이 작품은 건강의 국가 학회 (DK55743, DK087377, DK102716 및 HG006398에 S.A.D)에 의해 지원 되었다. 우리는 박사 Behshad Pournasr, 닥터 제임스 해 슬 롭 그들의 공헌에 대 한 란 Jing를 감사 하 고 싶습니다.

1. 인간의 문화 유도 만능 줄기 세포
<ol><li>
재조합 인간 E Cadherin Fc 융합 단백질 (E-cad-Fc) 또는 다른 행렬 hPSC 문화에 대 한 적합 한 코팅 6<ol>
<li>Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분 칼슘 및 마그네슘 (DPBS (+))와 함께 전자 cad Fc 15 μ g/mL를 희석.</li>
		<li>100 m m 정지 조직 문화 요리 희석된 전자 cad Fc의 5 mL와 코트 및 적어도 1 h. 제거 기판에 대 한 37 ˚C에서 품 어와 매체 (예를 들어, 이제 M 매체 라고는 mTeSR1)의 5 mL을 바꿉니다7. 참고: 이 프로토콜에 사용 되는 배양은 게시 프로토콜7다음을 준비 하 고 있다. 그러나, 다른 여러 미디어 준비 설명 되었습니다 또는 사용할 수 상업적으로, 절차와 호환이 되는 가능성이 있습니다.</li>
		<li>액체 질소에서 cryopreserved Ipsc의 유리병을 검색 합니다. 작은 얼음 크리스탈 남아 때까지 37 ˚C에서 해 동. M-중간의 4 mL를 포함 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 부드럽게 플라스틱.</li>
		<li>5 분은 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 다시 셀 Y-27632로 관련, 코일 코일 포함 단백질 키 니 아 제 (바위)의 선택적 억제제의 10 µ M으로 보충 하는 매체의 5 mL을 일시 중단에 대 한 300 x g에서 원심.</li>
		<li>M-중간 단계 1.1.2에서에서 제거 하 고 전자 cad Fc 코팅 100 m m 서 스 펜 션 조직 문화 요리 단계 1.1.4에서에서 셀의 5 mL을 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화에서 인간의 Ipsc 유지
	<ol>
<li>Ipsc 주위에 도달 되 면 80 %confluency, 문화 매체를 제거 하 고 칼슘과 한 번 세척 및 마그네슘 DPBS (-) 무료. DPBS (-) aspirate 고 0.02 %EDTA 솔루션 커버 플레이트, 다음 실 온에서 최대 3 분 동안 품 어 충분 한 양의 추가 합니다. 참고: 80% 합류에 접시 2 x 107 셀을 포함 해야 합니다. 그것은 중요 하지 자라 다 셀, 셀 undifferentiated 형태 유지 되도록입니다. 세포의 pluripotency 줄기 세포 표식 Tra-1-60 또는 동등한8얼룩에 의해 확인할 수 있습니다.</li>
		<li>마자 셀 출시를 시작으로 0.02 %EDTA 용액을 제거 하 고 셀 출시 M 매체의 10 mL와 함께 요리를 홍수. 부드럽게 pipetting으로 Ipsc의 분리를 지원. 참고: 세포 분리를 위한 평균 부 화 시간은 약 3 분, 그러나이 각 iPSC 라인에 대 한 실험적으로 결정 될 필요가 있다. 셀 주위에 포함 된 작은 클러스터로 나와야 한다 5-10 Ipsc 클러스터 당.</li>
		<li>신선한 전자 cad Fc 코팅된 100 m m 정지 조직 문화 접시 M-중간의 5 mL를 포함 된 당 정지 세포의 1/10을 전송 합니다. 37 ˚C O 4% 아래에서 문화를 품 어2/5% CO2 와 변경 매체 매일. 참고: Ipsc pluripotency 홍보 생리 산소 조건 하에서 교양 정기적으로, 비록 Ipsc 또한 주변 산소를 사용 하 여 성장 될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 96 잘 접시에 Hepatocyte 같은 셀에 인간의 Ipsc의 차별화
참고: 심사와 호환 되는 형식 Ipsc의 차별화에 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 인간의 Ipsc 차별화 하 고 20 일에서 hepatocyte 같은 세포 형성을 유도 하는 것이 가능 하다. 이 대부분 분석 실험에 적합, 문화의 길이 세포의 성숙도 향상 시키기 위해 확장할 수 있습니다.
<ol><li>
감소 성장 인자 지하실 멤브레인 매트릭스 96-잘 조직 배양 플레이트 코팅
	<ol>
<li>매트릭스 2 mg/mL 차가운 살 균 DMEM/F12 조직 문화 매체를 diluting 하 여 재고를 준비 합니다. 250 μ aliquots에 매트릭스를 분할 하 고 필요할 때까지-80 ˚C에 저장. 얼음에 30 분 검색에 대 한 얼음에 DMEM/F12의 10 mL 250 μ 2 mg/mL 매트릭스 재고의 약 수를 재개 진정.</li>
		<li>0.05 mg/mL의 최종 농도를 미리 냉장된 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 혼합 하 여 차가운 DMEM/F12의 10 mL와 매트릭스를 결합 합니다.</li>
		<li>96-잘 조직 배양 플레이트의 각 음을 희석된 매트릭스의 100 μ를 전송. 37 ˚C에서 품 어, 4% O2/5% CO2 이상 1 헤에 대 한 행렬을 삭제 하 고 잘 당 50 μ M-중간의 바꿉니다. 37 ° c, 4% O2/5% CO2 필요할 때까지 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
플레이트 셀 차별화
	<ol>
<li>셀 접근 80% 합류까지 100 mm 접시에 Ipsc 문화. 접시에 약 2 × 107 셀 포함 되어 있는지 확인 합니다. 셀 흐름 cytometer 또는 hemocytometer 핸드폰 번호를 확인 합니다. 참고: 경험, Ipsc 셀의 품질은 현미경;에 의해 재판 될 수 있다 그러나, 세포의 98 %pluripotency 마커 TRA-1-60 epitope FACS 또는 immunostaining에 의해 측정 될 때 같은 표현 한다. 셀 적극적으로 나누어 남아 자란 하지 중요 하다.</li>
		<li>각 100 mm 접시에서 Ipsc 수확, 문화 매체를 발음 하 고 DPBS (-)의 5 mL로 씻어. 세포 분리 솔루션 (예를 들어, accutase)의 3 mL와는 린스를 장착 하 고 37 ° C, 4% O2/5% CO2에서 약 2 분 동안 품 어. 참고: 그것은 현미경으로 세포의 분리를 수행 해야 합니다. Accutase와 다이제스트 이상 하지 않습니다. 목표는 최소한의 치료와 함께 작은 클러스터로 셀을 공개 하는.</li>
		<li>최대한 빨리 셀 분리 하기 시작, M-중간의 7 mL을 추가 하 여 수확. 주위의 작은 클러스터로 셀 식민지를 해리를 여러 번 플라스틱 3-6 셀 (그림 1A).</li>
		<li>5 분은 상쾌한을 제거 하 고 다시 5 ml M-중간 셀 펠 릿을 일시 중단에 대 한 15 mL 메 마른 분리기 관 300 x g에서 원심 분리기에는 Ipsc를 수집 합니다.</li>
		<li>각 우물에 96-잘 매트릭스 코팅 접시에 셀 현 탁 액 셀의 pipetting 50 μ에 의해 균등 하 게 배포 합니다. 각 96 잘 접시를 설정 하려면, 주위 5 x 106 세포 분화를 설치를 포함 약 80 %confluency 세포와 Ipsc의 하나 100 mm 접시를 사용 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여이 과정을 속도를. 37 ˚C, 4% O2/5% CO2에서 하룻밤 셀 문화. 참고: 동일한 수의 셀을 재현할 차별점을 보장 하기 위해 각 잘 입금이 중요 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포의 분화를 유도
	<ol>
<li>96 잘 접시 셀 각각의 표면에의 적어도 70%를 잘 커버 되도록 현미경으로 검사 합니다. 범위는 70% 미만, 신선한 매체와 매체를 대체 하 고 37 ˚C, 4% O2/5% CO2에 추가적인 24 h에 대 한 품 어. 참고: 일반적으로 분화를 유도 하지 않고 도금 후 48 h에 대 한 셀을 잠복기 차별화의 효율성을 감소 시킨다. 차별화도 발생 주변 산소를 사용 하 여 효율성에 영향을 받는. 수 있지만
</li>
		<li>차별화의 하루 2 하루 1, 바꿉니다 문화 매체 (인슐린), 없이 2 %B27 보충 RPMI 100 ng/mL Activin A, 10 ng/mL BMP4, 및 20 ng/mL FGF2. 잘 당 매체의 100 μ를 추가 하 고 주변 O2/5% CO2 2 일 동안 매일 매체 변화에 37 ˚C에서 품 어. 참고: 96 잘 접시의 큰 숫자를 다루는 보조 피 펫 또는 로봇의 사용을 해야 합니다. 12 채널 및 96 채널 펫 매일 매체 변화에 이상적입니다.</li>
		<li>차별화의 주 5 일 3, 대체 RPMI와 문화 매체 (인슐린) 없이 2 %B27 100 ng/mL Activin A. 문화 세포 주변 O2/5% CO2 3 일 동안 매일 매체 변화에 37 ˚C에 보충.</li>
		<li>신선한 문화 매체, 각 치료와 함께 교체 하기 전에 차별화 날 5, 100 μ 0.02 %EDTA 솔루션 30 s, 다음 제거 및 교체에 대 한 잘 신선한 문화 매체와. 참고: Endoderm 차별화 효율적 이면 세포 분화의 단층은 접시에서 필 링을 하는 경향이. 0.02 %EDTA 솔루션 간략 한 치료 세포 분리를 완화 하는 데 도움이 됩니다. 이 치료 차별화 hepatocytes에 영향을 주지 않습니다.</li>
		<li>10 월 6 일 사이 감 별 법, 문화 매체 RPMI / 2% (인슐린)와 B27 20 ng/mL BMP4와 10 ng/mL FGF2 보충 및 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 매일 중간 변화 5 일에 품 어 교체 합니다. 이 단계 세포 간 조상 세포로 분화를 유도 합니다.</li>
		<li>15 일 11 사이의 차별화, B27 (인슐린)와 보충 문화 매체 RPMI / 2 %20 ng/mL HGF 바꿉니다. 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 매일 중간 변화 5 일에 품 어.</li>
		<li>20 일 16 사이의 차별화, 문화 매체는 hepatocyte 세포 배양 매체 (호치민시) 20 ng/mL Oncostatin M (OSM)의 보충 바꿉니다. 주변 O2/5% CO2 5 일 동안 매일 매체 변화에 37 ˚C에서 세포를 품 어. 참고: 개별 웰 스 간의 차별화의 재현성 효율적으로 알 부 민, AFP, 또는 APOB ELISA 매체에 분 비의 상대적 수준을 측정 하 여 결정 될 수 있다 (3.2 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 작은 분자 검사
참고: 다음에서는 가족성 콜레스테롤 혈 증 Ipsc에서 파생 하는 hepatocyte 같은 셀의 매체에서 APOB의 저수준에 사용 될 수 있는 화합물을 식별 하는 데 사용 하는 절차를 설명 합니다. 모델 및 콜레스테롤 낮추는 약물의 식별에 사용 설명 설명에 자세히 이전5,9. 현재 예제에서는 1000 화합물 사우스 캐롤라이나 복합 컬렉션 (SC3) 도서관에서 상영 했다. 각 화합물 2 μ g/mL의 농도에서 시험 되었다.
<ol><li>
IPSC-작은 분자와 파생된 hepatocytes의 치료
	<ol>
<li>2 %DMSO-20 ˚C에서 저장소 작업 주식 20 μ g/mL의 농도에서 화합물의 접시를 생성 하는 마스터 화합물 라이브러리를 희석.</li>
		<li>테스트할 각 화합물 수 있도록 iPSC 파생 hepatocytes의 충분 한 96 잘 접시를 준비 합니다. 참고: 상영 하는 화합물의 수는 필요한 96 잘 접시의 수를 쓰게 됩니다. 일반적으로, 단일 잘 준비 되어야 한다 모든 컨트롤 샘플에 대 한 각 추가 플러스 화합물, 웰 스에 대 한. 플레이트의 바깥쪽 우물은 해석 손상 가장자리 효과의 가능성을 줄이기 위해 일반적으로 피 한다. 복제를 사용 하 여 필요 없이 z-점수 방법을 사용 하 여 조회 수를 확인할 수 있습니다. 복제에 포함 되어 있다면, t 검정을 사용 하 여 더 적합 하다.</li>
		<li>차별화 (하루 20, 참조 2.3.7)의 완료에 신선한 호치민시의 100 μ와 문화 매체 대체Oncostatin M의 20 ng/mL으로 보충. 37 ˚C에서 품 어, 4% O2/5% CO2 정확히 24 h. 신선한 96 잘 접시와-20 ˚C에 게 문화 매체를 검색 합니다. 이 샘플을 사용 하 여 약물의 추가 하기 전에 매체에서 APOB의 수준을 계산.</li>
		<li>20 ng/mL Oncostatin M의 각 음에 보충 하는 신선한 호치민시의 90 μ를 추가 합니다. Pipetting으로 혼합 후 작동 주식에서 각 화합물의 10 μ를 추가 합니다. 치료 샘플에서 최종 농도 일치 하는 37 ˚C에서 품 어 웰 스 제어를 0.2 %DMSO 추가, 주변 O2/5% CO2 정확히 24 h. 문화 매체를 수집 하 고-20 ˚C에 저장. 이 예제를 사용 하 여 화합물과 치료 후 APOB의 수준을 결정 하기 위하여.</li>
		<li>옵션-immunostaining, 세포 생존 능력, 또는 mRNA 수준의 표준 방법을 사용 하 여 분석을 위해 나머지를 처리할 수 있습니다. 참고: 이 화면은 APOB 수준에 빠른 효과 가진 약물을 식별 하도록 설계 되었습니다. 그러나, 질병 모델, 다운스트림 분석 실험, 또는 약 활동의 기계 장치에 따라서 그것은 여러 날에 대 한 샘플을 치료 도움이 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ELISA APOB 레벨 결정
	<ol>
<li>두 사전 및 사후 약물 치료 샘플 제조 업체의 프로토콜에 따라 인간의 APOB ELISA 개발 키트를 사용 하 여에서 Apolipoprotein B (APOB) 농도 결정 합니다.</li>
		<li>
다음 솔루션을 준비 하 고
		<ol>
<li>0.05%의 구성 워시 버퍼 PBS, pH 7.4에에서 트윈 20. 사용까지 4 ˚C에 저장 합니다.</li>
			<li>인큐베이션 버퍼, 0.05% 트윈 20 및 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS, pH 7.4에에서 이루어져 있습니다. 사용까지 4 ˚C에 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>2 µ g/ml PBS, pH 7.4에에서 diluting 하 여 APOB (20/17 mAB) 항 체를 준비 합니다. 잘 당 희석된 항 체의 100 μ를 추가 하 고 밤새 4 ˚C에서 품 어.</li>
		<li>분석 결과 격판덮개에서 항 체를 제거 하 고 각 PBS, pH 7.4의 200 μ로 잘 두 번 세척.</li>
		<li>0.05%의 200 μ/잘 추가 트윈 20, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS, pH 7.4에에서 고 실 온에서 1 h 떨고 플랫폼에 품 어.</li>
		<li>PBS, APOB의 다음 농도와 pH 7.4에에서 0.05% 트윈 20 및 0.1 %BSA 사용 하 여 8 포인트 표준 곡선을 준비: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL, 및 50 ng/mL.</li>
		<li>PBS, pH 7.4에에서 0.05% 트윈 20 및 0.1 %BSA 테스트 샘플 1: 4을 희석.</li>
		<li>인큐베이션 버퍼와 차단의 1 시간 후 버퍼를 삭제 하 고 5 번와 200 μ 0.05%의 분석 결과 접시 세척 PBS, pH 7.4에에서 트윈 20.</li>
		<li>완전히 어떤 잔여 세척 버퍼를 제거 하 고 시험 접시에 희석된 샘플 및 APOB 표준의 90 μ를 전송. 1 시간에 대 한 통에 실 온에서 품 어.</li>
		<li>샘플을 삭제 하 고 200 μ 0.05%로 씻어 PBS, pH 7.4 잘 당에 트윈 20. 세척 총 5 회 반복 합니다. PBS, pH 7.4에에서 0.05% 트윈 20 및 0.1 %BSA mAB LDL 11 biotin 희석된 1:1,000의 당 100 μ를 추가 합니다. 1 h 떨고 플랫폼에 실 온에서 품 어.</li>
		<li>시 무시 하 고 잘 세척 버퍼 당 200 μ와 5 번 씻어. 추가 Streptavidin HRP 항 체의 당 100 μ (1:1, 000 부 화 버퍼를 사용 하 여 희석), 다음 1 시간을 위한 떨고 플랫폼에 실 온에서 품 어.</li>
		<li>삭제 시와 200 μ 0.05%로 씻어 PBS, pH 7.4 잘 당에 트윈 20. 세척 총 5 회 반복 합니다. 완전히 시험 접시에서 잔여 세척 버퍼를 제거 하 고 Tetramethylbenzidin (TMB) 기판 솔루션의 당 100 μ 추가 하 고 8 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>TMB 기판 제거 하지 않고 직접 중지 솔루션 (1N HCl)의 당 100 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>450에서 흡 광도 결정 nm 플레이트 리더를 사용 하 여.</li>
		<li>4 매개 변수 로지스틱 회귀 방법을 사용 하 여 다음 각 샘플10APOB의 농도 정의 하는 데 사용 하는 표준 곡선을 설정할 수 있습니다.</li>
		<li>사전 마약 검사: APOB 낮은 잠재력을 가진 화합물을 식별 하는 각 샘플에서 APOB의 사후 약 비율 매체 수준.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered?.">How were new medicines discovered?.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sources+for+in+vitro+human+liver+cell+culture+models.">Cell sources for in vitro human liver cell culture models.</a> Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).</li><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy.">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drug+Screen+using+Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveals+Cardiac+Glycosides+as+a+Potential+Treatment+for+Hypercholesterolemia.">A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).</li><li>Nagaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin-coated+plates+maintain+pluripotent+ES+cells+without+colony+formation.">E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation.</a> PLoS One. 1, e15 (2006).</li><li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative.</a> Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JD+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+faithfully+recapitulate+the+pathophysiology+of+familial+hypercholesterolemia.">JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia.</a> Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).</li><li>DeSilva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+bioanalytical+method+validation+of+ligand-binding+assays+to+support+pharmacokinetic+assessments+of+macromolecules.">Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules.</a> Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).</li><li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin.">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li><li>Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+pluripotent+stem+cells+using+completely+defined+conditions+on+a+recombinant+E-cadherin+substratum.">Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum.</a> BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo.">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Cell-Surface+N-Glycoproteome+of+Human+Hepatocytes+Reveals+Markers+for+Selecting+a+Homogeneous+Population+of+iPSC-Derived+Hepatocytes.">Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustration+of+SSMD,+z+score,+SSMD*,+z*+score,+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens.">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).</li><li>Lorenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Neural+Progenitors+Are+an+Effective+Drug+Discovery+Model+for+Neurological+mtDNA+Disorders.">Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Lu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+progenitor+cells+of+biliary+origin+with+liver+repopulation+capacity.">Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity.</a> Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+cholangiocytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation.">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).</li><li>Mallanna, S. K., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Pashos, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Population+Cohorts+of+hiPSCs+and+Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveal+Functional+Genetic+Variation+at+Blood+Lipid-Associated+Loci.">Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).</li><li>Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+liver+cells+for+drug+testing+and+disease+modeling.">Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling.</a> Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).</li><li>Choi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+drug+screening+and+gene+correction+for+treating+liver+disease+using+patient-specific+stem+cells.">Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells.</a> Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).</li><li>Tafaleng, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+model+personalized+variations+in+liver+disease+resulting+from+alpha1-antitrypsin+deficiency.">Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency.</a> Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).</li><li>Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+reveals+that+HSP90beta+promotes+the+conversion+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endoderm+to+a+hepatic+fate+and+regulates+HNF4A+turnover.">A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover.</a> Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

기반으로 하는 대상 약물 발견, 작은 분자 식별 됩니다 특정 단백질의 활동에 영향을 주는 많은 기존 심사 활동의 초점이 되었습니다. 이 이렇게는 수많은 제약, 반전 형, 고전 학, 바탕 화면을 제공 하 고 있지만 임상 효능1되었습니다 일등석에서 화합물을 식별 하는 것에 더 성공한 되었습니다. Phenotypic 약물 발견에 단점은 적절 한 질병 모델의 가용성에 의존입니다. 이 질병의 ?...

희귀 한 질병을 대상으로 사용할 수 있는 약물을 확인 성공 심사에 사용할 수 있는 분석 실험의 발달에 의존 합니다. 가설 또는 대상 기반 화면 (역방향 약리학) 유용 합니다, 하지만 질병의 분자 기준의 상세한 이해를 요구. Phenotypic 화면 (클래식 약리학) 생화학 경로 대 한 자세한 이해에 대 한 필요 하지만 대신 질병의 이상 정확 하 게 반영 하는 모델의 개발에 따라. 대상-기반 접근에 대 한 열정에 불구 하 고 FDA 승인 첫-에서-클래스 약물의 분석 공개 phenotypic 스크린 훨씬 더 성공적인1되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 심사 하는 높은 처리량에 대 한 플랫폼을 설정 하 대사 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하 사용 될 수 있다입니다. 여러 생체 외에서 모델 기본 hepatocytes은 세포 및 간 조상 세포2를 포함 하 여 기술 되었다. 그러나, 대부분 이러한 모델의 한계, 있고 정확 하 게 문화에서 대사 간 결함의 이상 정리 수 있습니다 새로운 모델에 대 한 필요가 있다. 최근, 인간의 pluripotent 줄기 세포 유전자 편집 함께 액세스 환자 필요 없이 문화에 희귀 질환의 희귀 한 것도 모델 수 있는 기회를 제공 직접3. 환자 전용 Ipsc의 사용 하면서 희귀 한 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 발견 하는 도구는 개념적으로 합리적으로이 접근4의 타당성을 입증 하는 몇 가지 보고서만 있다. 그러나, 우리는 최근 iPSC 파생 hepatocytes 약물 간 신진 대사5결함의 치료를 위해 repurposed 수 성공적으로 확인을 사용 하는 플랫폼을 설립.
이 프로토콜 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시에 인간의 Ipsc를 차별화 하 고 작은 분자의 라이브러리 화면에 그들을 사용 하 여 과정을 설명 합니다. 그것은 또한 신진 대사 간 질환의 예로 콜레스테롤 혈 증을 사용 하 여 끝점 분석을 설명 합니다. 이 방법은 역할 및 전염 성 간 질환, 간 대사 질환, 약물 독성, 및 다른 간 질환의 맥락에서 작은 분자의 응용 연구에 유용 해야 한다.

<table><tbody><tr><td>100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>96-wells tissue culture plate&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Albumin</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human FOXA2(6C12)</td><td>Novus Biological</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human HNF4 alpha</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Oct-3/4 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human SOX17</td><td>R&amp;amp;D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Activin A Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, minus insulin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serum free&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4 Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent StemPro&amp;nbsp; Accutase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+(calcium, magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-(no calcium, no magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>ELISA human APOB ELISA development kit</td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Growth Factor&amp;nbsp; (HGF)</td><td>Invitrogen</td><td>PHC0321</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc)</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA Substrate Solution</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Versene (EDTA) 0.02%&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK inhibitor</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells for drug discovery

Hepatocyte 모양의 세포 (HLCs)로 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)를 차별 하는 능력 선된 천 성 간 물질 대사 연구에 새로운 기회를 제공 합니다. 그러나, 잠재적으로 간 질환 치료에 사용 될 수 있는 작은 분자의 id를 지 원하는 플랫폼을 제공 하는 절차 화합물의 수천을 심사와 호환 되는 문화 형식이 필요 합니다. 여기, 우리는 hepatocyte 같은 셀 96-잘 조직 문화 접시에 인간의 Ipsc의 재현 차별화를 허용 하는 완전히 정의 된 문화 조건을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 또한 가족성 콜레스테롤 혈 증 환자에서 발생 하는 iPSC 파생 hepatocytes에서 생산 하는 Apolipoprotein B (APOB) 낮은 화면 화합물 그들의 능력에 대 한 플랫폼을 사용 하 여 제공 합니다. 약물 발견과 호환 되는 플랫폼의 가용성 간에 영향을 주는 질병에 대 한 새로운 치료제를 식별 하는 연구를 허용 해야 합니다.

Hepatocyte의 세대 - 세포 처럼: 그림 1 는 hepatocyte 같은 셀에 인간의 Ipsc의 분화 하는 동안 발생 하는 변경의 기간을 설명 합니다. 전자 Cad Fc에 Ipsc의 문화 제공 약 2 mm 직경 식민지 만능 마커 OCT4 표현 (그림 1A-B). 전자 cadherin 매트릭스에 성장 하는 세포의 형태는 약간 다른 다른 표?...

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Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

여기에 제시 된 프로토콜 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하기 위한 플랫폼을 설명 합니다. 단계별 설명 Ipsc 96 잘 접시에서 hepatocyte 특성을 가진 세포로 분화 하 고 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 활동 화면 셀을 사용 하는 방법을 자세히 제시 합니다.

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K 조회수.  Medical University of South Carolina. 여기에 제시 된 프로토콜 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하기 위한 플랫폼을 설명 합니다. 단계별 설명 Ipsc 96 잘 접시에서 hepatocyte 특성을 가진 세포로 분화 하 고 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 활동 화면 셀을 사용 하는 방법을 자세히 제시 합니다.

비디오: Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

연구

발생학

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

다능성 줄기 세포에서 3차원 인간 간구의 혈청 무료 생산

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

생물학

Integrative Protocol for Generation of iPSC-Derived 3D Human Hepatic Organoids

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate 3D cultures of human hepatic organoids (HHOs). The utilization of HHOs offers a valuable approach to understanding liver development, unraveling liver diseases, conducting high-throughput studies for drug development, and exploring the potential for liver transplantation. In the former investigation, through immunofluorescence and quantitative RT-PCR techniques, the progression was monitored, identifying the presence of various cell populations, such as hepatoblasts and the two types of hepatoblast-derived cells: cholangiocytes or hepatocyte-like cells, across different developmental stages. This report presents a straightforward 3D protocol starting from hiPSC to acquire HHOs that mirror the stages of human embryo development. The protocol, spanning 46-50 days, encompasses several steps: (i) meticulous management of hiPSC culture to generate HHOs, (ii) initiation of cell differentiation in 2D and the subsequent transition to 3D, and (iii) an optimized dissociation strategy to break down HHOs into single cells for single-cell RNA sequencing. As an illustration of the broad applications of this approach, the present protocol was previously applied to unravel the role of thyroid hormone signaling in developing liver cells.

Human iPSC-derived 3D hepatic organoids constitute a potential tool for understanding the thyroid hormone's action on liver development.

iPSC 유래 3D 인간 간 오가노이드 생성을 위한 통합 프로토콜

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

생체공학

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

면역학 및 감염병학

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Mitochondrial-ALCAM 분류에 의한 인간 iPSC 유래 간세포 정제

Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely diseased organs due to their unlimited proliferation and pluripotent properties. However, differentiating human ES/iPS cells into 100% pure target cell types is challenging due to their high sensitivity to the environment. Tumorigenesis after transplantation is caused by contaminated, proliferating, and undifferentiated cells, making high-purification technology essential for the safe realization of regenerative medicine. To mitigate the risk of tumorigenesis, a high-purification technology has been developed for human iPS cell-derived hepatocytes. The method employs FACS (fluorescence-activated cell sorting) using a combination of high mitochondrial content and the cell-surface marker ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule) without genetic modification. 97% &plusmn; 0.38% (n = 5) of the purified hepatocytes using this method exhibited albumin protein expression. This article aims to provide detailed procedures for this method, as applied to the most current two-dimensional differentiation method for human iPS cells into hepatocytes.

저자 스포트라이트: 재생 의학을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포의 간세포 정제 발전

Hepatocytes derived from pluripotent stem cells can be purified through cell sorting, using a combination of mitochondrial and activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM, also known as CD166) staining.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 간세포를 정제하기 위한 세포 분류에 살아있는 미토콘드리아 염색 적용

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely ...