Name: spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)
Uploaded: 2018-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

Wir danken Paul O'Brien, Marizel Mina und Isabella Freedman für Tierversuche, Jacquie Gonzalez und Danielle Weiner von NIH/NIAID für Hilfe mit Gammastrahlung von Kaninchen Gewebe vor dem Laser Capture Microdissection und Jansy Sarathy für Manuskript Gedanken und Ratschläge. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Mittel aus der Bill und Melinda Gates Foundation (OPP1174780) und NIH geteilt Instrumentierung gewähren 1S10OD018072. Wir danken Eliseo A. Eugenin für den Zugang zu den Leica LMD 6500 Mikroskop und Austausch von Wissen und Beratung. Der Kauf und die laufende Unterstützung, der LMD-6500 wurde finanziert durch das National Institute of Mental Health Grant, MH096625, National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall, NS105584, PHRI Mittel (für E.A.E) und GSK Beiträge (zur E.A.E).

Alle Tierversuche erfolgten gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health mit Genehmigung aus dem institutionellen Animal Care und Use Committee der NIAID (NIH), Bethesda, MD.
(1) Tierversuche und Gewebe-Sammlung
Dieser Abschnitt des Protokolls beschreibt Tier Verfahren und Probenentnahme Biosafety Level 3 (BSL3) Bedingungen. Ausführliche Protokolle der Mycobacterium Tuberculosis Aerosol Infektion Verfahren and Drug Administration, die Protokolle bei Kaninchen wurden beschriebenen zuvor11,12.
<ol><li>New Zealand White Kaninchen (männlich und weiblich, ca. 4-5 Monate alt) mit M. Tuberculosis HN878 infizieren mit einem nur-Nase-Aerosol-System, wie oben beschrieben11.</li>
	<li>Verwalten Sie die gewählten Medikamente (Ethambutol im hier vorgestellten Beispiel) über die bevorzugte Route und einschläfern Sie die Tiere auf 2, 6 und 24 h nach Verabreichung. Erstens zu betäuben die Kaninchen durch intramuskuläre Injektion von Ketamin bei 35 mg/kg und Xylazin bei 5 mg/kg. Für zehn Minuten warten Sie, und bestätigen Sie richtige Anesthetization durch Kneifen die Rute und das Auge berühren. Wenn es keine Reaktion, einschläfern Sie durch intravenöse Gabe von Pentobarbital und Phenytoin (siehe Tabelle of Materials) in 1 mL/4,5 kg in 2 mL steriler Kochsalzlösung. Hinweis: Diese Zeitpunkte sind optimal um das pharmakokinetische Profil Ethambutol abzudecken und Anpassung/Optimierung für andere Studie Medikamente erfordern.</li>
	<li>Mit Pinzette, Schere und/oder Skalpell, entfernen Sie die Lungen aus der Brusthöhle, resezieren Sie Lunge Biopsien mit großen nekrotische Granulome in umliegenden unbeteiligte Lungengewebe (wie zuvor beschrieben3) eingebettet. Nekrotische Granulome erscheinen in Beige Farbe und in der Regel ragen leicht aus der umliegenden rot/Rosé-farbene Lunge. Um einfache Kryoschneiden zu erleichtern, damit Biopsien sind nicht größer als 2 x 1,5 x 1,5 cm.</li>
	<li>Mit Pinzette, Ort der Biopsie auf ein bereits beschriftete Cryomold Tablett mit den gewünschten Schnittfläche in direktem Kontakt mit der Basis des Fachs. Nach dem Einfrieren, wird dies eine flache Oberfläche bieten, aus der Cryosections geschnitten werden.</li>
	<li>Fixieren Sie die Biopsie in flüssigem Stickstoff Dampf. Füllen Sie einen Styropor-Behälter bis zu einer Tiefe von 2 Zoll mit flüssigem Stickstoff und einem Metalldraht Rohr Gestell. Das Rack sollte ragen über der Oberfläche des flüssigen Stickstoffes, die Bereitstellung einer flachen Oberfläche, auf der die Gewebe-Trays platziert werden. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Styropor-Behälter und lassen Sie Gewebe für 10 Minuten vollständig einfrieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Gewebe-Fächer, wickeln Sie schnell in Aluminiumfolie ein und in individuell beschriftet, wiederverschließbaren Plastiktüten und Dichtung. Übertragen Sie auf-80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung. Hinweis: Schritte 1.1-1.6 sind in BSL3-Bedingungen (einschließlich alle tierische Arbeit und Umgang mit infizierten Organen und Geweben) durchgeführt. Gamma bestrahlen die Lunge Biopsien bei 3 Megarads Handhabung außerhalb BSL3 Containment zu ermöglichen. Laser Capture Microdissection auf sterilisierte Gewebe kann durchgeführt werden, innerhalb der BLS3 Anlage wenn Sicherheitsprotokolle zugelassen sind vorhanden. Allerdings beschreibt der Rest dieses Protokolls Weiterverarbeitung in einem BSL-2-Anlage.</li>
</ol>(2) Gewebe schneiden
<ol><li>Die gewünschte Arbeitstemperatur des Kryostaten gesetzt. Die Gamma-Bestrahlung Lungenbiopsie von-80 ° C Lagerung auf den Kryostaten übertragen und für 30 Minuten bis die Gewebetemperatur equilibrate lassen. Hinweis:-20 bis-22 ° C ist optimal für TB Läsion Biopsien.</li>
	<li>Mit einer Pinzette, beheben Sie die Biopsie an der Kryostat-Futter mit einem kleinen Betrag der optimale Temperatur Klebstoff (OCT) auf um die Basis des Gewebes an das Futter zu halten. Das Gewebe zu orientieren, so dass die flache Oberfläche (das war in Kontakt mit der Basis der Cryomold) die freiliegende Oberfläche zum Schneiden ist. Gewährleisten Sie, dass das Office-Anpassungstool die Gewebeoberfläche nicht verschmutzt, da dies die anschließende Massenspektrometrie Analyse beeinträchtigen.</li>
	<li>Schneiden Sie drei Gewebeschnitte bei 25 µm Dicke und montieren Sie auf PET-Membran-Folien. Sanft berühren Sie die Membran zum Abschnitt Gewebe und entfernen. Wenn zu viel Druck ausgeübt wird, kann die dünne Membran reißen.<ol>
<li>Vermeiden Sie übermäßige Handhabung der Dias vor der Montage, da dies in der PET-Membran immer aufgeladen und schlechte Adhäsion von der Gewebeschnitte zur Folge. Sicherstellen Sie, dass die Membran Folie ist bei Raumtemperatur Tauwetter-Montage und erfolgreiche Verklebung des Gewebes an der Membran zu ermöglichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie die Folie aus der Kryostat und 3 Minuten an der Luft trocknen lassen. LCM-LC/MS/MS nicht sofort durchgeführt werden, verschließen Sie die Folie in einem luftdicht verschließbaren Beutel und Transfer zum-80 ° C Lagerung bis zur Präparation erforderlich.</li>
	<li>Schneiden Sie einen angrenzenden Abschnitt 10-12 µm und Tauwetter-Mount auf einem standard Objektträger für Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung und Referenz. Weitere Querschnitte können in dieser Zeit für andere gewünschte Histochemie Flecken (z. B. Ziehl-Niellsen zur Visualisierung von Mycobacterium Tuberculosis (MTB)).</li>
</ol>(3) Mikrodissektion
<ol><li>Versiegelten Beutel mit der Folie von-80 ° C Lagerung und um Raumtemperatur für 5 Minuten zu erreichen. Hinweis: Wenn die kalte Folie sofort die Labor-Atmosphäre ausgesetzt ist, wird das Gewebe mit Kondensation beschichtet werden, und die räumliche Integrität des Arzneimittels beeinträchtigt werden.</li>
	<li>Schalten Sie das Mikroskop und Laser (Laser benötigt ca. 5-10 Minuten warm up, bevor schneiden begonnen werden kann). Flat-Cap 0,20 mL PCR-Röhrchen in den Halter zu laden.</li>
	<li>Objektträger aus dem Beutel nehmen und nehmen ein optisches Bild des Abschnitts Gewebe auf der PET-Folie mit einem Flachbettscanner.</li>
	<li>Legen Sie die Folie in den Diahalter (Gewebeseite nach unten) und bestimmte Granulom Regionen von Interesse, die mit dem Mikroskop Software weisen Sie separate primärgefäßen zu. In der Regel werden diese "unbeteiligte Lunge", "zelluläre Granulom," und "Caseum" (nekrotische Mitte), kann aber variieren je nach der spezifischen Pathologie der Granulom/Biopsie.</li>
	<li>Konzentrieren Sie sich auf das Gewebe mit den 5 X Mikroskopobjektiv. Diese Vergrößerung sollte einen guten Überblick über das Gewebe mit beiden zellulären und nekrotischen Granulom Bereichen bieten. Wählen Sie in der Software das Rohr bezeichnet "Caseum" in Position unter dem Gewebe verschieben.</li>
	<li>Geben Sie die gewünschte Dissektion-Parameter. Typische Einstellungen für eine 25 µm dicken Lunge Abschnitt sind Laserleistung 30, 15, und Blende 35 (willkürliche Einheiten). Jedoch werden diese unterscheiden sich je nach Mikroskop verwendet und Potenzial rückläufiger macht aufgrund des Alters des Lasers.</li>
	<li>Wählen Sie das Werkzeug "frei-ziehen" und mit Maus oder Touchscreen Stift, umreißen Sie die gewünschte Region für Dissektion. Die Fläche der Region werden in der Software angezeigt. Halten Sie die ausgewählte Regionen unter 500.000 µm2 (0,5 mm2) einfacher Dissektion zu erleichtern. Wiederholen Sie die Dissektion bis 3 Millionen µm2 (3 mm2) insgesamt in der Röhre Kappe gesammelt worden.<ol>
<li>Gelegentlich kann die zergliederten Region bleiben stecken an die umgebenden Membran (z.B. durch statische Anziehung) und fallen nicht in die Sammlung-Kappe. Entfernen Sie diese Regionen aus die kumulierte Fläche insgesamt durch Auswahl und innerhalb der Software manuell zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie die Kappe für "zelluläre Läsion" und sammle 3 Millionen µm2 des Gewebes, die nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.7 beschrieben.</li>
	<li>Wählen Sie die Kappe für "unbeteiligte Lunge" und sammle 3 Millionen µm2 des Gewebes, die nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.7 beschrieben. Beachten Sie, dass unbeteiligte Lungengewebe vielen Bronchiolen und alveoläre Räume enthält. Achten Sie besonders auf diese von den definierten Gewebe Regionen für Dissektion auszuschließen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Deckel sorgfältig ausclipsen Sie, verschließen Sie und beschriften Sie jedes Rohr. Schützen Sie die seziert Gewebe aus den umliegenden Luft Störungen (z. B. Air Flow Störungen durch eine sich öffnende Tür). Analysieren die seziert Gewebe sofort, oder bei-80 ° C aufbewahren und Auftauen vor der Verarbeitung und Analyse der LCMS.</li>
</ol>(4) Extraktion und Analyse der LCMS
<ol><li>Bereiten Sie Extraktionslösung von 1:1 Acetonitril/Methanol mit Ethambutol d-10 interne Standard vor. Bei der Auswahl eines internen Standards verwenden eine stabile bezeichnete Form des Analyten Medikaments mit ausreichend Masse Verschiebung Isotop zu vermeiden (z. B. Deuterium-mit der Bezeichnung EMB in dieser Demo verwendet) cross sprechen zwischen den Analyten Droge und Standard (in der Regel mindestens 4 Daltons) . Hinweis: Schaffung von Standards im Homogenat von jedem jeweiligen Gewebetyp ist schwierig, denn es gibt nur eine sehr begrenzte kontrollgewebe mit dem Homogenat Normen erstellt werden soll. Als Alternative zu Standards von einer stacheligen Homogenat Probe zu machen kann ein Standard erstellt werden, indem leere Gewebe und Testverbindung zusammen und extrahieren. Ein Volumen von kontrollgewebe in eine homogenisierte, die das Ziel-Volume von der Studie Probe Gewebeschnitte entspricht wird direkt mit einer Menge an die Testverbindung kombiniert, die in einer bestimmten Konzentration vorhanden sein würde.</li>
	<li>Berechnen Sie das Zielgewebe Volumen anhand der Fläche und Dicke des Abschnitts Gewebe und bestimmen Sie den erforderlichen Verdünnungsfaktor für das Homogenat über das Volumen der Homogenat, die von der Norm und QC Proben hinzugefügt werden. Berechnungen sind unten für 3 Millionen µm2 (3 mm2) seziert Zielgebiet mit 25 µm Dicke und 2 µL Volumen von Homogenat dargestellt. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>Unter der Annahme einer Gewebe-Dichte von 1 g/mL, Homogenat Lager vorbereiten, indem mit einem Gewicht von 50 mg kontrollgewebe und Hinzufügen von PBS-Puffer zu verdünnen (mit Hilfe den 26.67 Homogenat Verdünnungsfaktor errechnet im Schritt 4.2, das Verdünnungsmittel 1,283 mL). Homogenisieren von Perle gegen Lungengewebe und PBS-Puffer für 5 Minuten bei 1750 u/min auf einem Wulst-Homogenisator. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>Verdünnen Sie 1 mg/mL Wirkstoffkonzentration Bestände im 1:1 Acetonitril/Wasser Standardkurve Spick Lösungen zu erstellen. Spick standard Konzentrationen auf der Grundlage der Spike-Volumen und das Zielvolume Gewebe zu bestimmen. Dargestellte Beispiel ist für eine 100 ng/mL standard mit einer 10 µL Spike Volumen. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>Entfernen Sie die Röhrchen mit Microdissected Gewebe von-80 ° C Lagerung und erlauben Sie, um Raumtemperatur für 5 Minuten zu erreichen.</li>
	<li>Die Röhrchen mit Microdissected Gewebe fügen Sie 10 µL 1:1 Acetonitril/Wasser-Lösung und 2 µL PBS-Puffer hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie für Standardkurve und Qualitätskontrolle Röhren 10 µL Lösung 2 µL Kontrolle Lunge Homogenat Spick.</li>
	<li>Jedes Rohr 50 µL der Extraktionslösung hinzufügen.</li>
	<li>Vortex jede Röhre für 5 Minuten, 5 Minuten lang beschallen und Zentrifugieren bei 5000 u/min für 5 Minuten einen Pellet Film- und Gewebe in jedem Röhrchen zu bilden.</li>
	<li>50 µL überstand auf eine 96-Well Deep-Well-Platte übertragen und mit einer zusätzlichen 50 µL deionisiertes Wasser in jede Vertiefung verdünnen.</li>
	<li>Durchführen Sie LC/MS/MS-Analyse mit optimierten Geräteparameter für Ethambutol und Ethambutol-d10 interner Standard (wie oben beschrieben im Detail12).</li>
	<li>Verwenden Sie ein Verdünnungsfaktor, um für die genaue Menge des Gewebes seziert für jede Probe zu korrigieren. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. die Methodenvalidierung
<ol><li>Erstellen Sie eine Homogenat im Lungengewebe Kontrolle durch die Kombination von 1 Teil Lunge, 2 Teile PBS und 3-4 stahlkügelchen. Schlagen Sie Lungengewebe und PBS-Puffer für 5 Minuten bei 1750 u/min mit einer Wulst-Homogenisator.</li>
	<li>Spike der Homogenat durch Zugabe von 10 µL von 1 mg/mL Ethambutol DMSO Lager in 990 µL Homogenat erstelle ich eine Endkonzentration von 10.000 ng/mL (10 mg/mL) und Vortex für 1 Minute.</li>
	<li>Erstellen Sie einen gefrorenen Homogenat Block durch das Homogenat in eine Cryomold Gießen und schnell Einfrieren auf Trockeneis für 5 Minuten.</li>
	<li>Bereiten Sie 25 µm Dicke Abschnitte aus dem Homogenat Block wie in 2.1-2.5 beschrieben vor.</li>
	<li>Das Zielgebiet Gewebe wie angegeben in Schritten 3.2-3.10 zu sezieren.</li>
	<li>Die Röhrchen mit Microdissected Gewebe fügen Sie 10 µL 1:1 Acetonitril/Wasser und 2 µL PBS-Puffer hinzu.</li>
	<li>Jedes Rohr 50 µL der Extraktionslösung hinzufügen. Schritte zum Erstellen einer Standardkurve und bestimmen die Wirkstoffkonzentration im Gewebe Homogenat Block 4,9-4.12.</li>
	<li>Berechnen Sie Extraktionseffizienz mit Hilfe der folgenden Formel: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+(DESI)+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection.">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling.">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li><li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Räumlich aufgelöst Quantifizierung von Medikamenten innerhalb pulmonale TB Läsionen ist erforderlich, um festzustellen, ob Arzneimittelexposition sterilisieren Konzentrationen an Bakterienpopulationen mit Wohnsitz innerhalb der verschiedenen Läsion Fächer erreicht. Die hier beschriebene LCM-LC/MS-Methode ermöglicht absolute Quantifizierung von Anti-TB-Medikamente in alle Fächer der Läsion, einschließlich der Bakterien-reiche Caseum, mit nur 1-3 Gewebeschnitte insgesamt. Traditionelle Gewebe Homogenisierung und L...

Die Fähigkeit, räumlich zu lösen und zu quantifizieren Droge Ebenen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Feststellung, ob Anti-Tuberkulose-Medikamente bakterielle Subpopulationen innerhalb pulmonale Läsionen bei Sterilisation Konzentrationen1erreichen. Von besonderer Bedeutung ist Medikament Eindringen in die nekrotischen Kern der Läsion (genannt Caseum), bestimmen, welche in der Regel enthält die höchste Anzahl von Bazillen und möglicherweise schlecht zugänglichen Drogen wegen fehlender Vaskularisierung.
Traditionelle Methoden zur Läsion eindringen, bewerten die Homogenisierung der ausgeschnittenen pulmonale Läsionen gefolgt von solvent-Extraktion und Analyse der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC/MS) betreffen, sind sehr empfindlich und selektiv für die Medikamente der Interesse. Diese Methoden bieten jedoch schlechte räumliche Informationen, auf die Größe des ursprünglichen homogenisierte Gewebe beschränkt. Massenspektrometrie-basierte Bildgebung Ansätze, wie Matrix-assisted Laser Desorption ionisation (MALDI)2,3, desorption Electrospray Ionisierung (DESI)4 oder Flüssigkeit-Erweiterte Oberfläche Extraktion5, 6 bieten sehr räumlich aufgelöst imaging-Funktionen, direkte Quantifizierung kann jedoch extrem schwierig oder unmöglich aufgrund der heterogenen Ion Unterdrückung Effekte und unterschiedliche Extraktion Wirkungsgrade von Analyten aus der einzelnen Zelle oder Gewebe7. Darüber hinaus sind direkteste Gewebe MS bildgebenden Ansätze von Natur aus weniger empfindlich als LC/MS aufgrund fehlender chromatographische Trennung von endogenen Arten konkurrieren für Ionisierung und die geringeren Wirkungsgrad der solvent-Extraktion der Droge aus Gewebe.
Laser Capture Microdissection (LCM) in Kombination mit LC/MS-Analyse wurde routinemäßig angewendet zu isolieren und zu charakterisieren verschiedene Gewebe Regionen für Proteomik8,9 Studien und vor kurzem verwendet für die Droge Quantifizierung dosiert tierisches Gewebe10. Hier präsentieren wir Ihnen eine optimierte Protokoll Anwendung LCM kombiniert mit LC/MS (LCM-LC/MS)-Analyse, um Anti-TB-Medikamente in unterschiedlichen Granulom Fächer zu quantifizieren. Laser Capture Microdissection dabei konzentriert sich ein UV-Laser durch das Mikroskopobjektiv auf Gewebe, die schneidet und isoliert die gewünschte Gewebebereich ein Pfad durch den Benutzer definiert. Schwerkraft-unterstützte LCM (die Technik für diese Forschung verwendet), Abschnitt Gewebe wird auf einer dünnen Polymer-Membran-Folie (PET oder Stift) montiert und das Gewebe wird in einer Sammlung Rohr Kappe gelegen unterhalb der Folie erfasst. Die Medikamente werden aus dem ausgeschnittenen Gewebe extrahiert und quantifiziert mit LC/MS Standardansätze. Die Menge des Gewebes zu erhebenden erforderlich wird letztlich von der erwarteten Konzentration des Medikaments im Gewebe vorhanden und die Empfindlichkeit der LC/MS-Methode bestimmt. Für die meisten Analysen von Drogen auf therapeutische Ebenen dosiert und analysiert mit Hilfe einer routinemäßigen triple Quadrupol-Massenspektrometer, 3 Millionen µm2 (3 mm2) des Gewebes ist die Fläche ausreichend.
Dieses Protokoll beschreibt die kraftvolle Kombination von räumlichen Profilierung und vollständigen Quantifizierung von LCM-LC/MS, bietet absolute Droge Konzentrationen in allen Abteilen der TB Granulome angeboten. Die Technik kann auch angewendet werden, zu bestimmen, Droge-Konzentrationen in vielen verschiedenen erkrankten Geweben lebenswichtige Medikament Entdeckung und Entwicklung informieren.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White rabbits</td><td>Covance</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL flat-cap PCR tubes</td><td>Corning</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>Steel frames, PET-membrane</td><td>Leica</td><td>11505151</td><td></td></tr><tr><td>Premium Frosted Microscope Slides</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96 Deep well plate 2.0ML PP RB</td><td>Fisher</td><td>NC0363259</td><td></td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &amp;mu;m)</td><td>Agilent</td><td>820631-001D</td><td></td></tr><tr><td>&quot;Zipper&amp;rdquo; Seal Sample Bags</td><td>Fisher</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 cryostat</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica CM1860 is the current model</td></tr><tr><td>Laser Microdissection System 6500</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica LMD 6 is the current model</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

Tuberkulose ist nach wie vor eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. Verbesserungen an vorhandenen Drogen-Therapien und die Entwicklung neuer Therapeutika werden dringend gebraucht. Die Fähigkeit der dosierten TB-Medikamente zu erreichen und Sterilisieren Bakterien innerhalb schlecht durchblutet nekrotische Regionen (Caseum) der pulmonale Granulome ist entscheidend für eine erfolgreiche therapeutische Intervention. Effektive therapeutische Therapien müssen daher Medikamente mit günstigen Caseum Eindringvermögen enthalten. Aktuelle LC/MS-Methoden zur Quantifizierung der Droge Ebenen in biologischen Geweben haben begrenzte räumliche Auflösung Fähigkeiten, macht es schwierig, genau festzustellen, absolute Droge Konzentrationen innerhalb kleiner Gewebe Fächer wie die gefunden in nekrotische Granulome. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit LC/MS Quantifizierung Laser Capture Microdissection (LCM) pathologisch unterschiedliche Gewebe Regionen kombinieren. Diese Technik bietet absolute Quantifizierung von Medikamenten innerhalb von Granulomen Caseum, um zelluläre Läsion und unbeteiligte Lungengewebe und daher genau bestimmt, ob bakterizide Konzentrationen erreicht werden. Neben der Tuberkuloseforschung hat die Technik viele Anwendungsmöglichkeiten für räumlich aufgelöst Quantifizierung von Drogen im erkrankten Gewebe.

Ein Überblick über die LCM-LC/MS-Ansatz ist in Abbildung 1dargestellt. Nach der Sterilisierung des Gewebes durch Gamma-Bestrahlung, statt alle weiteren Schritte (von Gewebe schneiden ab) außerhalb BSL3-Bedingungen. Abbildung 2 zeigt die Läsion Biopsie Abschnitte vor und nach dem Gewebe isoliert von LCM. Nekrotische und zelluläre Bereiche des TB Läsionen können leicht identifiziert und isoliert durch visuelle Inspektion der...

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Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Laser Capture Microdissection gepaart mit LC/MS-Analyse, um räumlich-Droge-Verteilungen innerhalb von Lungentuberkulose Granulome zu quantifizieren. Dieser Ansatz hat breite Anwendbarkeit auf Droge-Konzentrationen in den Geweben an hohe räumliche Details zu quantifizieren.

Räumliche Quantifizierung von Drogen in der Lungentuberkulose Läsionen durch Laser Capture Microdissection Flüssigkeit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

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Unit 1

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Aufrufe.  Rutgers, The State University of New Jersey. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Laser Capture Microdissection gepaart mit LC/MS-Analyse, um räumlich-Droge-Verteilungen innerhalb von Lungentuberkulose Granulome zu quantifizieren. Dieser Ansatz hat breite Anwendbarkeit auf Droge-Konzentrationen in den Geweben an hohe räumliche Details zu quantifizieren.

Serie: Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Probenvorbereitung von<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extrakte für Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

Eine integrierte Raman-Spektroskopie- und Massenspektrometrie-Plattform zur Untersuchung der Aufnahme von Einzelzellen-Medikamenten, des Stoffwechsels und der Effekte

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Biochemie

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektions

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum-Bindungsassay, der die Drug Penetration in Tuberkulose-Läsionen vorhersagt

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analyse der 18FDG PET/CT Imaging als Werkzeug für Studium Mycobacterium-Tuberkulose -Infektion und Behandlung bei nicht-menschlichen Primaten

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

Ein Tuberkulose-Molekularer bakterieller Belastungstest (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. Human-infective trypanosomatid parasites include Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease; Trypanosoma brucei, the&#160;causative agent of sleeping sickness; and Leishmania species, causative agents of leishmaniasis. Jointly, they affect 20 million people across the globe. These parasites show specific tropism: heart, esophagus, colon for T. cruzi, adipose tissue, pancreas, skin, circulatory system and central nervous system for T. brucei, skin for dermotropic Leishmania strains, and liver, spleen, and bone marrow for viscerotropic Leishmania strains. A spatial perspective is therefore essential to understand trypanosomatid disease pathogenesis. Chemical cartography generates 3D visualizations of small molecule abundance generated via liquid chromatography-mass spectrometry, in comparison to microbiological and immunological parameters. This protocol demonstrates how chemical cartography can be applied to study pathogenic processes during trypanosomatid infection, beginning from systematic tissue sampling and metabolite extraction, followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, and concluding with the generation of 3D maps of metabolite distribution. This method can be used for multiple research questions, such as nutrient requirements for tissue colonization by T. cruzi, T. brucei, or Leishmania, immunometabolism at sites of infection, and the relationship between local tissue metabolic perturbation and clinical disease symptoms, leading to comprehensive insight into trypanosomatid disease pathogenesis.

This protocol describes the steps to generate a 3D model of metabolite distribution during trypanosomatid infection, including sample collection, metabolite extraction, an overview of liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, 3D model generation, and finally, data visualization.

Chemische Kartographie Ansätze zur Untersuchung der Trypanosomatideninfektion

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

Validiertes LC-MS/MS Panel zur Quantifizierung von 11 medikamentenresistenten TB-Medikamenten in kleinen Haarproben

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Medizin

Beschleunigung der Tuberkulosebestimmung mit der Mikro-KBE-Methode

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic. The disease is caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb). The Mycobacterium bovis strain Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), the only TB vaccine, is the oldest licensed vaccine in the world, still in use. Currently, there are 12 vaccines in clinical trials and dozens of vaccines under pre-clinical development. The method of choice used to assess the efficacy of TB vaccines in pre-clinical studies is the enumeration of bacterial colonies by the colony-forming units (CFU) assay. This time-consuming assay takes 4 to 6 weeks to conclude, requires substantial laboratory and incubator space, has high reagent costs, and is prone to contamination. Here we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), that offers a simple and rapid solution to analyze M.tb vaccine efficacy results. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. Moreover, to evaluate the efficacy of a TB vaccine, samples may be obtained from a variety of sources, including tissues from vaccinated animals infected with Mycobacteria. We also describe an optimized method to produce a unicellular, uniform, and high-quality mycobacterial culture for infection studies. Finally, we propose that these methods should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB.

Autor im Rampenlicht: Optimierung der KBE-Bestimmung für eine effiziente Bewertung der Wirksamkeit von TB-Impfstoffen und der Analyse der Antigenpräsentation 

The determination of colony-forming units (CFU) is the gold-standard technique for quantifying bacteria, including Mycobacterium tuberculosis which can take weeks to form visible colonies. Here we describe a micro-CFU for CFU determination with increased time efficiency, reduced lab space and reagent cost, and scalability to medium and high throughput experiments.

Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

Räumliche Quantifizierung von Drogen in der Lungentuberkulose Läsionen durch Laser Capture Microdissection Flüssigkeit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCM-LC/MS)

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Probenvorbereitung von

Eine integrierte Raman-Spektroskopie- und Massenspektrometrie-Plattform zur Untersuchung der Aufnahme von Einzelzellen-Medikamenten, des Stoffwechsels und der Effekte

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf

Ein

Analyse der ¹⁸FDG PET/CT Imaging als Werkzeug für Studium Mycobacterium-Tuberkulose -Infektion und Behandlung bei nicht-menschlichen Primaten

Ein Tuberkulose-Molekularer bakterieller Belastungstest (TB-MBLA)

Chemische Kartographie Ansätze zur Untersuchung der Trypanosomatideninfektion

Validiertes LC-MS/MS Panel zur Quantifizierung von 11 medikamentenresistenten TB-Medikamenten in kleinen Haarproben

Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose