Name: spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)
Uploaded: 2018-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

原稿のレーザーマイクロダイ キャプチャおよび Jansy Sarathy 前にウサギの組織の γ 線照射と助け、ポール o ' brien、Marizel ミナと動物実験のイザベラ ・自由民権、ジャ ・ ゴンザレスと NIH/NIAID からダニエル Weiner に感謝します。考えやアドバイス。この作品は、ビルからの資金によって支えられた、メリンダ ・ ゲイツ財団 (OPP1174780) と共有 NIH 計装 1S10OD018072 を付与します。ありがとう Eliseo A. Eugenin ライカ LMD 6500 顕微鏡へのアクセスを提供し、専門知識やアドバイスを共有します。購入・継続的な支援、LMD 6500 国立精神衛生研究所の助成金、MH096625、国立神経疾患と脳卒中、NS105584、運輸 (E.A.E) への資金と (E.A.E) に GSK 貢献によって資金を供給されました。

すべての動物の研究は、ケアと機関の動物愛護からの承認と健康の国民の協会の実験動物の使用および使用委員会の NIAID (NIH)、ベテスダ、メリーランド州のガイドに従って行われました。
1. 動物実験とティッシュのコレクション
プロトコルのこのセクションでは、動物の手続きとバイオ セーフティ レベル 3 (BSL3) の条件下でサンプルのコレクションについて説明します。結核菌エアロゾル感染プロシージャおよび薬物の管理のウサギのプロトコルがされている詳細なプロトコルは前述11,12。
<ol><li>感染結核HN878 とニュージーランド白ウサギ (男性と 4-5 ヶ月の古い女性)11鼻専用のエアゾール システムを使用すると、前述したようです。</li>
	<li>2、6、および投与 24 h で動物の安楽死し、最寄りのルート経由で選択した薬 (ここで紹介する例ではエタンブトール) を管理します。まず、5 mg/kg では 35 mg/kg とキシラジン投与ケタミンでウサギを麻酔します。10 分待つし、尾をつまんと目に優しく触れ、適切な anesthetization を確認します。反応がない場合は、1 mL/4.5 kg 2 mL 滅菌生理食塩水でペントバルビ タールとフェニトイン (材料の表参照) の静脈内投与によって安楽死させます。 注: これらの縦長、エタンブトールの薬物動態学的プロファイルをカバーするために最適であり、他の研究薬の調整/最適化する必要があります。</li>
	<li>鉗子、はさみ、メスを使用して、胸腔内から肺を削除、周囲の関与しない肺組織 (前述3) に埋め込まれた大きな壊死性肉芽腫を含む肺生検を切除します。壊死性肉芽腫が表示されますのベージュの色し、周囲の赤/ピンク色の肺から通常わずかに突出しています。簡単なセクショニングを促進するため、生検、2 × 1.5 × 1.5 cm を超えないように。</li>
	<li>鉗子を使用して、トレイのベースとの直接接触に必要な切削面をあらかじめラベル付き cryomold トレイの上に生検を配置します。フリーズの後これは凍結切片がカットされます平らな面を提供します。</li>
	<li>液体窒素の蒸気で生検を凍結します。液体窒素で 2 インチの深さに発泡スチロール容器を満たし、金属電線管ラックを配置します。ラックは必要があります組織トレーが配置されている平らな面を提供する液体窒素の表面上に突出しています。発泡スチロール容器にふたを閉めて 10 分の間完全に凍結する組織を残します。</li>
	<li>ティッシュ トレイを取り外してすぐにアルミ フィルムでラップにジッパーのついたビニール袋やシールを個別にラベルを配置します。ストレージの-80 ° C のフリーザーに転送します。 注: 手順 1.1 1.6 は BSL3 条件 (感染した臓器や組織の処理とすべての動物の仕事を含む) で実行されます。ガンマ照射 BSL3 格納容器外の処理を有効にする 3 メガラドに肺生検。施設安全プロトコルを承認された場合は、場所 BLS3 内無殺菌組織マイクロダイゼクション キャプチャが行われます。ただし、このプロトコルの残りの部分は、BSL 2 施設の下流の処理について説明します。</li>
</ol>2. ティッシュ
<ol><li>クリオスタットを必要な切削温度に設定します。クリオスタットに-80 ° C のストレージからガンマ線照射肺生検を転送し、組織温度を平衡に 30 分間放置します。注:-20 ~-22 ° C は結核病変の生検に最適です。</li>
	<li>ピンセットを使用して、クライオスタット チャック チャックに組織の基本を遵守する最適な切削温度接着剤 (OCT) の少量を使用するために生検を修正します。平らな面 (つまり、cryomold のベースと接触していた) が切断の表面組織に合わせます。これは後続の質量分析を妨げる可能性がある OCT は組織表面を汚染しないようにします。</li>
	<li>25 μ m の厚みで 3 つの組織切片をカットし、ペット膜スライド上にマウントします。優しくティッシュ セクションに膜をタッチし、削除します。あまりにも多くの圧力を適用すると、薄い膜が破ける可能性があります。<ol>
<li>ティッシュ セクションの帯電と貧しい接着になるペット膜になるのでマウントする前にスライドの過剰な処理を避けてください。膜スライドは膜組織の融解取付や成功を付着できるように室温で保たれることを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クリオスタットからスライドを削除し、3 分間の空気乾燥することができます。LCM-LC ・ MS/MS は直ちには行われず場合は、シール気密密閉式の小袋と郭清の必要になるまで-80 ° C のストレージに転送のスライドです。</li>
