Name: live cell imaging of chromosome segregation during mitosis
Uploaded: 2018-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
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博士郭 Chiuan hung さんと博士 Bharatkumar 女子の原稿を改善した貴重なコメントをありがとうしたいと思います。

食品医薬品局 (FDA) の研究施設で機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従い、これらの研究実験を行った。
1. 分離と培養マウス胚性線維芽細胞 (MEFs)
<ol><li>標準プロトコル7,8,9PP2A B56γ マウス系統と野生型の同腹仔からマウス萌芽期繊維芽細胞 (MEFs) を分離します。</li>
	<li>3 通路の ExpandMEFs は凍結し、実験8必要になるまでを格納します。</li>
</ol>2. 培養 Mefs 2 ウェル カバーグラスチェンバー用のライブ イメージング
<ol><li>500 ml ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM/f12 キー) を 10% 含む MEF 成長媒体の胎仔ウシ血清 (FBS)、1 X ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質、L-グルタミン (200 mM)、非本質的なアミノ酸 (NEAA) メディア 500 mL ボトル × 1。</li>
	<li>37 ° C で予め温めておいた水風呂通路 3 野生型から冷凍 MEFs、PP2A-B56γ-マウスのバイアルを解凍します。</li>
	<li>15 mL チューブに解凍 MEFs を転送し、ゆっくりと 10 mL のピペットを使用して 15 mL チューブに DMEM/F12 メディアの 20 mL の滴を追加します。</li>
	<li>T75 フラスコに DMEM/F12 成長媒体の 20 mL と共に MEFs を転送し、細胞が 70% 合流までそれらを展開します。密度は 4 倍または 10 倍の倍率で逆の顕微鏡を使用して推定されます。</li>
	<li>吸引ガラスの牧草地を使用して培ピペットのボンネットの真空システムに接続された 0.25% トリプシン/EDTA の 3 mL を加える、DMEM/F12 成長媒体の反作用を停止する 5 分追加 3 mL 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>室温で 5 分間 (300 x g) を低速度で細胞を遠心します。慎重に上澄みを除去し、再 37 の ° C の水浴中で加温 DMEM/F12 成長培地 1 mL の細胞ペレットを中断します。</li>
	<li>トリパン ブルー排除法またはその他の適切なセルを数える方法8を使用して細胞を列挙します。</li>
	<li>MEFs/ウェル 2 ウェル カバーグラスチェンバーの種子約 20,000。200 μ L/ウェル/F12 DMEM 培を追加し、37 ° C、5% CO2でそれらを一晩インキュベートして接続するセルを許可します。</li>
</ol>3. 同期
<ol><li>G0/G1 期で 0.1 %dmem/F12 成長培地で細胞を培養して MEFs を同期 G0/G1 期のセルの最大数を取得する、24 時間 FBS。 注: 血清飢餓は、好みの方法として使用された、さまざまな方法を逮捕10に必要な細胞の分裂の段階に応じて使用できます。</li>
</ol>4. ラベリング
<ol><li>1.5 mg/mL の DMSO でノコダゾールの原液を準備します。ノコダゾールは G2/m 期で10微小管形成を阻害することによって細胞を逮捕します。</li>
	<li>3 日後に同期、200 μ L (10 %fcs) と成長媒体の 200 ng/mL ノコダゾール CL HB リージェント (ヒストン 2B GFP BacMam 2.0) を追加します。</li>
	<li>CL HB リージェント粒子ごとのセル (PPC) のセルに次のように追加するを計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq1.jpg"> セルの数がラベルの時にセルの推定合計数は、PPC はセルごとの粒子の数と 1 × 10 の8は、試薬の mL あたり粒子の数。たとえば、30 の ppc ラベル 20,000 セルに <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq2.jpg"> メモ: CL HB リージェント 10 および 50 の PPC の間ほとんどの細胞の種類とうまく動作します。しかし、この研究の最高 30 PPC の仕事。</li>
	<li>MEFs を 37 ° C、5% CO2で 18 h にインキュベートします。 注: 現在の実験用スピンドル集合チェックポイントをエスケープ分裂期の細胞の染色体の可視化後に発生した 18 h ノコダゾールと細胞周期の停止。</li>
</ol>5. 染色体の遅れの可視化
<ol><li>マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) 環境チャンバーと油浸漬、63 x 対物レンズ装備回転ディスク共焦点顕微鏡システムを使用して可視化します。<ol>
<li>GFP チャネル イメージ獲得のため、励起波長 488 nm の発光波長 450 nm を使用します。</li>
		<li>モーターを備えられたスキャン段階の機能を持つ回転するディスク共焦点顕微鏡システムを使用、Z ピエゾ ステージ トップ インキュベーションと写真がこの手法の漂白後の直接蛍光回復を挿入します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 日前にイメージング、環境室の電源を on し、一晩 37 ° C で全体の部屋を暖めます。</li>
	<li>顕微鏡スタンド、カメラ、回転ディスク装置、照明装置、アルゴン レーザー、コンピューター、電動ステージの電源をオンにします。</li>
	<li>システムのウォーム アップに、3 分。イグニッションキーをオンにするには、アルゴン レーザーを起動します。「実行レーザー」を「スタンバイ」からアルゴン レーザー用トグル スイッチを切り替えます。</li>
	<li>データの取得と処理のソフトウェアを起動します。</li>
	<li>ステージ トップ インキュベーターの CO2のコント ローラーを開始し、CO2の濃度を 5% に設定します。これは、イメージングの開始前に行う必要があります。</li>
	<li>可視化のための段階にインキュベーターと場所から、カバーグラスチェンバーを削除します。油浸漬 63 x 対物レンズ (NA1.4) 細胞を可視化します。</li>
	<li>眼のレンズを通して表示、イメージを集中させおよび核膜崩壊 (NEBD) 段階でセルを識別します。</li>
	<li>適切なレーザー (488 nm アルゴン レーザー Histone2B GFP を可視化する) を開始します。</li>
	<li>取得コントロール ウィンドウを開き、GFP チャネル用の露光時間を設定します。NEBD のセルを識別します。<ol>
<li>手動でターゲット セルの上部と下部の焦点面を決定し、xyz を光学的に切断の設定を入力します。</li>
		<li>20 分間の観察します。細胞が細胞分裂を通じて進まない場合 20 分後の画像集録を停止し、NEBD は、次のセルに移動します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セルあたり約 1 h 画像遅れて染色体嚢から脱出した PP2A B56γ 細胞における有糸分裂時必要です。映画のデータを取得するには、3 分毎写真を撮る。 注: 野生型細胞を逮捕、NEBD ノコダゾールと扱われたとき過去進歩していません。</li>
	<li>さらに分析の zvi ファイル形式で画像を保存します。</li>
</ol>6. 画像処理と解析
注: は、三次元画像処理と Axiovision バージョン 4.8.2 や Imaris バージョン 8.2 など任意の利用可能なソフトウェアを使用して解析を実行します。今回、ImageJ のソフトウェアを使用しました。
<ol><li>イメージ シーケンスを開きます。画像が既にスタック形式の場合は、次の手順に進みます。そうでない場合は使用してスタックにすべての関連する画像を組み合わせる 'イメージ > スタック > スタックに画像' メニュー バー。</li>
	<li>明るさ/コントラスト、レベルに必要な調整を実行します。</li>
	<li>映画にタイムスタンプを追加: する<ol>
<li>' イメージ > スタック > ラベル...' メニュー バー。</li>
		<li>適切な形式では、開始時刻の値、各画像間の時間間隔を選択します。</li>
		<li>「プレビュー」にチェック、の場所と形式設定を調整します。タイム ・ スタンプを適用する [OK] を押します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>映画に縮尺記号を追加: する<ol>
<li>画像のスケーリングを設定 '分析 > スケールを設定' メニュー バー。</li>
		<li>「距離 (ピクセル単位)」フィールド距離が既知の場合、ピクセル数を入力してください、'知られている距離' フィールドに距離を入力。スタックにスケールを適用する ' OK' を押して μ m で正しいの距離、例えば長さの単位を設定します。</li>
		<li>'分析 > ツール > スケール バー]' スケール バーを追加します。'Μ m 幅' で、バーのサイズを設定し、残りの適切なオプションを書式設定を調整します。スタック全体に縮尺記号を追加する 'すべてのスライスのラベル' チェック ボックスを選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>イメージ ウィンドウの端を画面左下の三角の再生ボタンをクリックして、ムービーをプレビューします。フレーム レートを使用して調整 ' イメージ > スタック > アニメーション > アニメーション オプションのメニュー バーにします。</li>
	<li>ムービー ファイルを選択してエクスポート ' ファイル > 名前を付けて保存 > AVI. '、フレーム レートと圧縮を選択。</li>
	<li>保存先を選択するには、[OK] をクリックしての場所とファイル名。動画ファイルを保存する [保存] を押します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+CIN:+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression.">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li><li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+issues:+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing.">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li><li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+assembly+checkpoint.">The spindle assembly checkpoint.</a> Curr Biol. 22, 966-980 (2012).</li><li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+and+cancer:+cutting+through+the+mystery.">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+protein+CSPP1+interacts+with+CENP-H+protein+to+coordinate+accurate+chromosome+oscillation+in+mitosis.">Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis.</a> J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).</li><li>Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+and+implication+of+genome+instability+in+cancer.">The detection and implication of genome instability in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).</li><li>Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+phosphatase+2A+B56&#947;+regulatory+subunit+is+required+for+heart+development.">The protein phosphatase 2A B56&#947; regulatory subunit is required for heart development.</a> Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).</li><li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP2A-B56&#947;+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint.">PP2A-B56&#947; is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschl&#228;ger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites.">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).</li><li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spindle+Assembly+Checkpoint+Is+Not+Essential+for+Viability+of+Human+Cells+with+Genetically+Lowered+APC/C+Activity.">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li><li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+(hPrm1)+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures.">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li><li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine:+case+studies.">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

