אנו מודים פול אובריאן, מינה Marizel, איזבלה פרידמן לניסויים בבעלי חיים, Jacquie גונזלס, ויינר דניאל מ- NIH/NIAID לעזרה עם גמא הקרנה של רקמות ארנב לפני לייזר לכידת microdissection ו Jansy Sarathy עבור כתב יד מחשבות ועצות. עבודה זו נתמכה על ידי מימון הצעת החוק ולהעניק ומלינדה גייטס (OPP1174780) ומכשור NIH משותפים 1S10OD018072. אנו מודים Eliseo א Eugenin על מתן גישה המיקרוסקופ לייקה LMD 6500 ושיתוף מומחיות וייעוץ. הרכישה, ותמיכה מתמשכת של, 6500 LMD מומן על ידי מענק של לאומי המכון לבריאות הנפש, MH096625, המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, שבץ מוחי, NS105584, PHRI מימון (E.A.E) GSK תרומות (E.A.E).

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל בוצעו על פי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים באישור בעלי חיים מוסדיים אכפת והוועדה שימוש של NIAID (NIH), בבתסדה, מרילנד
1. הניסויים ואוסף רקמות
סעיף זה של הפרוטוקול מתאר נהלים בעלי חיים וגבייה מדגם בתנאים אבטחה ברמה 3 (BSL3). הפרוטוקולים מפורט של שחפת Mycobacterium תרסיס זיהום הליך התרופות, המינהל היה הפרוטוקולים ארנבים שתוארה לעיל11,12.
<ol><li>להדביק ארנבים ניו זילנד הלבן (זכר ונקבה -בת 4-5 חודשים) עם מ. שחפת HN878 באמצעות מערכת תרסיס האף בלבד, כפי שצוין בעבר תיאר11.</li>
	<li>לנהל את הסמים שבחרת (Ethambutol בדוגמה המובאת כאן) דרך המסלול המועדף, המתת חסד החיות של 2, 6 ו- 24 שעות לאחר ניהול. ראשית, עזים ומתנגד הארנב בזריקה תוך שרירית של קטמין 35 מ"ג/ק"ג, חריגות השירותים הווטרינריים-5 מ"ג/ק"ג. לחכות 10 דקות ואשר ההרדמה המתאים על-ידי צובט את הזנב ונגיעה בעדינות את העין. אם אין תגובה, המתת חסד על ידי עירוי לוריד של פנטוברביטל, פניטואין (ראה טבלה של חומרים) ב 1 מ"ל/4.5 ק"ג ב 2 מ ל תמיסת מלח סטרילית. הערה: אלה timepoints אופטימלית לחפות את הפרופיל פרמוקוקינטיים Ethambutol, מחייבים התאמת/אופטימיזציה עבור תרופות מחקר אחרות.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, מספריים, ו/או אזמל, להסיר את הריאות בחלל החזה, נכרות ביופסיות הריאה המכיל גדול גרנולומות נמק נעוץ סביב רקמת הריאה מעורב (כמתואר קודם לכן3). נמק גרנולומות מופיעות בז, צבע, בדרך כלל בולטות מעט מן הריאות שצבעו אדום/ורוד שמסביב. כדי להקל על cryosectioning קל, ודא ביופסיות יותר מ- 2 x 1.5 x 1.5 ס מ.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, מקם את הביופסיה על גבי מגש cryomold שכותרתו מראש עם משטח החיתוך הרצוי במגע ישיר עם הבסיס של המגש. לאחר הקפאה, פעולה זו תספק משטח שטוח שממנו יהיה לחתוך cryosections.</li>
	<li>להקפיא את הביופסיה ב אדי חנקן נוזלי. למלא את מיכל קלקר עד לעומק של 2 ס מ עם חנקן נוזלי ומניחים מתלה צינור מתכת. המתלה צריכים לבלוט מעל פני השטח של החנקן הנוזלי מתן משטח שטוח שעליו ממוקמים המגשים רקמות. מקם את המכסה על המכולה קלקר ולהשאיר רקמות ל-10 דקות להקפיא באופן מלא.</li>
	<li>להסיר את המגשים רקמות, במהירות לעטוף בסרט אלומיניום, למקם באופן אינדיבידואלי עם התווית שקיות פלסטיק לסגירה חוזרת וחותמת. להעביר ל-80 מעלות צלזיוס מקפיא לאחסון. הערה: השלבים 1.1-1.6 מבוצעות בתנאים BSL3 (כולל כל העבודה בעלי חיים וטיפול של האיברים הנגועים). גמא שקסמה מקרין והביופסיות ריאות ב- 3 Megarads כדי לאפשר טיפול מחוץ BSL3 הבלימה. ניתן לבצע לייזר microdissection לכידת על רקמות הפטריה בתוך BLS3 המתקן אם תאושר פרוטוקול הבטיחות נמצאים במקום. עם זאת, השארית של פרוטוקול זה מתאר עיבוד במורד הזרם במתקן BSL-2.</li>