	<li>10-12 μ m と雪解け-マウント ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色および参照のための標準的なガラス スライド上で隣接するセクションをカットします。追加のセクションは、この時 (結核菌 (MTB) を可視化する抗 Niellsen) などの他の目的の組織化学汚れにカットできます。</li>
</ol>3. レーザーマイクロダイ セクション
<ol><li>-80 ° C のストレージからスライドを含んでいる密封された袋を取り外し、5 分間室温に到達することができます。 注: 場合は冷たいスライドは研究室の雰囲気にさらされてすぐに、組織が凝縮、被覆となるし、薬剤の空間の整合性が危険にさらされる可能性があります。</li>
	<li>顕微鏡やレーザーをオンに (レーザーは、切断を開始する前に 5 〜 10 分のウォーム アップを必要と)。フラット キャップ 0.20 mL PCR チューブをホルダーに読み込みます。</li>
	<li>袋からスライドを外し、フラット ベッド スキャナーを使用してペット スライドの組織切片の光学像を取る。</li>
	<li>スライド ホルダー (組織面を下に向けて) にスライドを配置し、顕微鏡のソフトウェアを使用して興味の特定の肉芽腫領域に別のコレクション チューブを割り当てます。通常、これらは関与しない 『 肺 』、'細胞肉芽腫、' になり、'caseum' (壊死部) であるが、特定の肉芽腫/生検病理によって異なります。</li>
	<li>対物レンズ × 5 を使用して組織に焦点を当てます。この倍率は、両方の細胞と壊死性肉芽腫領域を含む組織の良い概要を提供する必要があります。ソフトウェア組織の下の位置に移動する 'caseum' を指定したチューブを選択します。</li>
	<li>必要な解剖パラメーターを入力します。25 μ m 厚の肺セクションの典型的な設定はレーザー パワー 30、速度 15 と絞り値 35 (任意の単位)。ただし、これらは使用顕微鏡とレーザの年齢のための力の低下の可能性に応じて異なります。</li>
	<li>' 自由に描画」ツールを選択し、マウスまたはタッチ スクリーンのペンを使用して、郭清の目的の地域を説明します。地域の面積は、ソフトウェアで表示されます。500,000 μ m2 (0.5 mm2) 容易に解離を容易にするために選択された領域を維持します。チューブ キャップの合計で収集された 300 万 μ m2 (3 mm2) まで郭清を繰り返します。<ol>
<li>機会に、切り裂かれた地域があります (たとえば静的魅力) のための周囲の膜に立ち往生のままし、コレクション キャップに分類されません。ソフトウェア内で手動で削除するを選択して、累積的な表面積の合計からこれらの領域を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>'細胞病変」のキャップを選択し、300 万 μ m2 3.7 のステップで説明したように同じプロセスを使用して組織を収集します。</li>
	<li>'関与しない肺' 用のキャップを選択し、300 万 μ m2 3.7 のステップで説明したように同じプロセスを使用して組織を収集します。多くの細気管支および肺胞腔が関与しない肺組織に含まれていることに注意してください。郭清のために定義された組織領域から除外する注意を払います。</li>
	<li>キャップ ホルダーをはずし、慎重に外す、シール、各チューブにラベルを付けます。周囲の空気妨害 (開いたドアから空気流れ中断など) から切り裂かれたティッシュを保護します。切り裂かれたティッシュをすぐに分析または-80 ° C で保存し、解凍処理および LCMS 分析する前に。</li>
</ol>4. 抽出および LCMS 分析
<ol><li>1:1 アセトニ トリル/メタノール エタンブトール d-10 内部標準を含む抽出液を準備します。使用、安定したラベル付きの試料薬剤 (のような重水素標識 EMB は、このデモで使用) 同位体を避けるために十分な質量シフトと十字の形態の試料薬と標準 (通常 4 ダルトン最低) 話内部標準を選択すると、. 注: は、ホモジネートの基準を作成するための非常に限られたコントロール組織があるため困難です各それぞれの組織型の磨砕液の規格を作成します。スパイク ホモジネート サンプルからの標準を作る代わりに、標準は空白組織とテスト混合物抽出と一緒を追加することによって作成できます。研究サンプルの切片のターゲット ・ ボリュームに合ったホモジネートの管理組織のボリュームは、特定の濃度であると思われる試験化合物の量と直接結合されます。</li>
	<li>表面積と組織切片の厚さに基づいて対象となる組織の体積を計算し、標準や QC サンプルに追加されますホモジネートのボリュームを使用して磨砕液のために必要な希釈倍率を決定します。25 μ m の厚みと磨砕液 2 μ L 量 300 万 μ m2 (3 mm2) 解剖ターゲット領域の計算が下図の。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>管理組織の 50 mg を計量し、希釈する PBS バッファーを追加して磨砕液のストックを準備組織密度 1 g/mL と仮定すると (26.67 磨砕液の希釈係数を用いたステップで計算された 4.2, 希釈剤は 1.283 mL)。ビーズ ビーズ ホモジナイザーで 1750 rpm で 5 分間肺組織と PBS バッファーを打つことによって均質化します。 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>ソリューションをスパイク標準曲線を作成する 1:1 アセトニ トリル/水 1 mg/mL 医薬品株濃度を希釈します。スパイク スパイク ボリュームとターゲットの組織ボリュームに基づき標準的な濃度を決定します。図示の例は 100 ng/mL 10 μ L スパイク ボリュームを使用して標準的なのです。 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>-80 ° C のストレージから microdissected 組織を含むチューブを削除し、5 分間室温に到達できるようにします。</li>
	<li>Microdissected 組織を含むチューブと 1:1 アセトニ トリル/水液の 10 μ L と 2 μ L の PBS バッファーを追加します。</li>
	<li>標準曲線および品質管理チューブ、コントロール肺乳剤を 2 μ l 添加するソリューションをスパイクの 10 μ L を追加します。</li>
	<li>各チューブに抽出溶液 50 μ L を追加します。</li>
	<li>渦各チューブ、5 分間 5 分間超音波し、フィルムや各管内組織のペレットを形成する 5 分間 5000 RPM で遠心分離機します。</li>
	<li>深井戸 96 ウェル プレートに上澄みの 50 μ L を転送し、各ウェルの脱イオン水の追加の 50 μ L で希釈します。</li>
	<li>クロマトグラフィー/タンデム質量分析 (前述の記載は詳細12) エタンブトールとエタンブトール d10 の内部標準に最適化された計測器パラメーターを使用してを実行します。</li>
	<li>各サンプルの解剖組織の正確な量を補正するためには、希釈係数を使用します。 <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. 方法の検証
<ol><li>1 部分肺、2 部分 PBS 3 4 スチール ビーズを組み合わせることにより制御肺組織で、磨砕液を作成します。ビーズ ホモジナイザーを使用して 1750 rpm で 5 分間肺組織と PBS バッファーを破った。</li>
	<li>1 分の 10,000 の ng/mL (10 mg/mL) と渦の最終濃度を作成する 990 μ L ホモジネートに 1 mg/mL エタンブトール DMSO 株式の 10 μ L を追加することで磨砕液をスパイクします。</li>
	<li>Cryomold に磨砕液を注ぐと 5 分のドライアイスで急速に凍結して冷凍ホモジネート ブロックを作成します。</li>
	<li>手順 2.1 2.5 でホモジネート ブロックから 25 μ m 厚いセクションを準備します。</li>
	<li>3.2 3.10 の手順で指定したターゲット組織領域を分析します。</li>
	<li>Microdissected 組織を含むチューブに 10 μ L 1:1 アセトニ トリル/水と 2 μ L の PBS バッファーを追加します。</li>
	<li>各チューブに抽出溶液 50 μ L を追加します。標準曲線を作成し、組織ホモジネート ブロック内薬物濃度を判断 4.9 4.12 の手順に従います。</li>
	<li>以下の数式を使用して抽出効率を計算します。 <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+(DESI)+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection.">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling.">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li><li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections.">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li><li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies.">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li><li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging,+laser+capture+microdissection,+and+LC-MS/MS+of+the+same+tissue+section.">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li><li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics:+methodologies+and+clinical+applications.">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li><li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis.">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+A+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).</li><li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy.">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li><li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis.">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model.">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li><li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response.">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

肺の結核病巣内薬剤の空間分解の定量化は、薬曝露異なる病変コンパートメント内に存在する細菌の集団に殺菌濃度に達するかどうかを決定する必要があります。ここで説明した LCM LC/MS メソッドには、合計だけ 1-3 切片を使用して細菌の豊富な caseum を含むすべての病変のコンパートメント内にある抗結核薬の絶対定量ができます。伝統的な組織の均質化、しばしば体内薬物定量化の LC/MS 方...

空間的解決および薬剤のレベルを定量化する能力は、抗結核薬殺菌濃度1で肺の病変内細菌集団に達するかどうかを決定するための重要な要件です。特に重要なは通常細菌の最大数が含まれていますし、悪い血管新生の不在のための薬にアクセスできること (呼ばれる caseum) 部位、壊死性コアに麻薬浸透を決定です。
切除肺の病変の均質化を伴う病変の浸透を評価するために伝統的な方法溶媒抽出と液体クロマトグラフィー質量分析法 (LC/MS) の分析に続いて、高選択性の薬剤のため関心します。ただし、これらのメソッドは、貧しい空間については、元の均質化組織のサイズに制限を提供しています。エレクトロ スプレー イオン化 (デジ)4または液体が強化された表面抽出5、質量分析を用いたイメージング技術、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI)2,3などが脱離します。 6高空間分解イメージング機能を提供するが、直接定量は非常に挑戦的なまたは異種イオン抑制効果と様々 な細胞から試料の異なる抽出効率のために不可能することができますまたは、組織の7種類します。また、最も直接組織 MS イメージング技術は本質的にイオン化し、組織から薬物の低い溶媒抽出効率を奪い合う内因性種のクロマト グラフ分離の不足のための液体クロマトグラフィー/質量よりも敏感です。
レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) 液体クロマトグラフィー/質量分析と組み合わせるが日常的に分離し、異なる組織領域を特徴づけるプロテオーム研究8,9に適用されており、最近薬の定量化のために利用で投与動物組織10。ここで明確な肉芽腫コンパートメント内にある抗結核薬を定量化する LCM (LCM-LC/MS) の液体クロマトグラフィー/質量分析と組み合わせるを適用した最適化されたプロトコルを提案する.レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション処理で紫外線レーザー焦点カットし、ユーザーが定義したパスに従うことによって目的の組織領域を分離する組織切片上に対物レンズ。重力アシスト LCM (本研究の要素技術) のティッシュ セクションは高分子薄膜の膜スライド (ペットまたはペン) にマウントされ、組織がスライドの下に配置されているコレクション チューブ キャップでキャプチャされます。薬を摘出組織から抽出し、標準の LC/MS のアプローチを用いて定量化.収集するために必要な組織の量は、予想される組織内に存在の薬物濃度と LC/MS 法の感度から最終的に決定されます。薬物治療上のレベルで投与を行い, 組織のルーチンのトリプル四重極質量分析計、300 万 μ m2 (3 mm2) を使用して多くの解析面積で十分です。
このプロトコルを記述する空間プロファイルの強力な組み合わせとにおける定量化提供 LCM-LC/MS による結核の肉芽腫のすべてのコンパートメント内にある絶対薬物濃度を提供します。技術は、重要な薬の発見と開発の情報を提供する多くの異なる病気にかかったティッシュで薬物濃度を決定するのにも適用可能性があります。

<table><tbody><tr><td>New Zealand White rabbits</td><td>Covance</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL flat-cap PCR tubes</td><td>Corning</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>Steel frames, PET-membrane</td><td>Leica</td><td>11505151</td><td></td></tr><tr><td>Premium Frosted Microscope Slides</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96 Deep well plate 2.0ML PP RB</td><td>Fisher</td><td>NC0363259</td><td></td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &amp;mu;m)</td><td>Agilent</td><td>820631-001D</td><td></td></tr><tr><td>&quot;Zipper&amp;rdquo; Seal Sample Bags</td><td>Fisher</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 cryostat</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica CM1860 is the current model</td></tr><tr><td>Laser Microdissection System 6500</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica LMD 6 is the current model</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

結核はまだ罹患率と死亡率の世界の主要な原因であります。既存の薬物療法への改善と新規治療法の開発が緊急に必要です。成功した治療的介入に到達し、悪い血管壊死領域内 (caseum) 肺肉芽腫の細菌を滅菌する投与の結核薬の能力は欠かせません。効果的な化学療法従って有利な caseum の浸透性薬剤を含める必要があります。生体内薬物レベルを定量化するため現在の LC/MS メソッドの内で見られるよう小さな組織コンパートメント内にある絶対薬物濃度を正確に決定するが難しく、空間分解能機能が制限します。壊死性肉芽腫。病理学的個別組織領域のレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を組み合わせて LC/MS 定量化のプロトコルをご紹介します。この手法は肉芽腫 caseum、周辺細胞の病変と関与しない肺組織内で薬の絶対定量を提供し、したがって、正確に殺菌濃度が達成されているかどうかを判断します。結核研究に加えて技術罹病組織における薬の空間分布の定量化のための多くの潜在的なアプリケーションには。

LCM LC/MS アプローチの概要を図 1に示します。Γ 線照射による組織を殺菌後 (ティッシュ以降) からすべての後続の手順は BSL3 条件外開催します。図 2は、LCM によって組織分離の前後に、病変生検セクションを示しています。結核病巣の壊死と携帯電話のエリアを簡単に識別および光学画像 (隣接する組織の組織学的染色のセ?...

Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

ここでは、結核の肉芽腫内の薬剤分布の定量化が空間的に LC/MS 分析と相まってマイクロダイゼクション キャプチャを使用してプロトコルについて述べる。アプローチは高い空間の詳細で組織内の薬物濃度を定量化する幅広い適用性。

レーザーによる肺の結核病変における薬物の空間の定量化をキャプチャ レーザーマイクロダイ セクション液体クロマトグラフィー質量分析法 (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K ビュー.  Rutgers, The State University of New Jersey. ここでは、結核の肉芽腫内の薬剤分布の定量化が空間的に LC/MS 分析と相まってマイクロダイゼクション キャプチャを使用してプロトコルについて述べる。アプローチは高い空間の詳細で組織内の薬物濃度を定量化する幅広い適用性。

ビデオ: Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

のサンプル調製<em&gt;結核菌</em核磁気共鳴代謝研究のための&gt;抽出

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

免疫・感染学

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

単細胞薬の取り込み、代謝、および効果を研究するための統合ラマン分光法と質量分析プラットフォーム

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

生化学

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

回復への新規マイクロダイセクションアプローチ<em&gt;結核菌</em肺肉芽腫、ホルマリン固定パラフィン包埋から&gt;特異的転写

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル<em&gt;結核菌</em&gt;感染

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;結核病変における薬物侵入を予測するカゼウム結合アッセイ

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

18FDG PET/CT イメージング勉強結核感染と非ひと霊長類における治療のためのツールとしての解析

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

結核分子細菌負荷アッセイ(TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. Human-infective trypanosomatid parasites include Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease; Trypanosoma brucei, the&#160;causative agent of sleeping sickness; and Leishmania species, causative agents of leishmaniasis. Jointly, they affect 20 million people across the globe. These parasites show specific tropism: heart, esophagus, colon for T. cruzi, adipose tissue, pancreas, skin, circulatory system and central nervous system for T. brucei, skin for dermotropic Leishmania strains, and liver, spleen, and bone marrow for viscerotropic Leishmania strains. A spatial perspective is therefore essential to understand trypanosomatid disease pathogenesis. Chemical cartography generates 3D visualizations of small molecule abundance generated via liquid chromatography-mass spectrometry, in comparison to microbiological and immunological parameters. This protocol demonstrates how chemical cartography can be applied to study pathogenic processes during trypanosomatid infection, beginning from systematic tissue sampling and metabolite extraction, followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, and concluding with the generation of 3D maps of metabolite distribution. This method can be used for multiple research questions, such as nutrient requirements for tissue colonization by T. cruzi, T. brucei, or Leishmania, immunometabolism at sites of infection, and the relationship between local tissue metabolic perturbation and clinical disease symptoms, leading to comprehensive insight into trypanosomatid disease pathogenesis.

This protocol describes the steps to generate a 3D model of metabolite distribution during trypanosomatid infection, including sample collection, metabolite extraction, an overview of liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, 3D model generation, and finally, data visualization.

トリパノソマチド感染を研究するための化学地図作成アプローチ

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

小さな毛髪サンプルで11の薬剤耐性結核薬を定量化するための検証済みのLC-MS/MSパネル

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

医学

Micro-CFU法による結核判定の迅速化

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic. The disease is caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb). The Mycobacterium bovis strain Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), the only TB vaccine, is the oldest licensed vaccine in the world, still in use. Currently, there are 12 vaccines in clinical trials and dozens of vaccines under pre-clinical development. The method of choice used to assess the efficacy of TB vaccines in pre-clinical studies is the enumeration of bacterial colonies by the colony-forming units (CFU) assay. This time-consuming assay takes 4 to 6 weeks to conclude, requires substantial laboratory and incubator space, has high reagent costs, and is prone to contamination. Here we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), that offers a simple and rapid solution to analyze M.tb vaccine efficacy results. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. Moreover, to evaluate the efficacy of a TB vaccine, samples may be obtained from a variety of sources, including tissues from vaccinated animals infected with Mycobacteria. We also describe an optimized method to produce a unicellular, uniform, and high-quality mycobacterial culture for infection studies. Finally, we propose that these methods should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB.

著者スポットライト:結核ワクチンの有効性と抗原提示分析の効率的な評価のためのCFU決定の最適化 

The determination of colony-forming units (CFU) is the gold-standard technique for quantifying bacteria, including Mycobacterium tuberculosis which can take weeks to form visible colonies. Here we describe a micro-CFU for CFU determination with increased time efficiency, reduced lab space and reagent cost, and scalability to medium and high throughput experiments.

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

レーザーによる肺の結核病変における薬物の空間の定量化をキャプチャレーザーマイクロダイセクション液体クロマトグラフィー質量分析法 (LCM-LC/MS)

要約

さらに動画を探す

この動画の章

のサンプル調製

単細胞薬の取り込み、代謝、および効果を研究するための統合ラマン分光法と質量分析プラットフォーム

回復への新規マイクロダイセクションアプローチ

上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル

アン

¹⁸FDG PET/CT イメージング勉強結核感染と非ひと霊長類における治療のためのツールとしての解析

結核分子細菌負荷アッセイ(TB-MBLA)

トリパノソマチド感染を研究するための化学地図作成アプローチ

小さな毛髪サンプルで11の薬剤耐性結核薬を定量化するための検証済みのLC-MS/MSパネル

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

レーザーによる肺の結核病変における薬物の空間の定量化をキャプチャ レーザーマイクロダイ セクション液体クロマトグラフィー質量分析法 (LCM-LC/MS)

要約

さらに動画を探す

この動画の章

のサンプル調製

単細胞薬の取り込み、代謝、および効果を研究するための統合ラマン分光法と質量分析プラットフォーム

回復への新規マイクロダイセクションアプローチ

上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル

アン

18FDG PET/CT イメージング勉強結核感染と非ひと霊長類における治療のためのツールとしての解析

結核分子細菌負荷アッセイ(TB-MBLA)

トリパノソマチド感染を研究するための化学地図作成アプローチ

小さな毛髪サンプルで11の薬剤耐性結核薬を定量化するための検証済みのLC-MS/MSパネル

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

レーザーによる肺の結核病変における薬物の空間の定量化をキャプチャレーザーマイクロダイセクション液体クロマトグラフィー質量分析法 (LCM-LC/MS)

¹⁸FDG PET/CT イメージング勉強結核感染と非ひと霊長類における治療のためのツールとしての解析