מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע באמצעות מענקים PHY-1205494 ו- MCB-1413134 (EL) ועל ידי 2017R1D1A1B03035671 המענק של קרן המחקר הלאומי של קוריאה (KSL).

להלן הפרוטוקול משתמשת WormSpa5, מכשיר microfluidic שתואר קודם לכן עבור הדמיה האורך של תולעים. פבריקציה נוספת של WormSpa (החל עם קבצי CAD שניתן להשיג מן המחברים על פי בקשה) היא פשוטה אך דורש מומחיות כלשהי. ברוב המקרים, פבריקציה נוספת יכול בקלות להיעשות באמצעות מתקן ליבה או באמצעות חברה מסחרית המספק שירותים כאלה. כאשר בדיית המכשיר, הקפד לציין הגובה של התכונות הם 50 מיקרומטר.
1. הגדרת הניסוי
<ol><li>לטעון את המכשיר microfluidic על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוך עם שלב ממונע.</li>
	<li>המקום של תפקודי לב / נשימה קרוב המיקרוסקופ, אך לוודא שהרטט מהמכשיר ניעור אינה משפיעה ישירות המיקרוסקופ. לדוגמה, לשים ניעור על מדף קבוע על הקיר שגורם שום קשר עם השולחן האופטי.</li>
	<li>במקום מזרק משאבה על ניעור מסלולית. קלטת את המשאבה על אהבת בשייקר כך זה לא מנענעת תוך טלטול.</li>
</ol>2. הכנת הסביבה Microfluidic
הערה: במהלך הניסוי, מזרקים ארבעה מחוברים למכשיר microfluidic דרך צינורות מזרק, כמתואר באיור1. שלב זה מתאר את הכנת מזרקים אלה. אלא אם צוין אחרת, לשמור על הצינורות מזרק קצר ככל האפשר מבלי לבצע אותם מתוח.
<ol><li>להכין מזרק עודפים של צינור מזרק. המזרק (S1 באיור1) מאוחר יותר להיות מחובר לשקע של המכשיר דרך הצינורית מזרק, המשמשים לאחסון זמני של נוזל יוצא המכשיר.<ol>
<li>להפוך את המחט מתאם על-ידי הסרת חלקי פלסטיק של קצה המזרק 20 G x 1/2 אינץ ', להשאיר רק את המחט (החלק מתכת). לעשות זאת באמצעות החזקת חלקי פלסטיק, מתכת עם צבת ומושך אותם בנפרד. שאריות פלסטיק הנותרים המחט יכול להיות נשרפו בעזרת מבער בונזן.</li>
		<li>לכופף את המחט לפי הצורה הגיאומטרית של ההתקנה ניסיוני תוך החזקת שני הקצוות שלה עם צבת. עיצוב המתוארים כאן, כיפוף המחט במרכזו בזווית של ° ~ 110 הוא הנוח ביותר.</li>
		<li>חבר את המחט מתאם בחצי הדרך ברכבת התחתית. החצי השני מאוחר יותר להיות פקוק לתוך המכשיר. הצינור מזרק צריך להיות תואם עם טיפ מזרק 20 גרם ללא דליפה (לדוגמה, אבובים עם הקוטר הפנימי של 0.86 מ מ, הקוטר החיצוני של 1.32 מ מ). אורך צינור המומלץ הוא ~ 50 ס מ.</li>
		<li>להתחבר מזרק זכוכית-lock 10 מ"ל (פתוח) בצד השני של הצינור מזרק דרך tip מזרק 20 G x 1/2 אינץ '.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין מאגר-כניסת מזרקים, מזרק צינורות. אחד אלה מזרקים (S2 באיור1) משמש מאגר נוזל נכנס לתוך המכשיר, כדי לשלוט בזרימה הזרקה. המזרק אחרים (S3 באיור1) דרוש עבור מאגר exchange, כפי שהוסבר ב 3.2 שלב.<ol>
<li>חבר מזרק זכוכית-lock 10 מ"ל (S2) ישירות ל- 3-דרך שסתום וחבר אחר מזרק (S3) לשסתום באותה דרך צינור מזרק (איור 1): להתחבר S3 הצינור דרך tip מזרק, לחבר הצינור לשסתום באמצעות מזרק עצה נוספת. הערה: לא משנה הסדר שבו חומרים אלה מחוברים.</li>
		<li>חבר צינור מזרק ליציאת הנותרים של השסתום 3-way. להכין עוד מחט מתאם כמו שלב 2.1.2, ולחבר את המחט במחצית הדרך השני (פתוח) של הצינור מזרק.</li>
		<li>להגדיר את השסתום כך הצינור מזרק שלב 2.2.2, S2 מחוברים בזמן S3 סגורה (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין מזרק תולעת-כניסת צינור מזרק. המזרק (S4 באיור1) משמש עבור טעינת תולעים לתוך המכשיר.<ol>
<li>חבר צינור ארוך מזרק מזרק זכוכית-lock 10 מ"ל (S4). לקבוע את אורך הצינור הזה מאמצעי האחסון של נוזל ישמש עבור טעינה; לדוגמה, 100 ס מ של אבובים תומך מעל 2 מ ל נוזל (ראה גם שלב 4.2).</li>
		<li>להכין עוד מחט מתאם כמו שלב 2.1.2 וחבר אחד חצי של המחט לקצה השני (פתוח) של הצינור מזרק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף כל מזרקים, אבובים עם S-בינוני12 פעמיים. למלא את המזרקים, הצינורות S-בינוני, מקפיד להסיר את כל הבועות אוויר.</li>
	<li>לחבר את הצינור מזרק עודפים שקע המכשיר.<ol>
<li>חברו את המחט מתאם בסוף הצינור מזרק ליציאת ה-outlet.</li>
		<li>להזריק נפח קטן של S-בינוני עד ששקע כדי למלא את המכשיר, עד S קטן-בינוני יוצא לים מאגר והן לים תולעת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להתחבר הצינור מזרק מאגר-כניסת יציאת מאגר-כניסת של המכשיר, תוך חיבור לים-התולעת עם סיכה (סיכת פינים נירוסטה בקוטר 1/32 אינץ).</li>
	<li>מזריקים זרם קבוע של מאגר לתוך המכשיר. לטעון את המזרק מאגר-כניסת S2 אל משאבת מזרק13, והגדר את המשאבה כזה כי המדיום ב S2 ברציפות מוזרק לתוך המכשיר בקצב הזרימה של µL 3/min.</li>
</ol>3. להעמיס את חיידקים לתוך המכשיר Microfluidic
<ol><li>להכין OP50 Escherichia coli מושעה S-בינוני12.<ol>
<li>בעקבות פרוטוקול תקני, לחסן בקבוקון 250 מ ל 50 מ ל LB, שמושבה בודדת, דגירה בין לילה ב 37 º C.</li>
		<li>Centrifuge התרבות לילה ב- 4000 סל"ד למשך 10 דקות, resuspend בגדר ב30 מ"ל של S-בינוני.</li>
		<li>לסנן את המתלים דרך מסנן מזרק 5 מיקרומטר. למדוד את ריכוז חיידקים על ידי צפיפות אופטית שלה ב 600 nm (OD600), ולהתאים את ריכוז יתר600 של 3. צפיפות גבוהה זו נדרשת כדי לשמור את התולעים מוזן היטב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חילופי המאגר את ההתקן עם המתלה OP50.<ol>
<li>להכין מזרק נקי (S5) מלא את המתלים OP50. . תחזיק את המזרק אנכית, הקש על זה מספר פעמים כדי לאסוף את כל הבועות אוויר בחלק העליון.</li>
		<li>סובב את השסתום 3-way מזרקים מאגר-כניסת לסגור את החיבור להתקן, וחבר את שתי מזרקים, S2, S3. ולהיבלע S2 משאבת מזרק.</li>
		<li>נתק S2 השסתום וחבר S5 לשסתום. לדחוף את כל האוויר הנאסף בחלק העליון של S5 כדי S3 דרך השסתום עד קצת המאגר OP50 נכנס S3. בעשותו כן, ודא כי אין בועת האוויר נשאר S5 או את השסתום.</li>
		<li>להפוך את השסתום אסידו בחזרה למיקום המקורי כדי לסגור את חיבור בין S3 S5 ולהתחבר S5 המכשיר. העומס S5 לתוך למשאבה מזרק. הפעל את תפקודי לב / נשימה שמחזיק את המשאבה. הגדר את מהירות חזק כ 200 סל"ד.</li>
		<li>הגדר את קצב הזרימה כדי להיות µL 100/min. הזמן שהדרוש עבור מאגר חדש להגיע תולעים המכשיר תלויה אורך הצינור מזרק מאגר-כניסת (בסביבות 5 דקות עם הצנרת שתוארו לעיל). יכול להיות מועסק קצב זרימה גבוהה יותר אם נדרשת החלפת מאגר מהר יותר.</li>
		<li>ברגע המאגר OP50 מתפשטת על כל רחבי המתקן, להגדיר את קצב הזרימה לחזור µL 3/min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. להעמיס את התולעים לתוך המכשיר Microfluidic
<ol><li>הכן צינור microcentrifuge קטן קשירה נמוכה (650 µL) ולמלא אותו µL 100 OP50 השעיה. העבר מסביב יאנג מסונכרן בגיל 20-30 תולעים בוגרות (46 שעות לאחר מעצר זחל L1 25 ° c) של צלחת אגר NGM (מדיום הגידול נמטודות) לשפופרת הזו על-ידי בחירת אותם אחד אחד עם תולעת לבחור. גיל-סנכרון יכול להיעשות בעקבות פרוטוקול סטנדרטי12.</li>
	<li>למלא את התולעת-הים מזרק, מזרק צינור (S4 באיור1) עם המתלה OP50. להזריק ~ 500 µL של הנוזל לתוך הצינור microcentrifuge עם תולעים. לצייר את הבולם עם תולעים לתוך מזרק תולעת-כניסת הצינור. ודא כי הצינור מזרק מספיק זמן (> 1 מ') מצויירות וורמס להישאר בצינור מזרק והוא לא להפוך כל הדרך אל המזרק S4.</li>
	<li>להתחבר S4 לים-התולעת. להזריק את כל התולעים בצינור מזרק תולעת-כניסה לתוך המכשיר microfluidic. נתק S4 ואת הצינור מזרק. חבר את התולעת-הים עם סיכה.</li>
	<li>. נתק את המזרק מאגר-כניסת S2 מהמשאבה מכני ( איור 1), לשלוט ידנית S1 ו- S2 לדחוף את כל התולעים לתוך ערוצים נפרדים. הקשה על S2 להעביר תולעים הערוצים, בזמן לחיצה על S1 יזיז אותם בכיוון ההפוך. פעם ערוץ נטען, התולעת בכל אחד מהערוצים יחסום את הכניסה של תולעים אחרים.</li>
	<li>תן תולעים להסתגל לסביבה חדשה עבור 2-3 שעות.</li>
</ol>5. הגדרת פרוטוקול הדמיה
<ol><li>למצוא את כל התולעים המצויות באופן מאובטח המכשיר וקבע עמדה הדמיה עבור כל אחד מהם בהתמונה רכישת התוכנה המפקחת שלך מיקרוסקופ. שימו לב כי במקרים מסוימים (למשל כאשר הגדלה גבוהה יותר היא הרצויה, או כאשר באמצעות מצלמות עם חיישן CCD קטן יותר) מספר עמדות הדמיה נדרשים לכל ערוץ. הערה: אמנם ניתן לבצע זאת באופן ידני, כמה חבילות תוכנה רכישה ניתן לטעון קובץ הטקסט המפרט את העמדות איפה צריך לקחת תמונות. מאז תפקידים אלה מסודרות באופן קבוע ב- WormSpa, משתמש יכול לכתוב סקריפט קטן (למשל, פיתון או תוכנה מסחרית) באופן אוטומטי יוצר רשימה כזו. התבנית המדויקת של קובץ script זה תלוי בתבנית הקובץ צפוי על ידי רכישת התוכנה (ראה למשל 1 חומר משלים).</li>
	<li>להגדיר את התדירות הנדרשת הדמיה בצילום מואץ. לדוגמה, נעשית הדמיה של ג'ין המערכת החיסונית בתגובה לזיהום בתדר של 10 דקות לכל מסגרת. ודא כי כל הערוצים הדרושים (למשל בהיר שדה, על ידי קרינה פלואורסצנטית GFP) נרכש בכל נקודת זמן.</li>
</ol>6. מארח בתגובה Pseudomonas זיהום
הערה: שלב זה הוא ספציפי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי. לחלופין, אחד יכולים להכין מאגר המכיל רמזים סביבתיים אחרים עניין (ביוטיים, והאביוטיים לחצים, סמים, איתות מולקולות, וכו ').
<ol><li>להכין PA14 Pseudomonas aeruginosa מושעה SK-בינוני14.<ol>
<li>לחסן בקבוקון 250 מ ל 50 מ ל LB, שמושבה בודדת, דגירה בין לילה ב 37 º C.</li>
		<li>לחסן את הבקבוק עוד 250 מ עם 50 מ של ליברות, על aliquot של התרבות, דגירה בין לילה ב 37 º C.</li>
		<li>Centrifuge התרבות לילה ב- 4000 סל"ד למשך 10 דקות, resuspend בגדר ב 10 מ ל SK-בינוני. למדוד את ריכוז חיידקי ולהתאים את ריכוז יתר600 = 4.</li>
		<li>להעביר את המתלים בקבוקון נקי, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ו- 25 ° c לעוד 24 שעות תוך כדי טלטול. שלב זה מחקה את הצעד צלחת-הדגירה בתקן הורג assay14.</li>
		<li>לסנן את המתלים דרך מסנן מזרק 5 מיקרומטר. זה כדי למנוע אגרגטים חיידקי וסותם את המכשיר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להחליף את הבולם OP50 במכשיר המתלה PA14, באותו ההליך כמו 3.2 שלב. לשמור על הדמיה במשך 10 שעות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+gene+expression+to+changing+environments:+from+rapid+responses+to+evolutionary+adaptation.">Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).</li><li>de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+gene+expression+in+response+to+stress.">Controlling gene expression in response to stress.</a> Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+Streamlining+discovery+in+worm+biology.">Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology.</a> Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Kopito, R. B., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+spatiotemporal+surveillance+of+Caenorhabditis+elegans+response+to+environmental+cues.">Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues.</a> Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).</li><li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+Responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998 (2014).</li><li>Grisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+spectroscopy+of+single+sub-nL+ova+with+inductive+ultra-compact+single-chip+probes.">NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes.</a> Sci Rep. 7, 44670 (2017).</li><li>Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-enabled+phenotyping,+imaging,+and+screening+of+multicellular+organisms.">Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms.</a> Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).</li><li>Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+manipulation+of+neural+activity+in+freely+moving+Caenorhabditis+elegans.">Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).</li><li>Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HandKAchip+-+Hands-free+killing+assay+on+a+chip.">HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip.</a> Sci Rep. 6, 35862 (2016).</li><li>Lee, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin-dependent+kinetics+of+feeding+bursts+underlie+a+graded+response+to+food+availability+in+C.+elegans.">Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans.</a> Nat Commun. 8, 14221 (2017).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , (2017).</li><li>Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Caenorhabditis+elegans+by+Pseudomonas+aeruginosa+used+to+model+mammalian+bacterial+pathogenesis.">Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans.">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).</li><li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans.">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li><li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+I.+Wild-type+growth+and+reproduction.">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).</li><li>Chalancon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+gene+expression+noise+and+regulatory+network+architecture.">Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture.</a> Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).</li><li>Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+gene+expression.">Regulation of noise in gene expression.</a> Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).</li><li>Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Switching+of+Cell+Fate+in+Microbes.">Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).</li><li>Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+genetic+networks+and+identifying+compound+mode+of+action+via+expression+profiling.">Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling.</a> Science. 301 (5629), 102-105 (2003).</li><li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants.">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li><li>Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malate+and+Fumarate+Extend+Lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).</li><li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans II. , (1997).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+method+for+automatically+measuring+pharyngeal+pumping+in+C.+elegans.">A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans.</a> J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).</li><li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy.">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

Microfluidic כלים מספקים יתרונות רבים בלימוד תולעים. התקן דימות in PDMS מציע איכות הדמיה גבוהה יותר לעומת צלחת אגר NGM סטנדרטי. ניתן לקחת תמונות מרובות של תולעת יחיד, לעומת שיטות מסורתיות שבו בעלי חיים הרים מהצלחת והוקמה בשקופית מיקרוסקופ עבור הדמיה. בנוסף, ניתן לשמור את microenvironment שבו שוכנים תולעים ק?...

השינויים בתנאי הסביבה עלולה להוביל ההפעלה של תוכניות גנטי בליווי אינדוקציה ודיכוי של הביטוי של גנים ספציפיים1,2. שינויים אלה קינטי עשוי להיות משתנה בין הרקמות החיות באותה, בין בעלי חיים שונים. מחקרים של תוכניות כאלה גנטי ולכן קוראים שיטות לאפשר הדמיה האורך של חיות בודדות ומספקים שליטה מדויקת דינמיות של תנאים סביבתיים.
בשנים האחרונות, microfabricated פלואידים שימשו ללמוד היבטים רבים של התגובה וההתנהגות חיות קטנות, כולל תולעים, זבובים, דובוני מים עוד3,4,5,6, 7. יישומים לכלול, לדוגמה, phenotyping עמוק, optogenetic הקלטה של פעילות. עצבית בתגובה לגירויים כימיים, ומעקב אחר של התנהגויות מוטוריות כגון גפיים ו-8,שאיבה9,10 , 11.
גישות Microfluidic להחזיק נכסים רבים יכול להועיל ארוכת טווח אורכי הדמיה של תגובה לאותות סביבתיים, לרבות שליטה מדויקת דינמיות של microenvironment המקומי, עיצוב גמיש המאפשר קיום חיות בודדות רבעים נפרדים, וכן תכונות חיוביות עבור הדמיה. אולם, שמירה על בעלי חיים בתוך תא microfluidic במשך זמן רב עם השפעה שלילית מינימלית על בני שלהם היטב הוא אתגר, המחייב טיפול מסוים בעיצוב של המכשיר microfluidic, כמו גם ביצוע הניסוי.
כאן אנחנו מדגימים את השימוש WormSpa, מכשיר microfluidic עבור הדמיה האורך של Caenorhabditis elegans. 5 תולעים בודדים מרותק צ'יימברס. שוטף נמוכה של השעיה נוזלי ובקטריאליות ערבויות כי תולעים הם מוזן היטב ופעיל מספיק כדי לשמור על בריאות טובה, להקל על הלחץ, המבנה של התאים מאפשר תולעים להטיל ביצים. הפשטות של העיצוב ואופן הפעולה של WormSpa צריך לאפשר חוקרים ללא נסיון ב מיקרופלואידיקה לשלב התקן זה תוכניות מחקר משלהם.

<table><tbody><tr><td>WormSpa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.</td></tr><tr><td>Compound Microscope</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>An inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>SCI Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/5</td><td>0.034&amp;rdquo; (0.86 mm) I.D. x 0.052&amp;rdquo; (1.32 mm) O.D</td></tr><tr><td>Syringe Tip</td><td>CMLsupply</td><td>901-20-050</td><td>20 Gauge x 1/2&amp;rdquo; blunt tip stainless steel canula</td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>PALL</td><td>4650</td><td>Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Qosina</td><td>C3307</td><td>10 mL Male Luer Lock Syringe</td></tr><tr><td>3 Way Valve</td><td>ColeParmer</td><td>FF-30600-23</td><td>Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile</td></tr><tr><td>Dowel Pin</td><td>McMaster-Carr</td><td>90145A317</td><td>18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32&quot; Dia. x 1/2&quot; Lg.)</td></tr><tr><td>Low Binding Microcentrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>CL S3206</td><td>0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube</td></tr></tbody></table>

a microfluidic platform for longitudinal imaging in caenorhabditis elegans

בעשור האחרון, microfluidic הוחלו ללמוד חיות קטנות, כולל את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans, וטכניקות הוכיחו שימושי כמו פלטפורמה נוחה הדמיה חיה מתן יכולות לשליטה מדויקת של תנאים ניסיוני בזמן אמת. במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת WormSpa, מכשיר שפורסמו קודם לכן microfluidic מותאם אישית. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים. כדי להמחיש את היכולת, אנחנו ביצע ניסויים הוכחה של עקרון בו תולעים נדבקו את ההתקן עם חיידקים פתוגניים, וכל הדינמיקה של ביטוי גנים התגובה החיסונית ביצה הנחת נוטרו באופן רציף של הפרט בעלי חיים. פשוט העיצוב ואופן הפעולה של מכשיר זה הופכים אותו למתאים עבור משתמשים עם לא נסיון עם microfluidic מבוסס ניסויים. אנו מציעים כי גישה זו יהיה שימושי עבור חוקרים רבים מעוניינים תצפיות האורך של תהליכים ביולוגיים בתנאים מוגדרים היטב.

גיל-מסונכרנות צעיר תולעים בוגרות (46 שעות פוסט L1 מעצר זחל 25 ° c)12 היו הכניסו את המכשיר, כמפורט בפרוטוקול. . התולעים היו בנפרד ממוקם ערוצים נפרדים, המאפשרים מדידה האורך של התגובה של בעלי החיים לגורם המחלה. כאשר הניסוי המוצלח, מרבית התולעים נשארים ערוצי שלהם משך זמ...

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת התקן מותאם אישית microfluidic. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים.

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

a-microfluidic-platform-for-longitudinal-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

6.4K Views.  Kongju National University. במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת התקן מותאם אישית microfluidic. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים.

Video: A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Developmental Biology

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Neuroscience

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biology

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

שימוש בהתקן מיקרופלואידיקה גירוי מכני, רזולוציה גבוהה הדמיה של C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

תרבות ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans בודדים על מדיה מוצקה לניטור פלואורסצנטי אורכי והתערבויות מרתיעות

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

התקני microfluidic פשוטים עבור

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של