</ol>2. רקמת חלוקתה
<ol><li>הגדר את cryostat הטמפרטורה הרצויה חיתוך. להעביר את הביופסיה ריאות מוקרן-גמא-80 ° C אחסון cryostat ולהשאיר למשך 30 דקות equilibrate הטמפרטורה ברקמות. הערה:-20 ל-22 ° C הוא אופטימלי ביופסיות הנגע טרה-בתים.</li>
	<li>באמצעות פינצטה, לתקן את הביופסיה לצ'אק cryostat באמצעות כמות קטנה של דבק טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) לדבוק הבסיס של רקמות הצ'אק. אוריינט הרקמה כך משטח שטוח (זה היה בקשר עם בסיס cryomold) הוא השטח החשוף לחיתוך. ודא ש-OCT לא לזהם את השטח רקמות, כמו זה עלולים להפריע הניתוח ספקטרומטר מסה עוקבות.</li>
	<li>חותכים לשלושה חלקים רקמות-עובי 25 מיקרומטר והר אל מחמד ממברנה שקופיות. בעדינות לגעת הקרום בסעיף רקמות והסר. אם מוחל מדי לחץ, קרום דק לגזרים.<ol>
<li>הימנע טיפול מופרז של השקופיות לפני הרכבה כפי התוצאה תהיה קרום חיית המחמד להיות טעון ועניים הידבקות של הסעיפים רקמות. ודא כי השקופית הממברנה נשמרת בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר אדהזיה ההפשרה-הרכבה ומוצלח של הרקמה למוח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסר את השקופית cryostat, מאפשרים מילה נהדרת. במשך 3 דקות. אם הפונקציה LCM-LC/MS/MS לא תתבצע באופן מיידי, חותם את השקופית בתיק קטן אטום sealable, העברת אחסון-80 ° C עד נדרש ניתוח.</li>
	<li>לגזור מקטע הסמוך ב 10-12 מיקרומטר, הפשרה-mount על משטח זכוכית רגילה עבור Hematoxylin ואאוזין (H & E) צביעת והפניה. סעיפים נוספים ניתן לחתוך בשלב זה עבור אחרים כתמים להסטולוגיה הרצוי (כגון צביעה-Niellsen להמחשת שחפת Mycobacterium (MTB)).</li>
</ol>3. Microdissection
<ol><li>להסיר את שקית אטומה המכילה את השקופית מ-80 מעלות צלזיוס אחסון ומאפשרים להגיע בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הערה: אם השקופית קר חשוף מיד לאווירה מעבדה, הרקמה להפוך מצופה עיבוי, עלולה לסכן את שלמות המרחבי של התרופה.</li>
	<li>הפעל את המיקרוסקופ ואת לייזר (לייזר דורש 5-10 דקות להתחמם לפני חיתוך יכול להתחיל). לטעון mL 0.20 כובע שטוח המבחנות לתוך למחזיק.</li>
	<li>הסר שקופיות מתוך התיק ולקחת תמונה אופטי של סעיף הרקמה בשקופית מחמד באמצעות סורק משטח אופקי.</li>
	<li>מקם את השקופית לתוך מחזיק שקופיות (רקמות פונה כלפי מטה) והקצה אוסף נפרד צינורות לאזורים ספציפיים גרנולומה עניין שימוש בתוכנה מיקרוסקופ. בדרך כלל, אלה יהיו 'ריאות מעורב,' 'הסלולר גרנולומה,' ו- 'caseum' (נמק במרכז), אבל עשוי להשתנות בהתאם פתולוגיה ספציפית של גרנולומה/הביופסיה.</li>
	<li>מתמקדים הרקמה באמצעות 5 X מיקרוסקופ אובייקטיבי. ההגדלה זה צריך לספק תמונה כללית של הרקמה המכילה בשני התחומים גרנולומה הסלולר, נמק. התוכנה בחר את הצינור המיועד 'caseum' כדי להעבירו למצב תחת הרקמה.</li>
	<li>הזן את הפרמטרים הרצויים לנתיחה. הגדרות אופייניות עבור מקטע ריאות עבה מיקרומטר 25 הם עוצמת הלייזר 30, 15, ומהירות צמצם 35 (שרירותי יחידות). עם זאת, אלו ישתנו בהתאם המיקרוסקופ משמש ופוטנציאל פוחתת כוח בגלל גילו של הלייזר.</li>
	<li>בחרו בכלי 'חינם-draw' ו, באמצעות עט או עכבר או מסך מגע, המתאר את האזור הרצוי לצורך ניתוח. פני השטח של האזור יוצג בתוכנה. לשמור על אזורים שנבחרו תחת 500,000 מיקרומטר2 (0.5 מ מ2) כדי להקל על ניתוח קל יותר. חזור על הקרע עד 3 מיליון מיקרומטר2 (3 מ מ2) שנאסף בסך הכל הצינורית.<ol>
<li>לעיתים, באזור גזור עשוי להשאר תקועים למוח שמסביב (למשל עקב משיכה סטטית), אל תיפול לתוך הכיפה אוסף. להסיר אזורים אלה מצטברים שטח הפנים הכולל על-ידי בחירת והסרה ידנית בתוך התוכנה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר את הכובע על 'הנגע הסלולר' ולאסוף 3 מיליון מיקרומטר2 של רקמות שימוש באותו התהליך כמתואר בשלב 3.7.</li>
	<li>בחר את הכובע 'ריאות מעורב' ולאסוף 3 מיליון מיקרומטר2 של רקמות שימוש באותו התהליך כמתואר בשלב 3.7. שימו לב כי רקמת הריאה מעורב מכיל bronchioles רבים ורווחים מכתשי. שים לב כדי לא לכלול את אלה מאזורים רקמות שהוגדרו עבור ניתוח.</li>
	<li>בעל כיפה, בזהירות להיפרם, חותם, שלוף כל שפופרת. להגן על הרקמות גזור סביב אוויר הפרעות (למשל מאנטנת זרימת אוויר התפרצותם דלת הפתיחה). לנתח את רקמות גזור באופן מיידי, או לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס, להפשיר לפני עיבוד וניתוח איכות המזון.</li>
</ol>4. הפקת וניתוח איכות המזון
<ol><li>הכנת מיצוי פתרון של acetonitrile 1:1 / Ethambutol d-10 תקן פנימי המכיל מתנול. בעת בחירת תקן פנימי, שימוש טופס שכותרתו יציב של התרופה analyte (כגון התווית על-ידי דאוטריום EMB המשמש ההדגמה) עם shift המוני מספיק כדי להימנע איזוטופ לחצות לדבר בין סמים analyte תקן (בדרך כלל מינימום של 4 daltons) . הערה: יצירת תקנים ב- homogenate של כל אחד מסוגי רקמות בהתאמה קשה כי יש שליטה מוגבלת מאוד רקמות עם אשר כדי ליצור סטנדרטים homogenate. בתור חלופה להפיכת תקנים מתוך מדגם homogenate מחודדים, תקן יכולים להיווצר על-ידי הוספת רקמות ריק מבחן מתחם יחד, לחילוץ. נפח של רקמות שליטה homogenate שמתאים האחסון היעד מהסעיפים המחקר דגימת רקמה משולבת ישירות עם כמות של הבדיקה מתחם זה יהיה נוכח ריכוז נתון.</li>
	<li>לחשב האחסון רקמות יישוב מבוסס על פני השטח ואת עובי של סעיף הרקמה ולקבוע את גורם הכרחי דילול homogenate שימוש באמצעי האחסון של homogenate אשר יתווספו תקן ו- QC דגימות. חישובים מומחשים מתחת לאזור היעד גזור2 (3 מ מ2) 3 מיליון מיקרומטר עם מיקרומטר עובי 25, 2 µL נפח של homogenate. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>בהנחה צפיפות רקמה של 1 g/mL, להכין את המניה homogenate על-ידי במשקל של 50 מ"ג של רקמות שליטה והוספת PBS מאגר לדלל (באמצעות הגורם דילול 26.67 homogenate שחושבו בצעד 4.2, diluent זה 1.283 מ"ל). Homogenize על ידי להכות רקמת הריאה ומאגר PBS במשך 5 דקות ב- 1750 סל"ד על מהמגן חרוז חרוז. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>למהול 1 מ"ג/מ"ל ריכוז התרופה מניות ב- 1:1 acetonitrile/מים כדי ליצור עיקול רגיל עולה פתרונות. לקבוע עולה ריכוז רגיל המבוסס על ספייק ונפח האחסון רקמת המטרה. הדוגמה מאויר מיועדת 100 ננוגרם למ"ל רגיל באמצעות אמצעי אחסון ספייק µL 10. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>להסיר את הצינורות המכילים הרקמות microdissected מ-80 מעלות צלזיוס אחסון ומאפשרים להגיע בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של פתרון 1:1 acetonitrile/מים ו- 2 µL PBS מאגר הצינורות המכיל רקמות microdissected.</li>
	<li>עיקול רגיל וצינורות בקרת איכות, להוסיף 10 µL של עולה פתרון 2 µL של שליטה ריאות homogenate.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של פתרון מיצוי כל שפופרת.</li>
	<li>מערבולת כל שפופרת למשך 5 דקות, sonicate במשך 5 דקות, צנטריפוגה-5000 סל ד למשך 5 דקות כדי ליצור גלולה של הסרט ורקמות בתוך כל שפופרת.</li>
	<li>להעביר 50 µL של תגובת שיקוע צלחת עמוקה 96-טוב-טוב, לדלל עם µL 50 נוספים מים יונים מכל קידוח.</li>
	<li>לבצע ניתוח LC/MS/MS באמצעות כלי אופטימיזציה פרמטרים עבור Ethambutol ו- Ethambutol-d10 תקן פנימי (כאמור שמתואר פרט12).</li>
	<li>השתמש גורם לדילול כדי לתקן את הסכום המדויק של רקמות גזור עבור כל דגימה. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. שיטת אימות
<ol><li>ליצור homogenate של רקמת הריאה שליטה על-ידי שילוב ריאות חלק 1, PBS חלקים 2 ו- 3-4 חרוזים פלדה. לנצח את רקמת הריאה ומאגר PBS למשך 5 דקות ב- 1750 סל"ד באמצעות מהמגן חרוז.</li>
	<li>ספייק homogenate על-ידי הוספת 10 µL של 1 מ"ג/מ"ל Ethambutol דימתיל סולפוקסיד מניות לתוך 990 homogenate µL כדי ליצור ריכוז סופי של 10,000 ng/mL (10 mg/mL) ו מערבולת במשך דקה אחת.</li>
	<li>יצירת בלוק קפוא homogenate על-ידי לשפוך את homogenate לתוך cryomold במהירות קפוא בקרח יבש למשך 5 דקות.</li>
	<li>להכין 25 סעיפים עבה מיקרומטר מהגוש homogenate כמתואר בצעדים 2.1-2.5.</li>
	<li>לנתח אזור הרקמה היעד כמפורט בשלבים 3.2-3.10.</li>
	<li>להוסיף 10 µL 1:1 acetonitrile/מים ו- 2 µL PBS מאגר הצינורות המכיל רקמות microdissected.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של פתרון מיצוי כל שפופרת. בצע שלבים 4.9-4.12 כדי ליצור עיקול רגיל ולקבוע את ריכוז התרופה בבלוק homogenate רקמות.</li>
	<li>לחשב יעילות חילוץ באמצעות הנוסחה שלהלן: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+(DESI)+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection.">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling.">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li><li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections.">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li><li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies.">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li><li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging,+laser+capture+microdissection,+and+LC-MS/MS+of+the+same+tissue+section.">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li><li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics:+methodologies+and+clinical+applications.">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li><li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis.">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+A+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).</li><li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy.">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li><li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis.">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model.">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li><li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response.">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

נפתרה במרחב כימות של סמים בתוך נגעים שחפת הריאה נדרשת כדי לקבוע אם התרופה חשיפה מגיע ריכוזים לחיטוי על אוכלוסיות חיידקים השוכנים התאים הנגע שונים. השיטה LCM-LC/MS המתוארות כאן מאפשר כימות מוחלטת של תכשירים נגד שחפת בתוך הנגע התאים, כולל את caseum חיידקים-עשיר, שימוש רק 1-3 מקטעי רקמת בסך הכל. רקמה מ...

היכולת לזהות ולכמת רמות התרופה במרחב היא דרישה חיונית לקביעת אם תרופות נגד שחפת להגיע subpopulations חיידקי בתוך נגעים ריאתי-לחיטוי ריכוזים1. חשיבות מיוחדת הוא בקביעת סמים חדירה לתוך הליבה נמק של הנגע (שנקרא caseum), אשר בדרך כלל מכילה את המספר הגבוה ביותר של החיידקים, וייתכן שהוא לקוי נגיש לסמים עקב העדר vascularization.
שיטות מסורתיות כדי להעריך את הנגע חדירה, שכרוכים המגון הנגעים ריאתי נכרת ואחריו החילוץ הממס וניתוח ספקטרומטר מסה (LC/MS) כרומטוגרפיה נוזלית, הם מאוד רגישים, סלקטיבי עבור הסמים של ריבית. עם זאת, שיטות אלה מציעים מידע מרחבי המסכן, מוגבל לגודל של הרקמה homogenized המקורי. מסה ספקטרומטר הדמיה גישות, כגון לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון (MALDI)2,3, desorption ספקטרומטריית electrospray יינון (דסי)4 או חילוץ שטח משופרת נוזל5, 6 מציעים יכולות הדמיה מאוד במרחב-נפתרה, אבל כימות ישיר יכול להיות מאתגר מאוד או בלתי אפשרי בשל היעילות חילוץ שונות של analyte מהתא שונים ואפקטים של דיכוי יון הטרוגניות או רקמות סוגי7. בנוסף, גישות הדמיה הישירה ביותר של רקמות MS הם מטבעם פחות רגישים יותר LC/MS עקב חוסר ההפרדה כרומטוגרפי של אנדוגני מינים מתחרים על יינון ואת היעילות החילוץ הממס נמוכה יותר של הסם מרקמות.
לייזר לכידת microdissection (LCM) בשילוב עם ניתוח LC/MS יש כבר מיושם באופן שגרתי כדי לבודד לאפיין אזורים רקמה נפרדות עבור פרוטיאומיה מבנית מחקרים8,9 , לאחרונה מנוצל על כימות סמים ב עצומות ברקמות בעלי חיים10. כאן אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת החלת LCM בשילוב עם ניתוח LC/MS (LCM-LC/MS) לכמת תכשירים נגד שחפת בתוך תאים נפרדים גרנולומה. בתהליך microdissection לכידת לייזר, לייזר UV הוא מרוכז באמצעות המטרה מיקרוסקופ לתוך מקטע רקמות, אשר חותך ומבודד אזור הרקמה הרצויה על-ידי ביצוע נתיב המוגדר על-ידי המשתמש. עבור בסיוע הכובד LCM (בטכניקה השתמשו לצורך מחקר זה), סעיף הרקמה הוא רכוב לשקופית קרום דק פולימרי (PET או עט), הרקמה נלכד בתוך הצינורית אוסף מוצב מתחת לשקופית. הסמים מופקים מכל רקמת נכרת, לכמת באמצעות גישות LC/MS סטנדרטי. כמות רקמת נדרש להיות שנאספו נקבעת בסופו של דבר את ריכוז התרופה נוכח הרקמה הצפוי, הרגישות של שיטת ביופידבק. עבור רוב ניתוחים של סמים עצומות ברמות טיפולית וניתח באמצעות ספקטרומטר מסה פאול טריפל שגרתית, 3 מיליון מיקרומטר2 (3 מ מ2) של רקמת שטח מספיקה.
פרוטוקול זה מתאר שילוב רב עוצמה של פרופיל המרחבי, כימות מלא מוצעים על ידי אופנת LCM-LC/MS, מתן סמים מוחלטת ריכוזים בתוך התאים של גרנולומות טרה-בתים. ניתן להחיל את הטכניקה גם לקביעת ריכוזי התרופה ברקמות רבות חולה אחר מתן מידע חיוני סמים בגילוי ופיתוח.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">New Zealand White rabbits</td>
			<td style="width:159px;">Covance</td>
			<td style="width:155px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">HN878 Mycobacterium tuberculosis</td>
			<td style="width:159px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:155px;">NR-13647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Virbac</td>
			<td style="width:155px;">710101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A955-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A456-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Formic Acid (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Water (LC-MS grade)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">W6212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">0.2 mL flat-cap PCR tubes</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">07-200-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Steel frames, PET-membrane</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">11505151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Premium Frosted Microscope Slides</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#160;96 Deep well plate 2.0ML PP RB&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">NC0363259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Zorbax SB-C8&#160;column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &#956;m)</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;">820631-001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#34;Zipper&#8221; Seal Sample Bags</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">01-816-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Equipment</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CM1850&#160;cryostat</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica CM1860 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Laser Microdissection System 6500</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica LMD 6 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Agilent 1260 Infinity II HPLC&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:159px;">Sciex</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

השחפת היא עדיין גורם התחלואה והתמותה ברחבי העולם. שיפורים משטרי סמים הקיים ופיתוח של הריפוי דרושים בדחיפות. היכולת של תרופות במינון טרה-בתים כדי להגיע, לעקר את החיידקים בתוך גרוע vascularized נמק מחוזות (caseum) גרנולומות ריאתי חיונית התערבות טיפולית מוצלחת. משטרי טיפולית יעילה ולכן חייב להכיל תרופות עם סגולות חדירה caseum חיובית. השיטות הקיימות LC/MS עבור לכימות רמות התרופה ברקמות ביולוגיות מוגבלת ליכולות הרזולוציה המרחבית, ולכן קשה לקבוע במדויק ריכוז סמים מוחלטת בתוך תאי רקמת קטן כמו אלה שנמצאו בתוך גרנולומות נמק. כאן אנו מציגים פרוטוקול המשלב לייזר לכידת microdissection (LCM) של רקמות באופן פתולוגי, נבדל אזורים עם ביופידבק כמת. טכניקה זו מספקת כימות מוחלטת של סמים בתוך caseum גרנולומה, סביב הנגע הסלולר ואת רקמת הריאה מעורב, לכן, באופן מדויק קובע אם ריכוזים אחרים להיות מושגת. בנוסף המחקר שחפת, הטכניקה יש יישומים פוטנציאליים רבים על כימות נפתרה במרחב של סמים לרקמות החולות.

סקירה כללית של הגישה LCM-LC/MS מוצג באיור1. לאחר לחיטוי הרקמה על ידי גמא-הקרנה, כל השלבים הבאים (מתוך רקמת חלוקתה ואילך) מתקיימים מחוץ BSL3 תנאים. איור 2 מציג הנגע מקטעים ביופסיה לפני ואחרי רקמות בידוד על ידי אופנת LCM. אזורי נמק הסלולר של נגעים טרה-ב...

Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות לייזר לכידת microdissection בשילוב עם ניתוח LC/MS במרחב-לכמת הפצות סמים בתוך גרנולומות שחפת הריאה. הגישה יש ישימות רחבה כדי לכימות ריכוז סמים בתוך רקמות-פירוט מרחבית גבוהה.

כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד Microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Views.  Rutgers, The State University of New Jersey. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות לייזר לכידת microdissection בשילוב עם ניתוח LC/MS במרחב-לכמת הפצות סמים בתוך גרנולומות שחפת הריאה. הגישה יש ישימות רחבה כדי לכימות ריכוז סמים בתוך רקמות-פירוט מרחבית גבוהה.

Video: Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Magnetic Resonance Imaging Quantification of Pulmonary Perfusion using Calibrated Arterial Spin Labeling

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, fraction (FIO2) = 0.21) hypoxia (FIO2 = 0.125), and hyperoxia 
(FIO2 = 1.00). In addition, the physiological responses of the subject are monitored in the MR scan environment. MR images 
were obtained on a 1.5 T GE MRI scanner during a breath hold from a sagittal slice in the right lung at functional residual capacity. An arterial 
spin labeling sequence (ASL-FAIRER) was used to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow 1,2 and a multi-echo fast 
gradient echo (mGRE) sequence 3 was used to quantify the regional proton (i.e. H2O) density, allowing the quantification 
of density-normalized perfusion for each voxel (milliliters blood per minute per gram lung tissue). 
With a pneumatic switching valve and facemask equipped with a 2-way non-rebreathing valve, different oxygen concentrations 
were introduced to the subject in the MR scanner through the inspired gas tubing. A metabolic cart collected expiratory gas via expiratory tubing. Mixed expiratory O2 and CO2 concentrations, oxygen consumption, carbon dioxide production, respiratory exchange ratio, 
respiratory frequency and tidal volume were measured. Heart rate and oxygen saturation were monitored using pulse-oximetry. 
Data obtained from a normal subject showed that, as expected, heart rate was higher in hypoxia (60 bpm) than during normoxia (51) or hyperoxia (50) and the arterial oxygen saturation (SpO2) was reduced during hypoxia to 86%. Mean ventilation was 8.31 L/min BTPS during hypoxia, 7.04 L/min during normoxia, and 6.64 L/min during hyperoxia. Tidal volume was 0.76 L during hypoxia, 0.69 L during normoxia, and 0.67 L during hyperoxia. 
Representative quantified ASL data showed that the mean density normalized perfusion was 8.86 ml/min/g during hypoxia, 8.26 ml/min/g during normoxia and 8.46 ml/min/g during hyperoxia, respectively. In this subject, the relative dispersion4, an index of global heterogeneity, was increased in hypoxia (1.07 during hypoxia, 0.85 during normoxia, and 0.87 during hyperoxia) while the fractal dimension (Ds), another index of heterogeneity reflecting vascular branching structure, was unchanged (1.24 during hypoxia, 1.26 during normoxia, and 1.26 during hyperoxia). 
Overview. This protocol will demonstrate the acquisition of data to measure the distribution of pulmonary perfusion noninvasively under conditions of normoxia, hypoxia, and hyperoxia using a magnetic resonance imaging technique known as arterial spin labeling (ASL). 
Rationale: Measurement of pulmonary blood flow and lung proton density using MR technique offers high spatial resolution images which can be quantified and the ability to perform repeated measurements under several different physiological conditions. In human studies, PET, SPECT, and CT are commonly used as the alternative techniques. However, these techniques involve exposure to ionizing radiation, and thus are not suitable for repeated measurements in human subjects.

A MR imaging method to study the distribution of pulmonary blood flow under a variety of physiological conditions, in this case exposure to three different inspired oxygen concentrations: hypoxia, normoxia, and hyperoxia, is described. This technique utilizes human pulmonary physiology research techniques in an MR scanning environment.

דימות תהודה מגנטית כימות זלוף ריאתי באמצעות מכויל תיוג ספין העורקים

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, ...

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה של נוירופפטידים אצל חולי פרקינסון

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Mass כמותי spectrometric פרופיל של Proteomes סרטן התאים נגזרים מנוזלים וגידולים מוצקים

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a specific anatomical region. Within the brain, metals have a highly compartmentalized distribution, depending on the primary function they play within the central nervous system. Imaging the spatial distribution of metals has provided unique insight into the biochemical architecture of the brain, allowing direct correlation between neuroanatomical regions and their known function with regard to metal-dependent processes. In addition, several age-related neurological disorders feature disrupted metal homeostasis, which is often confined to small regions of the brain that are otherwise difficult to analyze. Here, we describe a comprehensive method for quantitatively imaging metals in the mouse brain, using laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) and specially designed image processing software. Focusing on iron, copper and zinc, which are three of the most abundant and disease-relevant metals within the brain, we describe the essential steps in sample preparation, analysis, quantitative measurements and image processing to produce maps of metal distribution within the low micrometer resolution range. This technique, applicable to any cut tissue section, is capable of demonstrating the highly variable distribution of metals within an organ or system, and can be used to identify changes in metal homeostasis and absolute levels within fine anatomical structures.

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Quantitatively mapping metals in tissue by laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) is a sensitive analytical technique that can provide new insight into how metals participate in normal function and disease processes. Here, we describe a protocol for quantitatively imaging metals in thin sections of mouse neurological tissue.

מתכות הדמיה ברקמת המוח על ידי אבלציה לייזר - פלזמה מצמידים אינדוקטיבי - ספקטרומטריית מסה (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

שיטת In Vivo להערכת את מחסום הדם-הבטן ואת חילוף החומרים בכבד של מוצרים Microbiota

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease susceptibility, drug target discovery, and precision medicine. Alternative IgG N-glycans have been reported in several common chronic diseases and suggested to have great potential in clinical applications (i.e., biomarkers for diagnosis and prediction of diseases). IgG N-glycans are widely characterized using the method of hydrophilic interaction chromatography (HILIC) ultra-performance liquid chromatography (UPLC). UPLC is a stable detection technology with good reproducibility and high relative quantitative accuracy. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated, and glycan composition and relative abundance in plasma are characterized.

Immunoglobulin G (IgG) N-glycan is characterized using hydrophilic interaction chromatography UPLC. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated. Presented here is an introduction to this experimental method so that it can be widely used in research settings.

אימונוגלובולין G N-גליקן ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית במיוחד

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is enhanced after processing with vinegar, CR processed with vinegar (CRV) is generally used clinically. However, the mechanism by which the analgesic effect is enhanced by vinegar processing is unclear. In this study, the ultra-high pressure liquid chromatographytandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) technique was used to examine changes in the blood levels of the exogenous constituents and metabolites between CR-treated and CRV-treated rats with dysmenorrhea. The results revealed differing levels of 15 constituents and two metabolites in the blood of these rats. Among them, the levels of (-)-myrtenol and [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acetic acid in the CRV group were considerably higher than in the CR group. CRV reduced the level of 2-series prostanoids and 4-series leukotrienes with proinflammatory, platelet aggregation, and vasoconstriction activities and provided analgesic effects by modulating arachidonic acid and linoleic acid metabolism and the biosynthesis of unsaturated fatty acids. This study revealed that vinegar processing enhances the analgesic effect of CR and contributes to our understanding of the mechanism of action of CRV.

Here, a comparative analysis of raw and processed Cyperi rhizoma (CR) samples is presented using ultra-high performance liquid chromatography-high-resolution tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) in rats with primary dysmenorrhea. The changes in blood levels of the metabolites and the sample constituents were examined between rats treated with CR and CR processed with vinegar (CRV).

ניתוח דגימות Rhizoma Cyperi גולמיות ומעובדות באמצעות ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית-טנדם בחולדות עם דיסמנוריאה ראשונית

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is ...

לכידת דגימות רקמת פיברוזיס תת-רירית אוראלית לניתוח מרחבי-אומי

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

מחבר זרקור: לפענח את המסתורין של ממאירויות פוטנציאליות דרך הפה 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

בידוד תאים עם מידע מורפולוגי ומרחבי מדגימות פיברוזיס תת-רירית דרך הפה באמצעות מיקרודיסקציה לכידת לייזר

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...