Name: spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)
Uploaded: 2018-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

우리 폴 오 브라이언, 감사 미 나 Marizel와 동물 실험에 대 한 이자벨 프리먼, Jacquie 곤잘레스 NIH/NIAID에서 다니엘 이너 원고에 대 한 레이저 캡처 기정 Jansy Sarathy 이전 토끼 조직의 감마 방사선에 대 한 생각과 조언입니다. 이 작품은 법안에서 자금에 의해 지원 되었다 고 멜 린다 게이츠 재단 (OPP1174780)와 공유 하는 NIH 계측 1S10OD018072를 부여 합니다. 우리 감사 Eliseo A. Eugenin Leica LMD 6500 현미경에 대 한 액세스를 제공 하 고 전문 지식 및 조언을 공유. 구입, 그리고 지속적인 지원, LMD 6500는 국립 정신 건강 연구소 그랜트, MH096625, 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기, NS105584, PHRI (E.A.E)에 자금와 GSK 기여 (E.A.E)에 의해 투자 되었다.

모든 동물 연구 관리 및 승인 기관 동물 관리에서 국립 보건원의 실험 동물의 사용 및 사용 위원회의 NIAID (NIH), 베 데스 다, 메릴랜드에 대 한 가이드에 따라 수행 했다
1. 동물 실험 및 조직 컬렉션
이 섹션은 프로토콜의 동물 절차 및 Biosafety 수준 3 (BSL3) 조건 하에서 샘플 컬렉션을 설명합니다. 토끼에서 프로토콜 되었습니다 결핵균 에 어로 졸 감염 절차 및 약물 관리의 상세한 프로토콜 기술 이전11,12.
<ol><li>뉴질랜드 백색 토끼 (남녀 4-5 개월에) M. 결핵 HN878 감염 앞11에서 설명한 코 전용에 어로 졸 시스템을 사용 하 여.</li>
	<li>기본 루트를 통해 선택한 마약 (여기에 제시 된 예에서 Ethambutol)를 관리 하 고 2, 6, 및 24 시간 관리 다음에 동물을 안락사. 첫째, 5 mg/kg에서 35 mg/kg 및 Xylazine에서 케 타 민의 근육 주사로 토끼를 anesthetize. 10 분 기다립니다 고 적절 한 anesthetization 꼬리를 꼬 집 고 부드럽게 눈을 감동 합니다. 아무 반응 인 경우에 1 mL/4.5 k g 2 mL의 멸 균 식 염 수에 pentobarbital 및 phenytoin ( 재료의 표참조)의 정 맥 행정에 의해 안락사. 참고: 이러한 timepoints 최적의 Ethambutol pharmacokinetic 프로 파일 커버 하 고 다른 연구 약물에 대 한 조정/최적화 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>가슴 구멍에서 폐를 제거, resect uninvolved 폐 조직 (앞에서 설명한3) 주변에 포함 된 큰 괴 사 성 육아 종을 포함 하는 폐 생 검 겸 자가 위, 또는 메스 사용. 괴 사 성 육아 종을 표시에 베이 지 컬러와 일반적으로 약간 주변 레드/핑크 색 폐에서 내 다. 쉽게 cryosectioning 촉진 하 biopsies 2 x 1.5 x 1.5 c m 보다 큰 인지 확인 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 용지함의 기지와 직접 접촉에서 사전 분류 cryomold 트레이 원하는 절단 표면에 생을 놓습니다. 동결, 후이 평평한 표면에서 cryosections 삭감 될 것 이다 제공할 것입니다.</li>
	<li>액체 질소 증기에 생을 고정 합니다. 액체 질소와 2 인치는 깊이를 스티로폼 컨테이너와 금속 와이어 튜브 랙 배치. 랙 평평한 표면 조직 트레이 배치 됩니다 제공 하는 액체 질소의 표면 위에 내 다 한다. 스티로폼 용기에 다시 뚜껑을 배치 하 고 10 분 완전히 동결에 대 한 조직을 두십시오.</li>
	<li>조직 트레이 제거, 신속 하 게 알루미늄 필름에 포장 및 개별적으로 레이블이 resealable 비닐 봉투 및 도장 장소. -80 ° C 냉동 고 스토리지에 대 한 전송. 참고: 단계 1.1-1.6 BSL3 조건 (모든 동물 작품을 포함 한 감염된 장기 및 조직의 처리)에서 수행 됩니다. 감마 비추는 BSL3 제약 이외의 처리를 3 Megarads에서 폐 생 검. 레이저 캡처 기정 unsterilized 조직에 시설 안전 프로토콜 승인 하는 경우에 BLS3 내에서 수행할 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜의 나머지 다운스트림 처리를 BSL-2 시설에 설명합니다.</li>
</ol>2. 조직 단면
<ol><li>원하는 절삭 온도 cryostat를 설정 합니다. cryostat에 감마 방사선 폐 생 검-80 ° C 저장에서 전송 하 고 equilibrate 조직 온도를 30 분 동안 둡니다. 참고:-22 ° C-20은 결핵 병 변 biopsies에 적합 합니다.</li>
	<li>핀셋을 사용 하는 척을 조직의 기본 준수를 최적의 절삭 온도 접착제 (OCT)의 작은 금액을 사용 하 여 cryostat 척을 생 수정. 평평한 표면 (그는 cryomold의 접촉)는 절단을 위한 노출된 표면 조직을 방향을 정하십시오. 이 후속 질량 분석 분석을 방해할 수 있습니다 대로 OCT 조직 표면 오염 하지 않습니다 확인 합니다.</li>
	<li>25 µ m 두께에 3 개의 직물 단면도 잘라내어 애완 동물 멤브레인 슬라이드에 탑재. 부드럽게 조직 섹션을 막 터치 하 고 제거 합니다. 너무 많은 압력을 적용 하는 경우 얇은 막 찢 어 수 있습니다.<ol>
<li>장착이 되 고 조직 단면도의 청구와 가난한 접착 애완 동물 멤브레인에 발생 이전 슬라이드의 과도 한 처리를 하지 마십시오. 막 슬라이드 thaw 장착 및 성공적인 접착 막에 조직의 활성화를 위해 상 온에서 보관 됩니다 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>cryostat에서 슬라이드를 제거 하 고 3 분 동안 건조를 허용 합니다. LCM-LC/MS/MS 즉시 수행 되지 것입니다, 경우는 작은 밀폐 밀폐 가능한 봉투에 전송-80 ° C 저장까지 해 부에 필요한 슬라이드 봉인.</li>
	<li>10-12 µ m와 thaw-마운트 되며 고 오신 (H & E) 얼룩 및 참조에 대 한 표준 유리 슬라이드에 인접 한 부분을 잘라. 추가 섹션 (결핵균 (MTB)를 시각화에 대 한 Ziehl-Niellsen) 같은 다른 원하는 histochemistry 얼룩에 대 한이 시간에서 잘릴 수 있다.</li>
</ol>3입니다. 서
<ol><li>-80 ° C 저장에서 슬라이드를 포함 하는 봉인된 봉투를 제거 하 고 5 분 동안 실내 온도 도달할 수 있도록. 참고: 차가운 슬라이드 즉시 실험실 분위기에 노출은, 조직을 응축, 코팅 될 것입니다 그리고 약물의 공간 무결성이 손상 될 수 있습니다.</li>
	<li>현미경 및 레이저 (레이저 필요 합니다 5-10 분 워밍업 절단 수 시작 하기 전에). 플랫 캡 0.20 mL PCR 튜브 홀더 로드.</li>
	<li>가방에서 슬라이드를 제거 하 고 평판 스캐너를 사용 하 여 애완 동물 슬라이드에 조직 단면도의 광학 이미지.</li>
	<li>슬라이드 슬라이드 홀더 (조직 면이 아래로)에 놓고 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 관심사의 특정 육아 지역에 별도 컬렉션 튜브를 할당 합니다. 일반적으로, 이러한 'uninvolved 폐,' '세포 육아 종,' 되며 'caseum' (괴 사 성 센터), 하지만 수 있습니다 육아/생의 특정 병에 따라 다릅니다.</li>
	<li>현미경 목표 X 5를 사용 하 여 조직에 초점. 이 확대는 두 세포 괴 사 성 육아 분야를 포함 하는 조직에 대 한 좋은 개요를 제공 해야 합니다. 소프트웨어에서 조직 아래 위치로 이동 하려면 'caseum'를 지정 하는 튜브를 선택 합니다.</li>
	<li>해 부에 원하는 매개 변수를 입력 합니다. 25 µ m 두께 폐 섹션에 대 한 일반적인 설정은 레이저 전원 30, 15, 속도 및 조리개 35 (임의의 단위) 합니다. 그러나, 이러한 사용 하는 현미경 및 레이저의 나이 인해 전력 감소 잠재력에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>' 자유 그리기 ' 도구를 선택 하 고, 마우스 또는 터치 스크린 펜을 사용 하 여, 원하는 지역의 해 부에 대 한 개요. 지역의 표면 영역에에서 표시 됩니다. 500000 µ m2 (0.5 m m2) 쉽게 해 부를 촉진 하기 위해 선택된 영역을 유지. 해 부를 반복 하 여 튜브 모자에 총에서 3 백만 µ m2 (3 m m2)가 수집.<ol>
<li>경우에, 해 부 지역 (예를 들면 때문에 정적 매력) 주변 막에 붙어 남아 고 컬렉션 모자에 빠지지 수 있습니다. 선택 하 고 소프트웨어 내에서 수동으로 제거 하 여 총 누적 노출 영역에서이 영역을 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>'세포 병 변'에 대 한 모자를 선택 하 고 3 백만 µ m2 단계 3.7에서에서 설명한 동일한 프로세스를 사용 하 여 조직의 수집.</li>
	<li>'Uninvolved 폐'에 대 한 모자를 선택 하 고 3 백만 µ m2 단계 3.7에서에서 설명한 동일한 프로세스를 사용 하 여 조직의 수집. 참고 uninvolved 폐 조직 bronchioles 및 치조 공간 포함. 주의 주의를 해 부에 대 한 정의 된 조직 영역에서 제외.</li>
	<li>캡 홀더를 제거 하 고 신중 하 게 unclip, 인감 및 레이블 각 튜브. 항공 장애 등 공기 흐름 장애는 오프닝에서에서부터 주변에서 해 부 조직을 보호 합니다. 즉시, 해 부 조직 분석 또는-80 ° C에서 저장 하 고 처리 및 LCMS 분석 하기 전에 해 동.</li>
</ol>4. 추출 및 LCMS 분석
<ol><li>1:1 이기/메탄올 Ethambutol d-10 내부 표준 포함의 추출 솔루션을 준비 합니다. 내부 표준, 사용 분석 약물의 안정적인 분류 형태 (중수소 라는 EMB이이 데모에서 사용)와 같은 동위 원소를 피하기 위해 충분 한 질량 변화와 크로스를 선택할 때 실정이 약물 및 표준 (일반적으로 최소 4 daltons) 사이 이야기 . 참고: homogenate 표준을 만들고 하는 매우 제한 된 제어 조직 때문에 어렵습니다 각 각각 조직 유형의 homogenate에서 표준 만들기. 아군된 homogenate 샘플에서 표준 만들기 하는 대신 표준 빈 조직과 함께 하 고 추출 화합물을 테스트를 추가 하 여 만들 수 있습니다. 연구 샘플 조직 단면도의 대상 볼륨을 일치 하는 homogenate에서 제어 조직의 볼륨 주어진된 농도에 있을 것 이라고 테스트 화합물의 금액와 직접 결합 된다.</li>
	<li>노출 영역 및 조직 단면도의 두께에 따라 대상된 조직 볼륨을 계산 하 고 표준 및 QC 샘플에 추가 되는 homogenate의 볼륨을 사용 하 여 homogenate에 대 한 필요한 희석 비율을 결정. 계산 25 µ m 두께와 homogenate의 2 µ L 볼륨 3 백만 µ m2 (3 m m2) 해 부 대상 지역에 대 한 아래 설명 됩니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>제어 조직의 50 밀리 그램 무게 희석 PBS 버퍼를 추가 하 여 homogenate 재고를 준비 하는 조직 밀도 1g/mL의 가정 (26.67 homogenate 희석 요소를 사용 하 여 단계에서 계산한 4.2, 희석제는 1.283 mL). 구슬 구슬 균질 화기에 1750 rpm에서 5 분간 폐 조직 및 PBS 버퍼 구타에 의해 균질. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>1:1 이기/물 솔루션 급상승 표준 곡선을 만드는 데에 1 mg/mL 마약 주식 농도 희석. 급상승 스파이크 볼륨 및 대상 조직 볼륨에 따라 표준 농도 결정 합니다. 그림된 예제를 100 ng/mL 10 µ L 스파이크 볼륨을 사용 하 여 표준입니다. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>Microdissected 조직-80 ° C 저장에서 포함 된 튜브를 제거 하 고 5 분 동안 실내 온도 도달할 수 있도록.</li>
	<li>Microdissected 조직을 포함 하는 튜브를 1:1 이기/물 솔루션의 10 µ L 및 PBS 버퍼의 2 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>표준 곡선 및 품질 관리 관, 대 한 솔루션 제어 폐 homogenate의 2 µ L 요동의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>각 튜브를 추출 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>소용돌이, 5 분 동안 각 관 5 분 동안 sonicate 고 영화와 조직의 각 튜브에 펠 릿을 형성 하기 위하여 5 분 동안 5000 RPM에서 원심.</li>
	<li>96-잘 깊은 잘 격판덮개에 상쾌한의 50 µ L를 전송 및 각 잘에서 이온된 수의 추가 50 µ L로 희석.</li>
	<li>Ethambutol Ethambutol-d10 내부 표준 (앞에서 설명한 세부12)에 대 한 최적화 된 악기 매개 변수를 사용 하 여 LC/MS/MS 분석을 수행 합니다.</li>
	<li>희석 비율을 사용 하 여 조직의 각 샘플에 대 한 해 부 정확한 금액에 대 한 수정. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. 방법 유효성 검사
<ol><li>1 부 폐, 2 부분 PBS, 3-4 강철 구슬을 결합 하 여 제어 폐 조직에는 homogenate을 만듭니다. 비드 균질 화기를 사용 하 여 1750 rpm에서 5 분간 폐 조직 및 PBS 버퍼를 이길.</li>
	<li>990 µ L homogenate를 만드는 1 분 10000 ng/mL (10mg/mL)와 소용돌이의 최종 농도에 1mg/mL Ethambutol DMSO 재고의 10 µ L을 추가 하 여는 homogenate 스파이크.</li>
	<li>cryomold에는 homogenate을 붓는 고 빠르게 5 분에 대 한 드라이 아이스에 냉동 하 여 냉동된 homogenate 블록을 만듭니다.</li>
	<li>2.1-2.5 단계에 설명 된 대로 homogenate 블록에서 25 µ m 두꺼운 섹션을 준비 합니다.</li>
	<li>3.2-3.10 단계에 지정 된 대상 조직 영역 해 부.</li>
	<li>Microdissected 조직을 포함 하는 관에 10 µ L 1:1 이기/물과 PBS 버퍼의 2 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>각 튜브를 추출 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다. 단계 4.9-4.12 표준 곡선을 만들고 조직 homogenate 블록에 약물 농도 결정 합니다.</li>
	<li>아래 수식을 사용 하 여 추출 효율을 계산: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+(DESI)+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection.">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling.">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li><li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections.">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li><li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies.">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li><li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging,+laser+capture+microdissection,+and+LC-MS/MS+of+the+same+tissue+section.">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li><li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics:+methodologies+and+clinical+applications.">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li><li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis.">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+A+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).</li><li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy.">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li><li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis.">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model.">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li><li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response.">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li></ol>

저자는 공개 없다.

공간 해결 정량화 폐 결핵 병 변 내 약물의 약물 노출에 다른 병 변 구획 내에서 거주 하는 세균성 인구에 살 균 농도 도달 여부를 확인 하기 위해 필요 합니다. 여기에 설명 된 LCM-LC/MS 메서드는 총에서만 1-3 조직 단면도 사용 하 여 박테리아-부유한 caseum를 포함 하 여 모든 병 변 구획 내에서 안티-결핵 약물의 절대 정량화를 수 있습니다. 전통적인 조직 균질 및 LC/MS 방법 조직에 마약 정량화 종종 ?...

공간을 해결 하 고 마약 수준 계량 능력 결핵 약물 농도1살 균에서 폐 병 변 내의 박테리아 모집단에 도달 여부를 결정 하기 위한 중요 한 요구 사항입니다. 특별 한 중요성의 일반적으로 이십시오의 가장 높은 수를 포함 하 고 마약 vascularization의 부재 때문에 액세스할 수 있습니다 (caseum 라고) 하는 병 변의 괴 핵심으로 약물 침투를 결정 이다.
삭제 폐 병 변의 균질 화를 포함 하는 병 변 침투를 평가 하기 위해 전통적인 방법 뒤에 용 매 추출 및 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LC/MS) 분석, 매우 민감하고의 마약에 대 한 선택적 관심입니다. 그러나,이 메서드는 원래 무 균된 조직의 크기를 제한 하는 불 쌍 한 공간 정보를 제공 합니다. 질량 분석 기반 이미징 등 방법을 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 (MALDI)2,3, desorption 분무 이온화 (DESI)4 또는 표면 추출 액체 강화 된5, 6 높은 공간 해결 이미징 기능을 제공 하지만 직접 정량화는 매우 도전적인 또는 이기종 이온 억제 효과 및 다양 한 셀에서 분석의 다른 추출 효율 불가능 한 수 또는 조직의 종류7. 또한, 가장 직접적인 조직 MS 이미징 접근은 본질적으로 생 종 이온화와 조직에서 약물의 낮은 용 매 추출 효율에 대 한 경쟁의 컬럼에 분리의 부족 때문에 LC/MS 보다 덜 민감한.
레이저 캡처 기정 (LCM) LC/MS 분석을 함께 정기적으로 격리 및 proteomic 연구8,9 에 대 한 뚜렷한 조직 지역 특성화에 적용 되었으며 최근 약물 정량화에 대 한 활용에 복용 동물 조직10. 여기 선물이 적용 LCM (LCM-LC/MS) LC/MS 분석을 결합해 독특한 육아 구획 내에서 안티-결핵 약물을 계량 하는 최적화 된 프로토콜. 레이저 캡처 서 과정에서 UV 레이저는 현미경 목표는 사용자에 의해 정의 된 경로 따라 원하는 조직 영역을 분리 하 고 조직 섹션에를 통해 집중 된다. 중력 지원 lcm (이 연구에 사용 하는 기법), 조직 섹션 얇은 고분자 막 슬라이드 (PET 또는 펜)에 탑재 되 고 조직 슬라이드 아래 sited 컬렉션 튜브 캡에 캡처됩니다. 마약 삭제 조직에서 추출 되 고 표준 LC/MS 접근을 사용 하 여 계량. 수집 하는 데 필요한 조직의 양은 궁극적으로 조직에 존재 하는 약물의 예상된 농도 및 LC/MS 방법의 감도에서 결정 됩니다. 대부분의 약물 치료 수준에서 약을 복용 하 고 조직의 일상적인 트리플 4 극 자 질량 분석기, 3 백만 µ m2 (3 m m2)를 사용 하 여 분석의 분석에 대 한 표면적은 충분 합니다.
이 프로토콜 공간 프로 파일링의 강력한 조합을 설명 하 고 전체 정량화 LCM-LC/MS, 결핵 육아의 모든 구획 내에서 절대 약물 농도 제공 제공. 기술은 또한 중요 한 약물 발견과 개발 정보를 제공 하 많은 다른 병에 걸리는 조직에 약물 농도 결정에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White rabbits</td><td>Covance</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS grade)</td><td>Fisher</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL flat-cap PCR tubes</td><td>Corning</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>Steel frames, PET-membrane</td><td>Leica</td><td>11505151</td><td></td></tr><tr><td>Premium Frosted Microscope Slides</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96 Deep well plate 2.0ML PP RB</td><td>Fisher</td><td>NC0363259</td><td></td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &amp;mu;m)</td><td>Agilent</td><td>820631-001D</td><td></td></tr><tr><td>&quot;Zipper&amp;rdquo; Seal Sample Bags</td><td>Fisher</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 cryostat</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica CM1860 is the current model</td></tr><tr><td>Laser Microdissection System 6500</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica LMD 6 is the current model</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

결핵은 여전히 병 적 상태와 사망률 전세계의 주요 원인. 기존 약물 regimens 개선 및 새로운 치료제의 개발 시급히 필요 됩니다. 도달 하 고 저조한 나가도록 괴 지역 (caseum) 폐 육아의 박테리아 살 균 약 복용된 결핵 약의 능력은 성공적인 치료 적 개입에 대 한 중요 합니다. 효과적인 치료 regimens 따라서 유리한 caseum 침투 특성을 가진 약물을 포함 해야 합니다. 생물 조직에 마약 수준 측정을 위한 현재 LC/MS 방법 제한 된 해상도 기능, 그 안에 발견 같은 작은 조직 구획 내에서 절대 약물 농도 정확 하 게 결정 하 고 어려운 괴 사 성 육아입니다. 여기 우리는 LC/MS 정량화와 병 적 별개 조직 영역의 레이저 캡처 기정 (LCM)를 결합 하는 프로토콜을 제시. 이 기술은 육아 caseum, 세포 병 변 및 uninvolved 폐 조직 내 약물의 절대 정량화 하며, 따라서, 정확 하 게 살 균 농도 달성 되 고 있는지 여부를 결정 합니다. 결핵 연구, 뿐만 아니라 기술 병 조직에 약물의 공간 해결 정량화에 대 한 많은 잠재적인 응용 프로그램을 하고있다.

LCM-LC/MS 접근에 대 한 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 감마-방사선에 의해 조직 살 균, 후 (조직 단면 이후)에서 모든 후속 단계 BSL3 조건 이상으로 일어난다. 그림 2 조직 격리 LCM 전후 생 섹션 병 변이 보여준다. 결핵 병 변 괴과 세포 분야를 쉽게 식별 하 고 광학 이미지 (인접 조직 조직학 얼룩이 섹션을 참조 하십시오 요구) 없이 ?...

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Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

여기, 우리는 공간 계량 폐 결핵 육아 내 마약 배포판에 레이저 캡처 서 LC/MS 분석과 함께 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 광범위 한 적응성 높은 공간 세부 사항에서 조직 내의 약물 농도 측정 하는 있다.

레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

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Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

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9.0K 조회수.  Rutgers, The State University of New Jersey. 여기, 우리는 공간 계량 폐 결핵 육아 내 마약 배포판에 레이저 캡처 서 LC/MS 분석과 함께 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 광범위 한 적응성 높은 공간 세부 사항에서 조직 내의 약물 농도 측정 하는 있다.

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Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle's Mapping and Quantification in Organ Tissue

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) performed on thin sections of rodent tissues: kidneys and tumor, allows the detection of inorganic elements such as (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, and Fe, naturally present in the body and (ii) Si and Gd, detected after the injection of gadolinium-based nanoparticles. The animals were euthanized 1&#160;to 24 hr&#160;after intravenous injection of particles. A two-dimensional scan of the sample, performed using a motorized micrometric 3D-stage, allowed the infrared laser beam exploring the surface with a lateral resolution less than 100 &#956;m. Quantitative chemical images of Gd element inside the organ were obtained with sub-mM sensitivity. LIBS offers a simple and robust method to study the distribution of inorganic materials without any specific labeling. Moreover, the compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of the same biological tissue with different types of response:&#160;elemental, molecular, or cellular.

Laser-induced breakdown spectroscopy performed on thin organ and tumor tissue successfully detected natural elements and artificially injected gadolinium (Gd), issued from Gd-based nanoparticles. Images of chemical elements reached a resolution of 100 &#956;m and quantitative sub-mM sensitivity. The compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of a same biological tissue.

레이저 유도 내역 분광학 : 장기 조직에 나노 입자의 매핑 및 정량을위한 새로운 접근

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) ...

연구

공학

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

단일 세포 약물 섭취, 신진 대사 및 효과를 연구하기 위한 통합 라만 분광법 및 질량 분광법 플랫폼

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

생화학

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

복구하는 새로운 미세 절제 접근<em&gt; 결핵균</em폐 육아종 임베디드 포르말린 고정 파라핀에서&gt; 특정 성적 증명서

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

면역학 및 감염병학

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

액체 및 고체 종양 유래의 암세포 프로테옴 정량적 질량 분석 프로파일

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

의학

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

LAESI 질량 분석법에 의해 생물 학적 조직 및 Biofilms의 대기 압력 분자 이미징

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

생물학

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

18FDG PET/CT 영상 공부 결핵균 감염 및 비 인간 영장류에서 치료 도구로 서의 분석

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

결핵 분자 세균 부하 분석 (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well as other phenotypic characteristics. However, they all have in common the most relevant character of mycobacteria: its unique and highly hydrophobic cell wall. Mycobacteria species contain a membrane-covalent linked complex that includes arabinogalactan, peptidoglycan, and long-chains of mycolic acids with types that differ between mycobacteria species. Additionally, mycobacteria can also produce lipids that are located, non-covalently linked, on their cell surfaces, such as phthiocerol dimycocerosates (PDIM), phenolic glycolipids (PGL), glycopeptidolipids (GPL), acyltrehaloses (AT), or phosphatidil-inositol mannosides (PIM), among others. Some of them are considered virulence factors in pathogenic mycobacteria, or critical antigenic lipids in host-mycobacteria interaction. For these reasons, there is a significant interest in the study of mycobacterial lipids due to their application in several fields, from understanding their role in the pathogenicity of mycobacteria infections, to a possible implication as immunomodulatory agents for the treatment of infectious diseases and other pathologies such as cancer. Here, a simple approach to extract and analyze the total lipid content and the mycolic acid composition of mycobacteria cells grown in a solid medium using mixtures of organic solvents is presented. Once the lipid extracts are obtained, thin-layer chromatography (TLC) is performed to monitor the extracted compounds. The example experiment is performed with four different mycobacteria: the environmental fast-growing Mycolicibacterium brumae and Mycolicibacterium fortuitum, the attenuated slow-growing Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), and the opportunistic pathogen fast-growing Mycobacterium abscessus, demonstrating that methods shown in the present protocol can be used to a wide range of mycobacteria.

A protocol is presented to extract the total lipid content of the cell wall of a wide range of mycobacteria. Moreover, extraction and analytical protocols of the different types of mycolic acids are shown. A thin-layer chromatographic protocol to monitor these mycobacterial compounds is also provided.

얇은 층 크로마토그래피에 의한 진균의 지질 조성 분석

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. Human-infective trypanosomatid parasites include Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease; Trypanosoma brucei, the&#160;causative agent of sleeping sickness; and Leishmania species, causative agents of leishmaniasis. Jointly, they affect 20 million people across the globe. These parasites show specific tropism: heart, esophagus, colon for T. cruzi, adipose tissue, pancreas, skin, circulatory system and central nervous system for T. brucei, skin for dermotropic Leishmania strains, and liver, spleen, and bone marrow for viscerotropic Leishmania strains. A spatial perspective is therefore essential to understand trypanosomatid disease pathogenesis. Chemical cartography generates 3D visualizations of small molecule abundance generated via liquid chromatography-mass spectrometry, in comparison to microbiological and immunological parameters. This protocol demonstrates how chemical cartography can be applied to study pathogenic processes during trypanosomatid infection, beginning from systematic tissue sampling and metabolite extraction, followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, and concluding with the generation of 3D maps of metabolite distribution. This method can be used for multiple research questions, such as nutrient requirements for tissue colonization by T. cruzi, T. brucei, or Leishmania, immunometabolism at sites of infection, and the relationship between local tissue metabolic perturbation and clinical disease symptoms, leading to comprehensive insight into trypanosomatid disease pathogenesis.

This protocol describes the steps to generate a 3D model of metabolite distribution during trypanosomatid infection, including sample collection, metabolite extraction, an overview of liquid chromatography-tandem mass spectrometry data acquisition, 3D model generation, and finally, data visualization.

화학 지도 제작 은 Trypanosomatid 감염을 연구 하는 접근

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)

요약

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레이저 유도 내역 분광학 : 장기 조직에 나노 입자의 매핑 및 정량을위한 새로운 접근

단일 세포 약물 섭취, 신진 대사 및 효과를 연구하기 위한 통합 라만 분광법 및 질량 분광법 플랫폼

복구하는 새로운 미세 절제 접근

액체 및 고체 종양 유래의 암세포 프로테옴 정량적 질량 분석 프로파일

LAESI 질량 분석법에 의해 생물 학적 조직 및 Biofilms의 대기 압력 분자 이미징

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

¹⁸FDG PET/CT 영상 공부 결핵균 감염 및 비 인간 영장류에서 치료 도구로 서의 분석

결핵 분자 세균 부하 분석 (TB-MBLA)

얇은 층 크로마토그래피에 의한 진균의 지질 조성 분석

화학 지도 제작 은 Trypanosomatid 감염을 연구 하는 접근