Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri (DK55743, DK087377, DK102716 ve HG006398 S.A.D için) tarafından desteklenmiştir. Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop ve Ran Jing katkılarından dolayı teşekkür etmek istiyorum.

1. insan kültürünü Pluripotent kök hücreler indüklenen
<ol><li>
Rekombinant insan E-Cadherin Fc füzyon proteini (E-cad-Fc) veya diğer matrisler hPSC kültür için uygun kaplama 6<ol>
<li>E-cad-Fc 15 μg/mL Dulbecco'nın Phosphate-Buffered kalsiyum ve magnezyum (DPBS (+)) içeren serum fizyolojik ile oranında seyreltin.</li>
		<li>Kat 100-mm süspansiyon doku kültürü yemekleri ile seyreltilmiş E-cad-FC 5 mL için en az 1 h. Kaldır substrat 37 ˚C, kuluçkaya ve Orta (Örneğin, mTeSR1 bundan sonra M-aracı olarak anılacaktır) ile 5 mL yerine7. Not: Bu protokol için kullanılan kültür orta yayımlanmış protokolleri7takip hazırlanır. Ancak, diğer birçok medya hazırlıklar tarif var veya ticari, are elde edilebilir bu yordamı ile büyük olasılıkla uyumludur.</li>
		<li>Cryopreserved iPSCs bir şişe sıvı azot almak. Kadar küçük buz kristal kalır 37 ˚C çözülme. Yavaşça hücreleri M-Orta 4 mL içeren bir steril 15 mL konik tüp pipet.</li>
		<li>5 dk. süpernatant kaldır ve yavaşça Y-27632, selektif inhibitörü olan Rho ilişkili, kıvrılmış-coil içeren protein kinaz (ROCK) 10 µM ile desteklenmiş orta 5 mL içeren hücreleri yeniden askıya almak için de 300 x g santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Ve hücre 5 mL adımından 1.1.4 E-cad-Fc-kaplı 100-mm süspansiyon doku kültürü yemekleri için transfer M-orta adım 1.1.2 den çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kültür insan iPSCs Bakımı
	<ol>
<li>Çevresinde iPSCs ulaştıktan sonra % 80 confluency, kültür orta kaldırmak ve bir kez kalsiyum ile yıkayın ve magnezyum ücretsiz DPBS (-). DPBS (-) Aspire edin ve kuruyucu, sonra 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya %0.02 EDTA çözüm yeterli miktarda ekleyin. Not: % 80 izdiham plaka 2 x 107 hücreleri içermelidir. Hücreleri sarmak değil ve hücreleri bir farklılaşmamış morfoloji korunmasını sağlamak için önemlidir. Hücreler pluripotent kök hücre işaretçisi Tra-1-60 veya eşdeğer8ile boyama tarafından belirlenebilir.</li>
		<li>Serbest bırakmak hücrelere başlar başlamaz, %0.02 EDTA çözeltisi kaldırmak ve hücreleri serbest bırakmak için M Orta 10 mL ile çanak su basması. İPSCs dekolmanı yavaşça pipetting tarafından yardım. Not: Yaklaşık 3 dakika ortalama kuluçka zamanı ayırmak hücreler için ama bu her IPSC satırı için ampirik olarak belirlenecek ihtiyacı var. Hücreleri çevresinde içeren küçük kümeleri olarak piyasaya sürülmelidir küme başına 5-10 iPSCs.</li>
		<li>1/10 temiz E-cad-Fc kaplamalı 100 mm süspansiyon doku kültürü çanak M-orta 5 mL içeren başına askıya alınan hücre / aktarın. 37 ˚C altında %4 O, kültürler kuluçkaya2/5% CO2 ve değişim orta günlük. Not: Her ne kadar iPSCs rutin Nanog teşvik için fizyolojik oksijen koşullarında kültürlü, iPSCs ortam oksijen kullanarak da yetiştirilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. insan iPSCs 96-şey plakaları hepatosit benzeri hücrelere farklılaşma
Not: Bu bölümde iPSCs tarama ile uyumlu bir biçimde farklılaşma açıklanmaktadır. Bu yaklaşımı kullanarak, ayırmak ve 20 gün içinde hepatosit benzeri hücreleri oluşturmak için insan iPSCs ikna etmek mümkündür. Bu çoğu deneyleri için uygun olmakla birlikte, kültür uzunluğu hücreleri olgunluk geliştirmek için genişletilebilir.
<ol><li>
96-iyi doku kültürü pilakalar ve düşük büyüme faktörü membran matris kaplama
	<ol>
<li>Hisse senedi 2 mg/ml steril buz gibi DMEM/F12 doku kültürü orta ile matris sulandrarak hazırlayın. Matrisin 250 μL aliquots bölmek ve gerekli kadar-80 ˚C saklayın. DMEM/F12 buz 30 dk. almak için 10 mL 250 μL aliquot 2 mg/mL matris stokunun ve tezcan buza chill.</li>