正確な染色体分離を確保する細胞周期制御チェックポイントは、異数性とセル変換1,2,3を防ぐため。本研究でわかったその不活性化 PP2A B56γ 弱体化した紡錘アセンブリ チェックポイントで起因しました。ライブセル イメージング ノコダゾール9奏効した PP2A B56γ MEFs における有糸分裂時誤偏析染色体を観?...

次のプロトコルでは染色体の分離とヒストン 2B GFP、BacMam 2.0 のラベリングおよび生きているセルイメージ投射使用してマウス萌芽期繊維芽細胞の細胞周期の間に細胞分裂の進行を可視化する便利な方法をについて説明します。
細胞周期制御チェックポイントは、染色体分配を監視し、セル1,2,3の遺伝的整合性の維持に重要な役割を果たします。誤隔離された染色体の蓄積異数性、ほとんどの固体腫瘍4の認刻極印である可能性があります。したがって、染色体不安定性を勉強する方法として染色体の遅れの検出を使用できます。
蛍光標識タンパク質ライブ染色体分配を視覚化するために使用される、mCherry タグの生成が遅れている染色体または H2B GFP タグ付きタンパク質遺伝子配達および分子生物学5相当な知識が必要です。ここで簡潔にするため、CL HB リージェントを呼びます CellLight Histone2B GFP BacMam 2.0 試薬の使用について述べる。この試薬は、すぐに使用することができます、従ってベクトル品質と完全性の心配がありません。さらに、この試薬では、潜在的に有害な治療または脂質や色素負荷化学物質の使用は必要ありません。従来の蛍光ラベルとは異なり CL HB リージェント汚れとは無関係 (すなわち。、膜電位)。CL HB 摂政を単にセルに追加し、タンパク質発現の夜通し孵化することができます。CL HB リージェントは、哺乳動物細胞ではレプリケートされません、バイオ セーフティ レベル (BSL) 研究所 1 の設定で使用できます。また、最もダイナミックな細胞分析を遂行する 5 日前まで、十分な時間のため一晩インキュベートした後このトランスフェクションを検出できます。
また、染色体の異常は、フローサイトメトリー、免疫組織化学または蛍光性の現場の交配 (魚) の6のなど様々 な技術によって調査できます。フローサイトメトリーは、異数性、測定することができる DNA 含量と細胞周期の細胞の位相に基づく研究に使用できます。フローサイトメトリーは、異数性を測定する使用できますが、染色体の誤った分離に関する情報は記載していません。魚および免疫組織化学の手法は、DNA や染色体に結合する蛍光プローブを使用します。これらの技術は細胞の人口の状態のスナップショットを提供する、彼らは生細胞イメージングにより行方不明の期間続く特定の細胞分裂の時空間的可視化を通じて取得する情報を許可しません。
このプロトコルは、遅れて染色体やノコダゾール扱われるマウス萌芽期繊維芽細胞 (MEFs) で PP2A-B56γ-マウスから分離した誤偏析染色体研究に使用されました。上記のアプリケーションのほかは、このプロトコルは、ラベルおよび細胞周期制御を研究するために使用できる様々 な細胞タイプにおける染色体分離または腫瘍細胞の染色体不安定性を視覚化するシンプルなツールを提供します。さらに、それも使用できますさまざまな薬物治療によって引き起こされる染色体不安定性の研究、遺伝子が染色体の誤った分離の結果ノックアウトの効果を研究します。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential amino acids solution (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered saline</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>EMD Millipore</td><td>MX 1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vial storage boxes</td><td>Fisherbrand</td><td>10-500-28</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vials</td><td>Corning/costar</td><td>431416</td><td></td></tr><tr><td>T75 flasks</td><td>Cellstar</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>2 well chambered cover glass</td><td>Nunc</td><td>155380PK</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Cell Profiler</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Cellometer Vision Trio</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>C10594</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>Zeiss Cell Observer SD</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Thermoscientific</td><td>280 series</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Sanyo commercial solutions</td><td>MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr><tr><td>Class II Biological safety cabinet</td><td>The Baker Company</td><td>SterilGard</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision software</td><td>Zeiss</td><td>Ver.4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institute of Health</td><td>Ver. 1.51r</td><td></td></tr></tbody></table>

live cell imaging of chromosome segregation during mitosis

染色体分離されねばならない確実かつ均一に娘細胞に細胞分裂の間に。染色体分離の再現性は、紡錘アセンブリ チェックポイント (SAC) を含む複数のメカニズムによって制御されます。SAC は、有糸分裂を通して細胞の進行の防止のため、すべての染色体がスピンドル微小管に接続している場合を除き、複雑なフィード バック システムの一部です。染色体のラギングおよび異常な染色体分離機能不全の細胞周期制御チェックポイントの指標し、細胞分裂のゲノムの安定性を測定する使用ことができます。SAC の規制緩和は、染色体の分離中にエラーの蓄積により悪性細胞に正常な細胞の変形で起因できます。SAC の実装と複雑な動原体の形成は、キナーゼとホスファターゼ プロテインホスファターゼ 2 a などの相互作用で厳しく規制 (PP2A)。このプロトコルでは、遅れていた PP2A B56γ 調節サブユニットのノックアウト マウスから分離されたマウス萌芽期繊維芽細胞における染色体の生きているセルイメージ投射について説明します。このメソッドは、その他細胞周期制御イメージング技術フローサイトメトリーなど免疫細胞化学染色体の動的な時空間の可視化ではなく、細胞分裂の状態のスナップショットを提供するだけの欠点を克服します。有糸分裂の間。

野生型と PP2A-B56γ-マウスから MEFs 2 よくチャンバー カバー ガラスのシードし、の接続を許可しました。2 日目、MEFs は 0.1% を使用して同期された FBS の 24 h。200 ng/mL メディアで MEFs 第 3 日ノコダゾールと 30 PPC CL HB regentwere は 37 で 18 時間培養° C、5 %co2。4 日目、回転するディスク共焦点顕微鏡システム (図 1) を使用してセルをイ?...

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Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

このプロトコルでは、ラベルおよび Histone2B GFP BacMam 2.0 ラベルおよび回転のディスク共焦点顕微鏡システム使用して分裂期の細胞で生きている染色体の視覚化に簡単で便利な方法について説明します。

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

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9.2K ビュー.  US Food and Drug Administration. このプロトコルでは、ラベルおよび Histone2B GFP BacMam 2.0 ラベルおよび回転のディスク共焦点顕微鏡システム使用して分裂期の細胞で生きている染色体の視覚化に簡単で便利な方法について説明します。

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Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタ キセルに応答を評価するために

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

がん研究

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

細胞分裂のライブイメージングのためのショウジョウバエS2細胞の使用

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

遺伝学

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

神経科学

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

生物学

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;合胞体胚

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

水動紡錘摂動後のメタフェイズタイミングと細胞運命のダイナミクスを評価するライブ細胞イメージング

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

要約

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長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタキセルに応答を評価するために

細胞分裂のライブイメージングのためのショウジョウバエS2細胞の使用

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強

有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

水動紡錘摂動後のメタフェイズタイミングと細胞運命のダイナミクスを評価するライブ細胞イメージング

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

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細胞分裂のライブイメージングのためのショウジョウバエS2細胞の使用

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強

有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

水動紡錘摂動後のメタフェイズタイミングと細胞運命のダイナミクスを評価するライブ細胞イメージング

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタキセルに応答を評価するために