ونحن نشكر أوبراين بول، مني مارزيل وايزابيلا فريدمان للتجارب على الحيوانات، Jacquie غونزاليس وينر دانييل من المعاهد الوطنية للصحة/نييد للحصول على تعليمات غاما تشعيع الأنسجة الأرنب قبل الليزر التقاط ميكروديسيكشن وساراثي جانسى للمخطوطات الأفكار والمشورة. هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من مشروع القانون، ومنح "وميليندا غيتس" (OPP1174780) والأجهزة المشتركة في المعاهد الوطنية للصحة 1S10OD018072. ونحن نشكر ايليسيو ألف يوجينين لتوفير الوصول إلى المجهر 6500 أمد إيكا وتبادل الخبرة والمشورة. شراء، والدعم المستمر، ومولت 6500 أمد منح "المعهد الوطني للصحة العقلية"، MH096625، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية، NS105584، فري التمويل (إلى E.A.E) ومساهمات GSK (إلى E.A.E).

أجريت جميع الدراسات الحيوانية وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "معاهد الصحة الوطنية" بموافقة من "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة نييد (المعاهد الوطنية للصحة)، بيثيسدا، ماريلاند
1-الحيوانات التجارب وجمع الأنسجة
يصف هذا القسم من البروتوكول إجراءات الحيوان وجمع العينات تحت ظروف السلامة الأحيائية المستوى 3 (BSL3). ووصف بروتوكولات مفصلة متفطره الأيروسول العدوى الداخلي والمخدرات الإدارة البروتوكولات في الأرانب كانت سابقا11،12.
<ol><li>يصيب الأرانب "البيضاء نيوزيلندا" (الذكور والإناث في سن 4-5 أشهر) مع السل م. HN878 باستخدام نظام أيروسول الآنف فقط، كما تم وصفه سابقا11.</li>
	<li>إدارة العقاقير المختارة (وإيثامبوتول في المثال المعروض هنا) عبر الطريق المفضل و euthanize الحيوانات في 2 و 6 و 24 ساعة بعد الإدارة. أولاً، تخدير الأرنب عن طريق الحقن العضلي من الكيتامين في 35 مغ/كغ وإكسيلازيني 5 مغ/كغ. الانتظار لمدة عشر دقائق وتأكيد أنيسثيتيزيشن السليم معسر الذيل ولمس العين برفق. إذا لم يكن هناك أي رد فعل، euthanize بالإدارة عن طريق الحقن الوريدي بينتوباربيتال والفينيتوئين (انظر الجدول للمواد) 1 مل/4.5 كجم في 2 مل سالين معقم. ملاحظة: هذه تيميبوينتس الأمثل لتغطية الشخصية الحرائك الدوائية وإيثامبوتول وقد تحتاج إلى ضبط/الأمثل لدراسة العقاقير الأخرى.</li>
	<li>استخدام الملقط، مقص أو مشرط، إزالة الرئتين من تجويف الصدر، ويرسخ خزعات الرئة تحتوي على كبيرة حبيبية نخرية جزءا لا يتجزأ من المحيطة بأنسجة الرئة بعيدين (كما تم وصفه سابقا3). تظهر نخرية حبيبية بيج في اللون، وعادة ما تبرز قليلاً من الرئة حمراء/وردي اللون المحيطة بها. لتسهيل كريوسيكتيونينج سهلة، ضمان أن خزعات لم أكبر من 2 × 1.5 × 1.5 سم.</li>
	<li>استخدام الملقط، ضع الخزعة على صينية كريومولد مسمى مسبقاً مع سطح القطع المطلوبة في اتصال مباشر مع القاعدة من علبة الورق. بعد تجميد، سيوفر هذا سطح مستو من التي سيتم خفض كريوسيكشنز.</li>
	<li>تجميد الخزعة في بخار النتروجين السائل. ملء حاوية الستايروفوم بعمق 2 بوصة مع النتروجين السائل ومكان رف أنبوب أسلاك معدنية. وينبغي أن تبرز الرف فوق سطح النتروجين السائل توفير سطح مستو التي توضع في علب الأنسجة. ضع الغطاء مرة أخرى على الحاوية الستايروفوم وترك الأنسجة لمدة 10 دقائق تجمد تماما.</li>
	<li>إزالة الصواني الأنسجة، لف بسرعة في فيلم الألومنيوم ومكان في فرادى المسمى resealable الأكياس البلاستيكية والختم. نقل إلى الثلاجة-80 درجة مئوية للتخزين. ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات 1، 1، 1-6 في ظروف BSL3 (بما في ذلك جميع أعمال الحيوان والتعامل مع المصابين والأنسجة). غاما تشعيع خزعات الرئة في ميجارادس 3 لتمكين معالجة خارج الاحتواء BSL3. قد يتم تنفيذ ميكروديسيكشن التقاط الليزر على أنسجة معقمة داخل BLS3 مرفق إذا تمت الموافقة على بروتوكولات السلامة المعمول بها. ومع ذلك، يصف ما تبقى من هذا البروتوكول التجهيز النهائية في منشأة BSL-2.</li>
</ol>2-الأنسجة تمزيقها
<ol><li>تعيين كريوستات درجة حرارة القطع المطلوبة. نقل خزعة الرئة المشع أشعة غاما من مخزن-80 درجة مئوية إلى كريوستات وتترك لمدة 30 دقيقة حجته درجة حرارة الأنسجة. ملاحظة:-20 إلى-22 درجة مئوية الأمثل للسل الآفة خزعات.</li>
	<li>استخدام الملقط، إصلاح الخزعة لتشاك كريوستات باستخدام كمية صغيرة من قطع الأمثل درجة حرارة مادة لاصقة (OCT) التمسك بالقاعدة الأنسجة لتشاك. توجيه الأنسجة حيث يكون سطح مسطح (التي كانت على اتصال مع قاعدة كريومولد) على سطح مكشوف لعدة قطاعات. ضمان OCT لا تلوث على سطح النسيج، وهذا قد تتداخل مع تحليل الطيف الكتلي اللاحقة.</li>
	<li>قطع ثلاثة أقسام الأنسجة في 25 ميكرون سمك وجبل على الشرائح غشاء الحيوانات الأليفة. بلطف لمس الغشاء إلى قسم الأنسجة وإزالة. إذا تم تطبيق الكثير من الضغط، قد تمزق غشاء رقيق.<ol>
<li>تجنب المناولة المفرطة للشرائح قبل تصاعد كما سيؤدي هذا في غشاء الحيوانات الأليفة تصبح التصاق التهمة والفقراء من أقسام الأنسجة. ضمان أن تظل الشريحة الغشاء في درجة حرارة الغرفة لتمكين الالتصاق تزايد ذوبان الجليد وناجحة للأنسجة للغشاء.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إزالة الشريحة من كريوستات والسماح إلى أيردري لمدة 3 دقائق. إذا لن يتم تنفيذ LCM-LC/MS/MS فورا، ختم الشريحة في حقيبة صغيرة يمكن إغلاقها بشرط محكم ونقلها إلى مخزن-80 درجة مئوية حتى المطلوبة للتشريح.</li>
	<li>قطع قسما المتاخمة لها في 10-12 ميكرومتر وذوبان الجليد-جبل على شريحة زجاج قياسية لتوضع وويوزين (H & E) تلطيخ ومرجع. ويمكن قطع مقاطع إضافية في هذا الوقت للبقع هيستوتشيميستري المرجوة الأخرى (مثل Ziehl-نيلسين لتصور بكتريا السل (MTB)).</li>
</ol>3-ميكروديسيكشن
<ol><li>إزالة حقيبة مختومة تحتوي على الشريحة من مخزن-80 درجة مئوية، والسماح للوصول إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ملاحظة: إذا كانت الشريحة الباردة يتعرض فورا لجو المختبرات، الأنسجة سوف تصبح مغلفة بالتكثيف، وقد تتعرض للخطر سلامة المكانية للمخدرات.</li>
	<li>قم بتشغيل المجهر والليزر (ليزر يتطلب 5-10 دقائق الاحماء قبل البدء في قطع). تحميل أنابيب PCR مل 0.20 قبعة مسطحة في الحامل.</li>
	<li>إزالة الشريحة من الكيس وتأخذ صورة ضوئية لقسم الأنسجة في الحيوانات الأليفة الشريحة باستخدام ماسح ضوئي مسطح.</li>
	<li>ضع الشريحة في حامل الشريحة (الأنسجة الجانبية إلى الأسفل) وتعيين أنابيب جمع منفصل للمناطق ذات الاهتمام باستخدام البرمجيات مجهر الحبيبي محددة. عادة، هذه ستكون 'الرئة بعيدين،' 'الحبيبي الخلوية،' و 'كاسيوم' (مركز نخرية)، ولكن قد تختلف تبعاً لأمراض محددة للورم/الخزعة.</li>
	<li>التركيز على الأنسجة باستخدام 5 × الهدف المجهر. وينبغي أن توفر هذا التكبير نظرة عامة جيدة من الأنسجة التي تحتوي على كلا المجالين الحبيبي الخلوية ونخريه. في البرنامج تحديد أنبوب المعينة 'كاسيوم' لنقله إلى موضع تحت الأنسجة.</li>
	<li>أدخل المعلمات تشريح المطلوب. هي الإعدادات النموذجية لمقطع الرئة سميكة 25 ميكرومتر ليزر السلطة 30 وسرعة 15 الفتحة 35 (وحدات التعسفي). ومع ذلك، هذه سوف تختلف تبعاً لاستخدام مجهر واحتمال انخفاض الطاقة نظراً لسن الليزر.</li>
	<li>قم بتحديد أداة رسم الحرة '--'، واستخدام القلم الماوس أو لمس، مخطط المنطقة المرغوبة للتشريح. سيتم عرض المساحة السطحية للمنطقة في البرنامج. الحفاظ على مناطق مختارة تحت 500,000 ميكرومتر2 (0.5 مم2) لتسهيل تشريح أسهل. كرر التشريح حتى 3 مليون ميكرون2 (3 مم2) وقد جمعت في المجموع في غطاء الأنبوبة.<ol>
<li>في بعض الأحيان، قد تظل عالقة للأغشية المحيطة بها (على سبيل المثال بسبب جاذبية ثابتة) منطقة تشريح ولا تندرج ضمن سقف جمع. قم بإزالة هذه المناطق من مجموع المساحة السطحية تراكمية عن طريق تحديد وإزالة يدوياً داخل البرنامج.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حدد الحد الأقصى ل 'الآفة الخلوية' وجمع 3 مليون ميكرون2 من الأنسجة باستخدام نفس العملية كما هو موضح في الخطوة 3، 7.</li>
	<li>حدد الحد الأقصى ل 'الرئة بعيدين' وجمع 3 مليون ميكرون2 من الأنسجة باستخدام نفس العملية كما هو موضح في الخطوة 3، 7. علما بأن أنسجة الرئة بعيدين يحتوي على العديد من القصيبات والمسافات السنخية. إيلاء اهتمام دقيق لاستبعاد هذه من مناطق محددة بالانسجة للتشريح.</li>
	<li>إزالة غطاء حامل وعناية unclip وختم وتسمية كل أنبوبة. حماية الأنسجة تشريح من المحيطة بالاضطرابات الجوية (مثل اعتبارا من انقطاع تدفق الهواء من فتح باب). تحليل الأنسجة تشريح فورا، أو تخزينها في-80 درجة مئوية وذوبان الجليد قبل تجهيز وتحليل لكمس.</li>
</ol>4-استخراج وتحليل لكمس
<ol><li>إعداد استخراج الحل من 1:1 الاسيتو الانيتريل/الميثانول الذي يتضمن المعايير الداخلية d-10 وإيثامبوتول. عند اختيار معايير داخلية، استخدام نموذج مسمى مستقرة من المخدرات أكثر (مثل التطريز المسمى الديوتريوم المستخدمة في هذه التظاهرة) مع التحول الشامل كافياً لتجنب النظائر المشعة عبر الحديث بين المخدرات أكثر ومعيار (عادة الحد ني دالتونس 4) . ملاحظة: وضع المعايير في هوموجيناتي لكل نوع من أنواع الأنسجة الخاصة بكل منها صعب لأن هناك أنسجة سيطرة محدودة جداً لإنشاء معايير هوموجيناتي معها. كبديل لجعل المعايير من عينة هوموجيناتي ارتفعت، معياراً يمكن إنشاؤها بواسطة إضافة أنسجة فارغة ومجمع الاختبار معا واستخراج. حجم الأنسجة التحكم في هوموجيناتي الذي يتطابق مع حجم المستهدفة أقسام نسيج عينة الدراسة يقترن مباشرة بمبلغ الاختبار المجمع الذي سيكون حاضرا في تركيز معين.</li>
	<li>حساب حجم الأنسجة المستهدفة على أساس المساحة السطحية وسمك قسم الأنسجة وتحديد عامل التخفيف اللازمة هوموجيناتي استخدام وحدة تخزين هوموجيناتي التي سوف تضاف إلى معيار وعينات مراقبة الجودة. الحسابات موضحة أدناه لمنطقة مستهدفة تشريح2 (3 مم2) ميكرومتر 3 مليون مع 25 ميكرون سمك وحجم 2 ميليلتر من هوموجيناتي. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>افتراض كثافة أنسجة 1 غ/مل، إعداد المخزون هوموجيناتي التي تزن 50 مغ أنسجة التحكم وإضافة المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني تمييع (باستخدام عامل إضعاف هوموجيناتي 26.67 المحسوبة في الخطوة 4، 2، مخفف مل 1.283). مجانسة بفوزه على أنسجة الرئة والمخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق عند 1750 دورة في الدقيقة في الخالطون حبة حبة. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>تخفيف تركيز مخزونات المخدرات 1 ملغ/مل في المياه الاسيتو الانيتريل 1:1 لإنشاء المنحنى المعياري النتوءات الحلول. تحديد النتوءات التركيزات القياسية استناداً إلى حجم سبايك وحجم الأنسجة المستهدفة. المثال يتضح نانوغرام/مليلتر 100 قياسية باستخدام وحدة سبايك 10 ميليلتر. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>إزالة الأنابيب التي تحتوي على الأنسجة ميكروديسيكتيد من مخزن-80 درجة مئوية، والسماح للوصول إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>إضافة 10 ميليلتر حل المياه الاسيتو الانيتريل 1:1 و 2 ميليلتر من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني للأنابيب التي تحتوي على الأنسجة ميكروديسيكتيد.</li>
	<li>للمنحنى المعياري وأنابيب مراقبة الجودة، إضافة 10 ميليلتر من التشويك حل 2 ميليلتر لعنصر التحكم هوموجيناتي الرئة.</li>
	<li>إضافة 50 ميليلتر من استخراج الحل لكل أنبوبة.</li>
	<li>دوامة كل أنبوب لمدة 5 دقائق، sonicate لمدة 5 دقائق والطرد المركزي عند 5000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق لتشكيل بيليه الفيلم والأنسجة في كل أنبوبة.</li>
	<li>نقل 50 ميليلتر من المادة طافية على صفيحة 96 بئر عميق وتمييع مع ميليلتر 50 إضافية من المياه في كل بئر.</li>
	<li>إجراء تحليل LC/MS/MS باستخدام معلمات الأداة الأمثل للمعايير الداخلية وإيثامبوتول ووايثامبوتول-d10 (كما تم وصفه سابقا بالتفصيل12).</li>
	<li>استخدم عامل تخفيف لتصحيح المبلغ الدقيق للأنسجة تشريح لكل عينة. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5-أسلوب التحقق من الصحة
<ol><li>إنشاء هوموجيناتي في أنسجة الرئة التحكم عن طريق الجمع بين الرئة الجزء 1 و 2 أجزاء برنامج تلفزيوني الخرز الصلب 3-4. فاز أنسجة الرئة والمخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق عند 1750 دورة في الدقيقة باستخدام الخالطون حبة.</li>
	<li>سبايك في هوموجيناتي بإضافة 10 ميليلتر من 1 ملغ/مل [دمس] وإيثامبوتول الأسهم إلى 990 هوموجيناتي ميليلتر لإنشاء بتركيز نهائي 10000 نانوغرام/مليلتر (10 ملغ/مل) ودوامه لمدة 1 دقيقة.</li>
	<li>إنشاء كتلة هوموجيناتي مجمدة التي تتدفق هوموجيناتي كريومولد والتجميد السريع على الثلج الجاف لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>إعداد 25 ميكرومتر أبواب سميكة من كتلة هوموجيناتي كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.5.</li>
	<li>تشريح منطقة الأنسجة المستهدفة كما هو محدد في الخطوات 3.2-3.10.</li>
	<li>إضافة 1:1 10 ميليلتر الاسيتو الانيتريل المياه و 2 ميليلتر من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني للأنابيب التي تحتوي على الأنسجة ميكروديسيكتيد.</li>
	<li>إضافة 50 ميليلتر من استخراج الحل لكل أنبوبة. اتبع الخطوات 4.9-4.12 لإنشاء منحنى قياسية وتحديد تركيز المخدرات في كتلة هوموجيناتي الأنسجة.</li>
	<li>حساب كفاءة الاستخراج باستخدام الصيغة التالية: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+(DESI)+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection.">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling.">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li><li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections.">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li><li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies.">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li><li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging,+laser+capture+microdissection,+and+LC-MS/MS+of+the+same+tissue+section.">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li><li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics:+methodologies+and+clinical+applications.">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li><li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis.">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+A+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).</li><li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy.">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li><li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis.">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model.">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li><li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response.">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

مطلوب حلها مكانياً الكمي للمخدرات داخل الآفات السل الرئوي لتحديد ما إذا كان التعرض للمخدرات تصل إلى تركيزات تعقيم بكتيرية السكان المقيمين داخل المقصورات الآفة مختلفة. LCM-LC/MS الأسلوب الموصوفة هنا تمكن الكمي المطلق للأدوية المضادة للسل داخل جميع المقصورات الآفة، بما في ذلك كاسيوم الغنية ب?...

القدرة على حل مكانياً وقياس مستويات المخدرات شرط حاسم لتحديد ما إذا كانت الأدوية المضادة للسل التوصل إلى الفئات السكانية الفرعية الجرثومية ضمن الآفات الرئوية في تعقيم تركيزات1. أهمية خاصة هو تحديد انتشار المخدرات في صلب نخرية الآفة (تسمى كاسيوم)، التي عادة ما تحتوي على أكبر عدد من العصيات وقد يكون موجوداً سيئة للمخدرات نظراً لعدم وجود الأوعية الدموية.
الأساليب التقليدية لتقييم انتشار الآفة، التي تنطوي على تجانس الآفات الرئوية قصت متبوعاً بالاستخلاص بالمذيبات وتحليل الطيف الكتلي (LC/MS) اللوني السائل، وهي بالغة الحساسية والانتقائي للمخدرات من الفائدة. ومع ذلك، توفر هذه الأساليب سوء إدارة المعلومات المكانية، تقتصر على حجم النسيج المتجانس الأصلي. النهج التصوير الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي، مثل الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز التأين (استخدام)2،3، الامتزاز اليكتروسبراي التأين (ديسي)4 أو5الاستخراج السطحي المحسن السائل، 6 توفر قدرات التصوير جداً حل مكانياً، ولكن التقدير الكمي المباشر يمكن أن تكون صعبة جداً أو مستحيلاً بسبب تأثيرات قمع أيون غير متجانسة واختلاف كفاءات استخراج أكثر من الخلية مختلف أو أنواع الأنسجة7. بالإضافة إلى ذلك، النهج التصوير الأنسجة MS الأكثر مباشرة أصلاً أقل حساسية من LC/MS بسبب عدم الفصل الكروماتوغرافي للأنواع المحلية المتنافسة للتأين وكفاءة الاستخلاص بالمذيبات أقل من المخدرات من الأنسجة.
طبق بشكل روتيني لعزل وتوصيف مناطق أنسجة متميزة لدراسات البروتين8،9 ليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) جنبا إلى جنب مع تحليل LC/MS واستخدمت مؤخرا لتقدير حجم المخدرات في مداوي 10من الأنسجة الحيوانية. نقدم هنا بروتوكولا أمثل تطبيق LCM جنبا إلى جنب مع تحليل LC/MS (LCM-LC/MS) التحديد الكمي للأدوية المضادة للسل داخل مقصورات الحبيبي متميزة. يتركز في عملية ميكروديسيكشن القبض على الليزر، ليزر الأشعة فوق البنفسجية من خلال الهدف المجهر على قسم الأنسجة، الذي يقطع ويعزل منطقة الأنسجة المطلوبة باتباع مسار المعرفة من قبل المستخدم. لمساعدة الجاذبية LCM (التقنية المستخدمة لهذا البحث)، يتم تحميل المقطع الأنسجة إلى شريحة غشاء بوليمر رقيقة (الحيوانات الأليفة أو القلم) والأنسجة يتم التقاطها في غطاء أنبوب جمع يقع أسفل الشريحة. وتستخرج من الأنسجة قصت المخدرات كمياً باستخدام نهج LC/MS قياسية. ويتحدد مقدار الأنسجة المطلوبة التي سيتم جمعها في نهاية المطاف من تركيز المتوقعة من المخدرات موجودة في الأنسجة وحساسية الطريقة LC/MS. لمعظم التحليلات المتعلقة بالمخدرات مداوي على المستويات العلاجية وتحليلها باستخدام الرباعي ثلاثي روتينية مطياف كتلة، 3 مليون ميكرون2 (3 مم2) من الأنسجة مساحة كافية.
يصف هذا البروتوكول مجموعة قوية من التنميط المكاني والكمي الكامل يقدمها LCM-LC/MS، توفير تركيزات المخدرات المطلقة في جميع مقصورات حبيبية السل. قد أيضا تطبيق هذه التقنية لتحديد المخدرات التركيزات في الأنسجة المريضة مختلفة العديد من توفير معلومات اكتشاف وتطوير العقاقير الحيوية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">New Zealand White rabbits</td>
			<td style="width:159px;">Covance</td>
			<td style="width:155px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">HN878 Mycobacterium tuberculosis</td>
			<td style="width:159px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:155px;">NR-13647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Virbac</td>
			<td style="width:155px;">710101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A955-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A456-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Formic Acid (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Water (LC-MS grade)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">W6212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">0.2 mL flat-cap PCR tubes</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">07-200-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Steel frames, PET-membrane</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">11505151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Premium Frosted Microscope Slides</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#160;96 Deep well plate 2.0ML PP RB&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">NC0363259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Zorbax SB-C8&#160;column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &#956;m)</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;">820631-001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#34;Zipper&#8221; Seal Sample Bags</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">01-816-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Equipment</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CM1850&#160;cryostat</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica CM1860 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Laser Microdissection System 6500</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica LMD 6 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Agilent 1260 Infinity II HPLC&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:159px;">Sciex</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

السل لا يزال سببا رئيسيا للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. إدخال تحسينات على نظم المخدرات القائمة وتطوير علاجات جديدة مطلوبة على وجه الاستعجال. القدرة لأدوية السل محسوبة للوصول إلى وتعقيم البكتيريا المناطق سيئة vascularized نخرية (كاسيوم) للرئة حبيبية أمر حاسم لنجاح التدخل العلاجي. يجب أن تتضمن الأنظمة العلاجية الفعالة لذلك المخدرات مع خصائص اختراق كاسيوم مواتية. أساليب LC/MS الحالية لقياس مستويات المخدرات في الأنسجة البيولوجية حدت من قدرات التحليل المكاني، مما يجعل من الصعب على دقة تحديد تركيزات المخدرات المطلقة داخل مقصورات الأنسجة الصغيرة مثل تلك التي عثر عليها داخل نخرية حبيبية. وهنا يقدم بروتوكول الجمع بين الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) من مناطق أنسجة مرضية متميزة مع التقدير الكمي LC/MS. هذا الأسلوب يوفر الكمي المطلق للمخدرات داخل كاسيوم الحبيبي، المحيطة بالآفة الخلوية وأنسجة الرئة بعيدين، وعليه، يحدد بدقة ما إذا كان يجري تحقيق تركيزات جراثيم. بالإضافة إلى بحوث السل، قد الأسلوب العديد من التطبيقات المحتملة لحل مكانياً الكمي للمخدرات في الأنسجة المريضة.

ويرد في الشكل 1لمحة عامة عن النهج LCM-LC/MS. بعد تعقيم الأنسجة تشعيع جاما، اتخاذ جميع الخطوات اللاحقة (من الأنسجة تمزيقها فصاعدا) خارج ظروف BSL3. ويبين الشكل 2 الآفة المقاطع خزعة قبل وبعد عزل الأنسجة بواسطة LCM. يمكن تحديد مجالات السل آفات نخرية وال...

Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن مقترنة بتحليل LC/MS مكانياً كمياً-توزيع المخدرات داخل حبيبية السل الرئوي. وقد النهج انطباق واسع لقياس تركيزات المخدرات داخل الأنسجة في التفاصيل المكانية العالية.

التقاط الكمي المكانية للمخدرات في الآفات السل الرئوي بالليزر اللوني السائل ميكروديسيكشن الكتلي (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Views.  Rutgers, The State University of New Jersey. هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن مقترنة بتحليل LC/MS مكانياً كمياً-توزيع المخدرات داخل حبيبية السل الرئوي. وقد النهج انطباق واسع لقياس تركيزات المخدرات داخل الأنسجة في التفاصيل المكانية العالية.

Video: Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Magnetic Resonance Imaging Quantification of Pulmonary Perfusion using Calibrated Arterial Spin Labeling

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, fraction (FIO2) = 0.21) hypoxia (FIO2 = 0.125), and hyperoxia 
(FIO2 = 1.00). In addition, the physiological responses of the subject are monitored in the MR scan environment. MR images 
were obtained on a 1.5 T GE MRI scanner during a breath hold from a sagittal slice in the right lung at functional residual capacity. An arterial 
spin labeling sequence (ASL-FAIRER) was used to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow 1,2 and a multi-echo fast 
gradient echo (mGRE) sequence 3 was used to quantify the regional proton (i.e. H2O) density, allowing the quantification 
of density-normalized perfusion for each voxel (milliliters blood per minute per gram lung tissue). 
With a pneumatic switching valve and facemask equipped with a 2-way non-rebreathing valve, different oxygen concentrations 
were introduced to the subject in the MR scanner through the inspired gas tubing. A metabolic cart collected expiratory gas via expiratory tubing. Mixed expiratory O2 and CO2 concentrations, oxygen consumption, carbon dioxide production, respiratory exchange ratio, 
respiratory frequency and tidal volume were measured. Heart rate and oxygen saturation were monitored using pulse-oximetry. 
Data obtained from a normal subject showed that, as expected, heart rate was higher in hypoxia (60 bpm) than during normoxia (51) or hyperoxia (50) and the arterial oxygen saturation (SpO2) was reduced during hypoxia to 86%. Mean ventilation was 8.31 L/min BTPS during hypoxia, 7.04 L/min during normoxia, and 6.64 L/min during hyperoxia. Tidal volume was 0.76 L during hypoxia, 0.69 L during normoxia, and 0.67 L during hyperoxia. 
Representative quantified ASL data showed that the mean density normalized perfusion was 8.86 ml/min/g during hypoxia, 8.26 ml/min/g during normoxia and 8.46 ml/min/g during hyperoxia, respectively. In this subject, the relative dispersion4, an index of global heterogeneity, was increased in hypoxia (1.07 during hypoxia, 0.85 during normoxia, and 0.87 during hyperoxia) while the fractal dimension (Ds), another index of heterogeneity reflecting vascular branching structure, was unchanged (1.24 during hypoxia, 1.26 during normoxia, and 1.26 during hyperoxia). 
Overview. This protocol will demonstrate the acquisition of data to measure the distribution of pulmonary perfusion noninvasively under conditions of normoxia, hypoxia, and hyperoxia using a magnetic resonance imaging technique known as arterial spin labeling (ASL). 
Rationale: Measurement of pulmonary blood flow and lung proton density using MR technique offers high spatial resolution images which can be quantified and the ability to perform repeated measurements under several different physiological conditions. In human studies, PET, SPECT, and CT are commonly used as the alternative techniques. However, these techniques involve exposure to ionizing radiation, and thus are not suitable for repeated measurements in human subjects.

A MR imaging method to study the distribution of pulmonary blood flow under a variety of physiological conditions, in this case exposure to three different inspired oxygen concentrations: hypoxia, normoxia, and hyperoxia, is described. This technique utilizes human pulmonary physiology research techniques in an MR scanning environment.

التصوير بالرنين المغناطيسي الكمي من الإرواء الرئوي باستخدام معايرة وصفها سبين الشرياني

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, ...

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

MALDI الطيف الكتلي التصوير من نيوروببتيد في مرض باركنسون

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

تحسين بروتوكول للتسليخ مجهري ليزر من الجزر البنكرياسية الإنسان من عينات جراحية

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

الكمي قداس الطيفية من التنميط Proteomes خلايا السرطان المستمدة من السائل والأورام الصلبة

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

الليزر التقاط تسليخ مجهري من الإنسان البروستات الظهارة لتحليل الحمض النووي الريبي

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a specific anatomical region. Within the brain, metals have a highly compartmentalized distribution, depending on the primary function they play within the central nervous system. Imaging the spatial distribution of metals has provided unique insight into the biochemical architecture of the brain, allowing direct correlation between neuroanatomical regions and their known function with regard to metal-dependent processes. In addition, several age-related neurological disorders feature disrupted metal homeostasis, which is often confined to small regions of the brain that are otherwise difficult to analyze. Here, we describe a comprehensive method for quantitatively imaging metals in the mouse brain, using laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) and specially designed image processing software. Focusing on iron, copper and zinc, which are three of the most abundant and disease-relevant metals within the brain, we describe the essential steps in sample preparation, analysis, quantitative measurements and image processing to produce maps of metal distribution within the low micrometer resolution range. This technique, applicable to any cut tissue section, is capable of demonstrating the highly variable distribution of metals within an organ or system, and can be used to identify changes in metal homeostasis and absolute levels within fine anatomical structures.

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Quantitatively mapping metals in tissue by laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) is a sensitive analytical technique that can provide new insight into how metals participate in normal function and disease processes. Here, we describe a protocol for quantitatively imaging metals in thin sections of mouse neurological tissue.

المعادن التصوير في أنسجة المخ عن طريق الاستئصال بالليزر - إلى جانب بالحث البلازما - الطيف الكتلي (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

أسلوب في فيفو لتقييم حاجز القناة الهضمية-الدم والايض الكبد من منتجات الحجمية

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease susceptibility, drug target discovery, and precision medicine. Alternative IgG N-glycans have been reported in several common chronic diseases and suggested to have great potential in clinical applications (i.e., biomarkers for diagnosis and prediction of diseases). IgG N-glycans are widely characterized using the method of hydrophilic interaction chromatography (HILIC) ultra-performance liquid chromatography (UPLC). UPLC is a stable detection technology with good reproducibility and high relative quantitative accuracy. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated, and glycan composition and relative abundance in plasma are characterized.

Immunoglobulin G (IgG) N-glycan is characterized using hydrophilic interaction chromatography UPLC. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated. Presented here is an introduction to this experimental method so that it can be widely used in research settings.

تحليل الغلوبولين المناعي G-Glycan بواسطة اللوني السائل فائق الأداء

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is enhanced after processing with vinegar, CR processed with vinegar (CRV) is generally used clinically. However, the mechanism by which the analgesic effect is enhanced by vinegar processing is unclear. In this study, the ultra-high pressure liquid chromatographytandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) technique was used to examine changes in the blood levels of the exogenous constituents and metabolites between CR-treated and CRV-treated rats with dysmenorrhea. The results revealed differing levels of 15 constituents and two metabolites in the blood of these rats. Among them, the levels of (-)-myrtenol and [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acetic acid in the CRV group were considerably higher than in the CR group. CRV reduced the level of 2-series prostanoids and 4-series leukotrienes with proinflammatory, platelet aggregation, and vasoconstriction activities and provided analgesic effects by modulating arachidonic acid and linoleic acid metabolism and the biosynthesis of unsaturated fatty acids. This study revealed that vinegar processing enhances the analgesic effect of CR and contributes to our understanding of the mechanism of action of CRV.

Here, a comparative analysis of raw and processed Cyperi rhizoma (CR) samples is presented using ultra-high performance liquid chromatography-high-resolution tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) in rats with primary dysmenorrhea. The changes in blood levels of the metabolites and the sample constituents were examined between rats treated with CR and CR processed with vinegar (CRV).

تحليل عينات جذمور Cyperi الخام والمعالجة باستخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة في الفئران المصابة بعسر الطمث الأولي

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is ...

التقاط عينات أنسجة التليف تحت المخاطي عن طريق الفم لتحليل المكاني - أوميكس

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

تسليط الضوء على المؤلف: فتح أسرار الأورام الخبيثة المحتملة عن طريق الفم 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

عزل الخلايا بالمعلومات المورفولوجية والمكانية من عينات التليف تحت المخاطي للفم عن طريق التشريح المجهري لالتقاط الليزر

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...