		<li>Matrix yavaşça olarak 0,05 mg/mL nihai toplama yapmak için önceden soğutulmuş bir pipet kullanarak karıştırarak 10 mL soğuk DMEM/F12 ile birleştirin.</li>
		<li>100 μL seyreltilmiş matrisinin bir 96-iyi doku kültürü tabak her şey için transfer. 37 ˚C kuluçkaya, en az 1 h için %4 O2/5% CO2 matrisin atmak ve iyi 50 M-Orta μL ile değiştirin. 37 ° C'de, %4 O2/5% CO2 gerekinceye kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plaka hücre farklılaşması için
	<ol>
<li>Hücrelerin % 80 izdiham e varana kadar 100-mm plakalar üzerinde iPSCs kültür. Plaka 2 x 107 hücreler içerdiğinden emin olun. Hücre sayıları hücre akış sitometresi veya hemasitometre belirler. Not: Tecrübesiyle, kalite iPSCs hücrelerinin mikroskopisi tarafından değerlendirilecektir olabilir; Ancak, hücreleri % 98'i yakın pluripotency işaretleri FACS veya immunostaining kullanılarak ölçülen TRA-1-60 epitope gibi hızlı. Bu hücreler aktif bölme kalır ve değil büyümüş önemlidir.</li>
		<li>Her 100-mm plaka iPSCs hasat için kültür orta Aspire edin ve 5 mL DPBS (-) ile durulayın. Durulama 3 mL hücre dekolmanı çözeltisi (Örneğin, accutase) ile değiştirin ve yaklaşık 2 dak 37 ° c, % 4 O2/5% CO2için kuluçkaya. Not: Dekolmanı hücrelerinin mikroskopisi tarafından takip etmek önemlidir. Özet accutase ile bitmedi yapmak. Hücreleri en az tedavi ile küçük kümeleri olarak serbest bırakmak için hedeftir.</li>
		<li>Ayırmak hücreleri başlar başlamaz M-orta 7 mL ekleyerek hasat. Birkaç kez pipet hücre kolonileri küçük kümeler halinde ayırmak için 3-6 hücreler (Şekil 1A).</li>
		<li>5 dk. süpernatant kaldırmak ve yeniden 5 mL M-Orta hücre Pelet askıya iPSCs 15 mL steril santrifüj tüpü ve santrifüj 300 x g de içine toplamak.</li>
		<li>96-şey matris kaplı plakalar üzerine hücreleri tarafından süspansiyon hücre pipetting 50 μL her kuyuya eşit olarak dağıtabilmenizi. Her 96-şey tabak ayarlamak için hücreleri, farklılaşma kurulum için yaklaşık 5 x 106 hücreler içeren yaklaşık % 80'i confluency ile iPSCs bir 100-mm tabak kullanın. Bu süreci hızlandırmak için bir çok kanallı pipet kullanın. Gecede, 37 ˚C, %4 O2/5% CO2hücre kültür. Not: Bu hücreler eşit sayıda tekrarlanabilir saptamaları emin olmak için her kuyuya yatırılır önemlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücrelere farklılaşma teşvik
	<ol>
<li>96-şey plakaları mikroskobu tarafından hücre yüzey her bireyin en az % 70'i de kapak emin olmak için incelemek. Kapsama alanı % 70'den az ise, orta ile taze orta yerine ve 37 ˚C, %4 O2/5% CO2de ek bir 24 h için kuluçkaya. Not: Yaygın olarak farklılaşma inducing olmadan kaplama sonra hücreler daha 48 h için kuluçka farklılaşma verimliliğini azaltır. Her ne kadar verim olabilir etkilenen. farklılaşma ortam oksijen kullanarak yapılır
</li>
		<li>Gün 1 gün 2 farklılaşma, (olmadan insülin), % 2 ' B27 ile takıma RPMI kültür orta yerine 100 ng/mL aktivin A, 10 ng/mL BMP4 ve 20 ng/mL FGF2. Orta iyi başına 100 μL ekleyin ve ortam O2/5% CO2 2 gün için bir günlük orta değişiklikle 37 ˚C, kuluçkaya. Not: 96-şey tabak çok sayıda ile ilgili bir yardımlı pipet veya robot kullanımı gerektirir. 12 kanallı ve 96-kanal pipetler günlük orta değiştirmek için idealdir.</li>
		<li>3. gün için günlük 5 farklılaşma Değiştir RPMI ile kültür orta %2 B27 (insülin) olmadan ve 100 ng/mL aktivin A. Kültür ile ortam O2/5% CO2 3 gün için günlük orta değiştirmek ile 37 ˚C hücreleri takıma.</li>
		<li>Taze kültür orta, tedavi her takmadan önce farklılaşma günde 5, iyi 100 μL %0.02 EDTA çözüm 30 s, o zaman kaldır ve Değiştir ile taze kültür orta ile. Not: Farklılaşma endoderm için verimli ise, hücre ayırt monolayer plaka için peeling eğilimli olur. %0,02 EDTA çözeltisi kısa bir tedaviyle hücre dekolmanı hafifletmeye yardımcı olur. Bu tedavi için tetkikine farklılaşma etkilemez.</li>
		<li>Gün 6-10 arasında ayırt etme için kültür B27 (insülin ile) 20 ng/mL BMP4 ve 10 ng/mL FGF2 ile desteklenmiş ve 37 ˚C, %4 O2/5% CO2 günlük orta değiştirmek ile 5 gün boyunca, kuluçkaya Orta % 2 / RPMI ile değiştirin. Bu aşamada hücreleri hepatik progenitör hücre içine ayırt etmek için neden olmaktadır.</li>
		<li>Gün 11-15 arasındaki farklılaşma için kültür B27 (insülin ile) desteklenmiş orta RPMI / %2 20 ng/mL ile HGF değiştirin. 37 ˚C, %4 O2/5% CO2 günlük orta değiştirmek ile 5 gün boyunca, kuluçkaya.</li>
		<li>Gün 16-20 arasındaki farklılaşma için bir hepatosit hücre kültür 20 ng/mL ile Oncostatin-M (OSM) takıma Orta (HKM) kültür orta yerine. Senaryo Özeti ortam O2/5% CO2 5 gün için günlük orta değiştirmek ile 37 ˚C kuluçkaya. Not: Bireysel wells arasındaki farklılaşma tekrarlanabilirlik verimli albümin, AFP veya orta ELISA tarafından salgılanan APOB göreli düzeyi ölçülerek belirlenebilir (bkz: 3.2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. küçük molekül tarama
Not: Aşağıdaki APOB düzeyini Orta ailesel hiperkolesterolemi iPSCs türetilmiş hepatosit benzeri hücre düşürmek için kullanılan bileşenleri tanımlamak için kullanılan yordamı açıklar. Açıklanan model ve kullanımı kolesterol düşürücü ilaçlar tanımlaması ile bir açıklama ayrıntılı olarak daha önce5,9. Geçerli örnek, Güney Carolina bileşik toplama (SC3) kitaplığından 1.000 bileşikler gösterildi. Her bileşik 2 μg/mL konsantrasyonu test edildi.
<ol><li>
IPSC - küçük moleküller ile türetilmiş tetkikine tedavisinde
	<ol>
<li>Tabak bileşikleri, 20 μg/mL bir konsantrasyon ile çalışma stoklarının % 2 DMSO ve -20 ˚C mağazasında oluşturmak için ana bileşik kitaplık sulandırmak.</li>
		<li>IPSC kaynaklı tetkikine test edilecek her bileşik izin vermek için yeterli 96-şey plakaları hazırlayın. Not: Taranacak bileşikler sayısı gereklidir 96-şey tabak sayısını belirleyecektir. Genel olarak, bir tek de herhangi bir kontrol örnekleri için her bileşik, artı ek kuyuları için hazırlanmalıdır. Plaka en dıştaki kuyu sık yorumu bozuk kenar efektleri olasılığını azaltmak için kaçınılmalıdır. Sayısı çoğaltır kullanmaya gerek kalmadan z-skor yöntemi kullanılarak belirlenebilir. Çoğaltır varsa, t testi kullanmak daha uygundur.</li>
		<li>Farklılaşma (gün 20, bakın 2.3.7) bitiminde, taze HCM 100 μL ile kültür orta yerine20 ng/mL ile Oncostatin-M desteklenmiştir. 37 ˚C kuluçkaya, tam olarak 24 h için %4 O2/5% CO2 taze 96-şey plaka ve -20 ˚C mağazasında içine kültür orta almak. Bu örnek APOB düzey ilaç eklenmesi önce Orta hesaplamak için kullanın.</li>
		<li>20 ng/mL Oncostatin-M her kuyuya ile takıma taze HCM 90 μL ekleyin. Her bileşik 10 μL çalışma stoktan pipetting tarafından karıştırdıktan sonra ekleyin. Tedavi örnekleri son konsantrasyon maç ve 37 ˚C kuluçkaya wells denetlemek için % 0,2 DMSO eklemek, ortam O2/5% CO2 tam olarak 24 h için kültür orta toplamanız ve -20 ˚C. Bu örnek bileşikler ile tedaviden sonra APOB düzeyini belirlemek için kullanın.</li>
		<li>İsteğe bağlı - kalan hücreleri immunostaining, hücre canlılığı veya standart yaklaşımları kullanarak mRNA düzeylerinin analizleri için işlenebilir. Not: Bu ekran APOB düzeyleri üzerinde hızlı bir etkisi vardı uyuşturucu tanımlamak için tasarlanmıştır. Ancak, hastalık modeli, aşağı akım deneyleri veya ilaç etki mekanizmaları bağlı olarak, bu örnek için birden fazla gün tedavisi faydalı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ELISA tarafından APOB düzeylerini belirlemek
	<ol>
<li>Üreticinin iletişim kuralları takip insan APOB ELISA geliştirme seti kullanarak her iki öncesi ve sonrası uyuşturucu tedavi örneklerinden apolipoprotein B (APOB) konsantrasyonu belirlemek.</li>
		<li>
Aşağıdaki çözümleri hazırlanıyor
		<ol>
<li>Yıkama arabellek, %0.05 oluşan ara 20 dakika sonra PBS, pH 7.4. 4 ˚C kullanmak kadar saklamak.</li>
			<li>Kuluçka arabellek, % 0.05 arası 20 ve % 0.1 sığır serum albümin (BSA) PBS, pH 7.4 içinde oluşur. 4 ˚C kullanmak kadar saklamak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PBS, pH 7.4 2 µg/ml sulandrarak APOB (mAB 20/17) antikor hazırlayın. Seyreltilmiş antikor iyi başına 100 μL ekleyin ve 4 ˚C gecede kuluçkaya.</li>
		<li>Antikor tahlil plakalar kaldırmak ve her biri de iki kez PBS, pH 7.4 200 μL yıkayın.</li>
		<li>%0,05 200 μL/iyi eklemek ara 20, % 0,1 sığır serum albümin (BSA) PBS, pH 7.4 içinde ve oda sıcaklığında 1s için titreyen bir platform üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>PBS, APOB aşağıdaki konsantrasyonları ile pH %7,4 0.05 arası 20 ve % 0.1 BSA kullanılarak bir 8-nokta standart eğri hazırlamak: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL ve 50 ng/mL.</li>
		<li>Test örnekleri 1:4 ile % 0.05 arası 20 ve % 0.1 BSA içinde PBS, pH 7.4 oranında seyreltin.</li>
		<li>Kuluçka arabellek ile engelleme 1 h sonra arabellek atmak ve beş kez ile %0,05 200 μL tahlil tabak yıkama PBS, pH 7.4 Ara 20.</li>
		<li>Tamamen ve 90 μL seyreltilmiş örnekleri ve APOB standartları için tahlil tabak transfer herhangi bir kalıntı çamaşır arabellek çıkarın. Bir shaker 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Örnek atmak ve yıkama 200 μL %0,05 ile ara 20 dakika sonra PBS, pH İyi 7.4. Yıkama toplam 5 kez tekrarlayın. MAB LDL 11-biotin seyreltilmiş 1:1,000 kuyu başına 100 μL % 0.05 arası 20 ve % 0.1 BSA PBS, pH 7.4 olarak ekleyin. 1s için titreyen bir platformda oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Reaktif atın ve 5 kez de çamaşır arabellek başına 200 μL yıkayın. Streptavidin-HRP antikor kuyu başına 100 μL eklemek (1:1, 000 seyreltme kuluçka tampon kullanarak), o zaman 1s için titreyen bir platformda oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Reaktif atmak ve yıkama 200 μL %0,05 ile ara 20 dakika sonra PBS, pH İyi 7.4. Yıkama toplam 5 kez tekrarlayın. Tamamen artık çamaşır arabellek tahlil plakalar kaldır ve Tetramethylbenzidin (TMB) substrat çözeltisi kuyu başına 100 μL ekleyin ve 8 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>TMB substrat kaldırmadan, doğrudan durmak eriyik (1N HCl) kuyu başına 100 μL ekleyin.</li>
		<li>450 absorbans belirlemek bir plaka okuyucu kullanarak nm.</li>
		<li>Sonra dört parametre Logistic regresyon yöntemi kullanarak APOB konsantrasyonu her örnek10dakika sonra tanımlamak için kullanılan standart bir eğri kurulabilir.</li>
		<li>Öncesi uyuşturucu inceleyin: APOB sonrası uyuşturucu oranını bileşikler APOB düşürmek için potansiyeli ile tanımlamak için her örnek içinde orta düzeyde.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered?.">How were new medicines discovered?.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sources+for+in+vitro+human+liver+cell+culture+models.">Cell sources for in vitro human liver cell culture models.</a> Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).</li><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy.">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drug+Screen+using+Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveals+Cardiac+Glycosides+as+a+Potential+Treatment+for+Hypercholesterolemia.">A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).</li><li>Nagaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin-coated+plates+maintain+pluripotent+ES+cells+without+colony+formation.">E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation.</a> PLoS One. 1, e15 (2006).</li><li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative.</a> Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JD+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+faithfully+recapitulate+the+pathophysiology+of+familial+hypercholesterolemia.">JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia.</a> Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).</li><li>DeSilva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+bioanalytical+method+validation+of+ligand-binding+assays+to+support+pharmacokinetic+assessments+of+macromolecules.">Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules.</a> Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).</li><li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin.">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li><li>Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+pluripotent+stem+cells+using+completely+defined+conditions+on+a+recombinant+E-cadherin+substratum.">Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum.</a> BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo.">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Cell-Surface+N-Glycoproteome+of+Human+Hepatocytes+Reveals+Markers+for+Selecting+a+Homogeneous+Population+of+iPSC-Derived+Hepatocytes.">Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustration+of+SSMD,+z+score,+SSMD*,+z*+score,+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens.">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).</li><li>Lorenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Neural+Progenitors+Are+an+Effective+Drug+Discovery+Model+for+Neurological+mtDNA+Disorders.">Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Lu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+progenitor+cells+of+biliary+origin+with+liver+repopulation+capacity.">Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity.</a> Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+cholangiocytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation.">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).</li><li>Mallanna, S. K., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Pashos, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Population+Cohorts+of+hiPSCs+and+Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveal+Functional+Genetic+Variation+at+Blood+Lipid-Associated+Loci.">Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).</li><li>Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+liver+cells+for+drug+testing+and+disease+modeling.">Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling.</a> Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).</li><li>Choi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+drug+screening+and+gene+correction+for+treating+liver+disease+using+patient-specific+stem+cells.">Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells.</a> Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).</li><li>Tafaleng, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+model+personalized+variations+in+liver+disease+resulting+from+alpha1-antitrypsin+deficiency.">Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency.</a> Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).</li><li>Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+reveals+that+HSP90beta+promotes+the+conversion+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endoderm+to+a+hepatic+fate+and+regulates+HNF4A+turnover.">A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover.</a> Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Belirli bir protein aktivitesini etkileyen nerede küçük moleküller tanımlanır temel hedef ilaç bulma, birçok varolan tarama çalışmalarının odak noktası olmuştur. Bu yaklaşım çok sayıda ilaç, ekranlar üzerinde ters bir fenotip, klasik Farmakoloji, dayalı sağlamıştır, ancak klinik olarak etkili1olmuştur ilk sınıfındaki bileşikler belirlenmesinde daha başarılı olmuştur. Bir dezavantajı fenotipik ilaç keşif için uygun hastalık modelleri kullanılabilirliğine da...

Tarama için kullanılabilir deneyleri gelişimi başarı nadir bir hastalık hedeflemek için kullanılan ilaçlar belirlenmesinde esas alır. Hipotez veya hedef tabanlı ekranlar (ters farmakoloji) yararlıdır, ancak hastalığın moleküler temeli detaylı bir anlayış gerektirir. Fenotipik ekranlar (klasik farmakoloji) biyokimyasal yollar ayrıntılı bir anlayış gerekir ama bunun yerine doğru hastalığın patofizyolojisi ayna modelleri geliştirilmesi üzerinde güveniyor. Hedef tabanlı yaklaşımlar için coşku rağmen fenotipik ekranları daha başarılı1olmuştur FDA onaylı ilk sınıfındaki ilaç analizleri ortaya koyuyor. Bu yöntem genel amacı bu eleme yüksek üretilen iş için bir platform kurmak için metabolik karaciğer hastalığının tedavisi için küçük moleküller tanımlamak için kullanılabilir. Birkaç vitro modelleri birincil tetkikine, hepatoma hücreleri ve karaciğer progenitör hücre2gibi tarif edilmiştir. Ancak, bu modellerin çoğu kısıtlamalar bulunmaktadır ve doğru bir şekilde kültür metabolik karaciğer eksiklikleri Patofizyoloji özetlemek yeni modeller için bir ihtiyaç. Son zamanlarda, insan pluripotent kök hücreler gen düzenleme ile kombine-si olmak teklif etmek bile nadir hastalıklar kültür ezelî belgili tanımlık lüzum erişim hastalara en nadide modellemek için bir fırsat doğrudan3. Hasta özel iPSCs kullanımı sırasında nadir karaciğer hastalıklarının tedavisi için küçük moleküller keşfetmek için bir araç kavramsal olarak makul olduğu gibi sadece bu yaklaşım4fizibilite gösteren birkaç rapor ediliyor. Ancak, son zamanlarda IPSC kaynaklı tetkikine başarıyla karaciğer metabolizması5eksiklikleri tedavisi için güvenilemez uyuşturucu tanımlamak için kullanılan bir platform kurduk.
Bu iletişim kuralı 96-şey plakaları hepatosit benzeri hücreleri insan iPSCs ayırt ve küçük moleküller içeren bir kitaplık ekranı için onları kullanarak işlemi açıklar. Ayrıca hiperkolesterolemi metabolik karaciğer hastalığı örnek olarak kullanarak bitiş noktası analizi açıklar. Bu yaklaşım rolünü ve uygulama bağlamında bulaşıcı karaciğer hastalığı, metabolik karaciğer hastalığı, ilaç toksisitesi ve diğer karaciğer bozuklukları, küçük moleküllerin çalışma yararlı olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>96-wells tissue culture plate&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Albumin</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human FOXA2(6C12)</td><td>Novus Biological</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human HNF4 alpha</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Oct-3/4 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human SOX17</td><td>R&amp;amp;D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Activin A Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, minus insulin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serum free&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4 Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent StemPro&amp;nbsp; Accutase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+(calcium, magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-(no calcium, no magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>ELISA human APOB ELISA development kit</td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Growth Factor&amp;nbsp; (HGF)</td><td>Invitrogen</td><td>PHC0321</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc)</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA Substrate Solution</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Versene (EDTA) 0.02%&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK inhibitor</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells for drug discovery

Hepatosit benzeri hücreler (HLCs) insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) ayırt etmek hepatik metabolizma doğuştan hataları incelemek için yeni fırsatlar sağlar. Ancak, karaciğer hastalığı tedavi etmek için kullanılabilir küçük moleküller tanımlaması destekleyen bir platform sağlamak için yordamı bileşikler binlerce eleme ile uyumlu bir kültür biçimi gerektirir. Burada, 96-iyi doku kültürü plakaları hepatosit benzeri hücreleri insan iPSCs tekrarlanabilir farklılaşma izin tamamen tanımlanmış kültür koşulları bir iletişim kuralı'nı açıklar. Ayrıca, Apolipoprotein B (APOB) düşürmek için yeteneklerini için ekran bileşikler platforma kullanarak örnek bir ailesel hiperkolesterolemi hastanın oluşturulan IPSC kaynaklı tetkikine üretilen sağlamaktayız. İlaç keşif ile uyumlu olan bir platform kullanılabilirliğini araştırmacılar roman karaciğeri etkileyen hastalıklar therapeutics tanımlamak izin vermelidir.

Hepatosit nesil - tarihlerde hücreleri: Şekil 1 insan iPSCs hepatosit benzeri hücrelere farklılaşma sırasında meydana gelen değişiklikler süre açıklar. İPSCs E-Cad-Fc Tarih kültür yaklaşık 2 mm pluripotent işaretçiyi OCT4 hızlı çapı kolonileri sağlar (Şekil 1A-B). Bir E-cadherin matris üzerinde yetiştirilen hücre morfolojisi bu diğer ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery at JoVE.com

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için

Burada sunulan Protokolü küçük moleküller karaciğer hastalığının tedavisi için tanımlamak için bir platform açıklar. Adım adım açıklamasını nasıl iPSCs hücrelere 96-şey plakaları hepatosit özellikleri ile ayırt etmek ve küçük moleküller için potansiyel terapötik etkinlik ile ekran için hücreleri kullanmak için ayrıntılı sunulmaktadır.

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K Görüntüleme.  Medical University of South Carolina. Burada sunulan Protokolü küçük moleküller karaciğer hastalığının tedavisi için tanımlamak için bir platform açıklar. Adım adım açıklamasını nasıl iPSCs hücrelere 96-şey plakaları hepatosit özellikleri ile ayırt etmek ve küçük moleküller için potansiyel terapötik etkinlik ile ekran için hücreleri kullanmak için ayrıntılı sunulmaktadır.

Video: Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Tanımlı ve hepatosit benzeri Hücrelerinin Ölçeklenebilir Nesil insan pluripotent kök hücreleri gelen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Gelişim Biyolojisi

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

Hepatosit Pluripotent kök hücreler hücreleri gibi yarı otomatik üretimi

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

Pluripotent kök hücrelerinden üç boyutlu ınsan Hepatokürlerin serum ücretsiz üretimi

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Biyoloji

Integrative Protocol for Generation of iPSC-Derived 3D Human Hepatic Organoids

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate 3D cultures of human hepatic organoids (HHOs). The utilization of HHOs offers a valuable approach to understanding liver development, unraveling liver diseases, conducting high-throughput studies for drug development, and exploring the potential for liver transplantation. In the former investigation, through immunofluorescence and quantitative RT-PCR techniques, the progression was monitored, identifying the presence of various cell populations, such as hepatoblasts and the two types of hepatoblast-derived cells: cholangiocytes or hepatocyte-like cells, across different developmental stages. This report presents a straightforward 3D protocol starting from hiPSC to acquire HHOs that mirror the stages of human embryo development. The protocol, spanning 46-50 days, encompasses several steps: (i) meticulous management of hiPSC culture to generate HHOs, (ii) initiation of cell differentiation in 2D and the subsequent transition to 3D, and (iii) an optimized dissociation strategy to break down HHOs into single cells for single-cell RNA sequencing. As an illustration of the broad applications of this approach, the present protocol was previously applied to unravel the role of thyroid hormone signaling in developing liver cells.

Human iPSC-derived 3D hepatic organoids constitute a potential tool for understanding the thyroid hormone's action on liver development.

iPSC'den Türetilmiş 3D İnsan Hepatik Organoidlerinin Üretilmesi için Bütünleştirici Protokol

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Karaciğer Hastalığı Çalışmaları için Periferik Kandan İnsan Karaciğer Sferoidleri

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Biyomühendislik

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Hepatosit Benzeri Hücre İndüksiyonu İçin Etkili Bir Yöntem

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

Tanımlanmış Bir Farklılaşma Sistemi Kullanarak Pluripotent Kök Hücrelerden Hepatik Progenitör Spesifikasyonu

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

İnsan iPSC'den Elde Edilen Hepatositlerin Mitokondriyal-ALCAM Sınıflandırması ile Saflaştırılması

Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely diseased organs due to their unlimited proliferation and pluripotent properties. However, differentiating human ES/iPS cells into 100% pure target cell types is challenging due to their high sensitivity to the environment. Tumorigenesis after transplantation is caused by contaminated, proliferating, and undifferentiated cells, making high-purification technology essential for the safe realization of regenerative medicine. To mitigate the risk of tumorigenesis, a high-purification technology has been developed for human iPS cell-derived hepatocytes. The method employs FACS (fluorescence-activated cell sorting) using a combination of high mitochondrial content and the cell-surface marker ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule) without genetic modification. 97% &plusmn; 0.38% (n = 5) of the purified hepatocytes using this method exhibited albumin protein expression. This article aims to provide detailed procedures for this method, as applied to the most current two-dimensional differentiation method for human iPS cells into hepatocytes.

Yazar Spotlight: Rejeneratif Tıp için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Hepatosit Saflaştırmasının İlerletilmesi

Hepatocytes derived from pluripotent stem cells can be purified through cell sorting, using a combination of mitochondrial and activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM, also known as CD166) staining.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Türetilen Hepatositleri Saflaştırmak İçin Hücre Sıralamasında Canlı Mitokondri Boyamanın Uygulanması

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely ...