subsequent transition to 3D, and (iii) an optimized dissociation strategy to break down HHOs into single cells for single-cell RNA sequencing. As an illustration of the broad applications of this approach, the present protocol was previously applied to unravel the role of thyroid hormone signaling in developing liver cells.

Human iPSC-derived 3D hepatic organoids constitute a potential tool for understanding the thyroid hormone's action on liver development.

Protocolo Integrativo para Geração de Organoides Hepáticos Humanos 3D Derivados de iPSC

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Bioengenharia

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

Um método eficiente para indução celular direcionada à hepatocito de células-tronco embrionárias humanas

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Imunologia e Infecção

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

Especificação progenitora hepática de células-tronco pluripotentes usando um sistema de diferenciação definido

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Um sistema hepático 2D+ totalmente humano fisiologicamente relevante para descoberta de medicamentos

An All-Human Hepatic Culture System for Drug Development Applications

Finding a long-term, human-relevant culture model for primary human hepatocytes (PHHs) for pharmacological and toxicological studies remains a challenge. Current in vitro model platforms are often inconvenient and complex, lack phenotypic stability over time, and do not support multiple PHH lots, lacking experimental reproducibility and flexibility. Here, we provide a detailed protocol for the thawing, plating, and maintenance of an all-human 2D+ hepatic system (TV2D+), which takes advantage of standard two-dimensional (2D) culture techniques and equipment while maintaining the longevity and phenotypic stability over time that typically accompany more complex three-dimensional (3D) systems. The results show attachment and percent plateability in TV2D+ as a function of PHH seeding density, as well as stable functionality for at least 2 weeks in culture. A range of PHH seeding densities are assessed to achieve a successful long-term culture. When established properly, the PHHs in TV2D+ organize into hepatocyte colonies, express a hepatic-specific marker, and maintain viability, architectural integrity, and physiologically relevant levels of albumin and urea. This unique combination of attributes makes the TV2D+ system a suitable hepatic model for a variety of pharmacological and toxicological applications.

Autor em destaque: Desenvolvendo um modelo hepático simples e robusto para aplicações farmacológicas e toxicológicas 

Recent technical advances enabled the scaled production of an in vitro platform for drug metabolism and toxicity applications. An all-human 2D+ hepatic system (TV2D+) provides physiologically relevant results using traditional two-dimensional culture methods. This protocol will support end-users in the setup, maintenance, and application of the system.

Um Sistema de Cultura Hepática Totalmente Humano para Aplicações no Desenvolvimento de Fármacos

Finding a long-term, human-relevant culture model for primary human hepatocytes (PHHs) for pharmacological and toxicological studies remains a challenge. ...