Biz Paul O'Brien, Marizel Mina ve Isabella Freedman hayvan deneyleri için Jacquie Gonzalez ve Danielle Weiner NIH/NIAID dan önce lazer yakalama mikrodiseksiyon ve Jansy Sarathy tavşan doku el yazması için gama ışınlama ile yardım için teşekkür düşünce ve tavsiye. Bu eser Bill'den fon tarafından desteklendi ve Melinda Gates Vakfı (OPP1174780) ve paylaşılan NIH araçları 1S10OD018072 verin. Eliseo A. Eugenin Leica LMD 6500 mikroskop erişim sağlayan ve uzmanlık ve tavsiye paylaşımı için teşekkür ederiz. Satın alma ve devam eden desteğiyle LMD 6500 Ulusal Enstitüsü ruh sağlığı grant, MH096625, sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur, NS105584, PHRI (E.A.E) finansman ve GSK katkılar (E.A.E) tarafından finanse edildi.

Tüm hayvan çalışmaları doğrultusunda Kılavuzu bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri ile kurumsal hayvan bakım onayını ve kullanım Komitesi, NIAID (NIH), Bethesda, MD için yapılmıştır
1. hayvan deneyleri ve doku koleksiyonu
Bu bölümde Protokolü'nün hayvan yordamlar ve örnek koleksiyon Biyogüvenlik seviye 3 (BSL3) koşullar altında açıklanmaktadır. Protokol tavşanların Mycobacterium tüberküloz aerosol enfeksiyon yordam ve İlaç İdaresi detaylı iletişim kuralları daha önce açıklanan11,12.
<ol><li>Yeni Zelanda beyaz tavşan (erkek ve kadın, 4-5 aylık) M. tuberculosis HN878 ile enfekte bir salt burun aerosol sistemi kullanarak, daha önce açıklanan11.</li>
	<li>Seçilen ilaçlar (burada sunulan örnekte etambutol) tercih edilen rota yönetmek ve hayvanlar 2, 6 ve 24 h yönetim takip ötenazi. İlk olarak, tavşan tarafından ketamin 5 mg/kg kas içi enjeksiyon 35 mg/kg ve Xylazine anestezi. 10 dakika bekleyin ve doğru anesthetization kuyruk pinching ve yavaşça göz dokunmadan onaylayın. Herhangi bir tepki ise, Fentobarbital ve fenitoin ( Tablo malzemelerigörmek) intravenöz yönetimi tarafından 1 mL/4.5 kg 2 mL steril serum fizyolojik içinde ötenazi. Not: Bu timepoints farmakokinetik profil etambutol için karşılamak için en iyi durumda ve ayarlama/diğer çalışma uyuşturucu için en iyi duruma getirme gerektirebilir.</li>
	<li>Pens, makas ve/veya skalpel kullanarak, akciğerler göğüs boşluğundan Kaldır, akciğer biyopsisi (3daha önce açıklandığı gibi) ilişki kurmadan Akciğer doku çevreleyen gömülü büyük nekrotik granülomlar içeren çıkarabileceğim. Nekrotik granülomlar görünür içinde bej renk ve genellikle biraz çıkıntı çevreleyen kırmızı/pembe renkli akciğer. Kolay cryosectioning kolaylaştırmak için biyopsiler 2 x 1.5 x 1,5 cm büyük olduğundan emin olun.</li>
	<li>Forseps kullanarak, önceden etiketli cryomold tepsi istenen kesme yüzeyi üzerine biyopsi tepsiyi Bankası ile doğrudan temas yerleştirin. Sonra dondurma, bu hangi cryosections keserim düz bir yüzey sağlar.</li>
	<li>Sıvı azot buharı biyopsiyi durdur. Bir styrofoam konteyner 2 inç derinliğe kadar sıvı azot ile doldurun ve bir metal tel tüp rafa yerleştirin. Raf düz bir yüzey üzerinde doku tepsiler yerleştirilir sağlayan sıvı azot yüzeyi üzerinde çıkıntı. Kapağı geri styrofoam konteyner üzerinde yerleştirin ve dokuları tam olarak dondurmak 10 dakika bırakın.</li>
	<li>Doku tepsileri kaldırın, hızlı bir şekilde alüminyum filmde sarın ve tek tek resealable plastik torbalar ve mühür etiketli yerleştirin. -80 ° C dondurucu depolama için transfer. Not: Adımlar 1.1-1.6 (tüm hayvan iş de dahil olmak üzere ve hastalıklı organ ve dokulara işleme) BSL3 koşullarda gerçekleştirilir. Gama ışınlatayım BSL3 kapsama dışında işlemeyi etkinleştirmek IÇIN 3 Megarads, akciğer biyopsisi. Lazer yakalama mikrodiseksiyon unsterilized doku üzerinde güvenlik protokollerini onaylandığı takdirde tesis kilometresi BLS3 içinde gerçekleştirilebilir. Ancak, bu iletişim kuralını kalan BSL-2 tesiste aşağı akım işleme açıklar.</li>
</ol>2. doku kesit
<ol><li>Cryostat istenen kesme sıcaklık ayarlayın. Gama radyasyona maruz akciğer biyopsisi için cryostat-80 ° C depolama ortamından aktarmak ve doku sıcaklık equilibrate 30 dakika bekletin. Not:-22 ° C-20-TB Lezyondan biyopsi için en uygunudur.</li>
	<li>Cımbız kullanarak, Chuck doku Bankası bağlı kalmak için en uygun kesme sıcaklık yapıştırıcı (OCT) küçük bir miktar kullanarak cryostat Chuck biyopsi düzeltmek. Doku (yani cryomold Bankası ile temas oldu) düz yüzey kesme maruz yüzeydir gelecek şekilde yönlendirin. Bu sonraki kütle spektrometresi analizi ile girişime neden olabilir gibi OKT doku yüzeyi kontamine değil emin olun.</li>
	<li>Üç doku bölüm 25 µm kalınlık, kesme ve evde beslenen hayvan membran slaytlar monte. Yavaşça membran doku bölümüne dokunma ve kaldırın. Çok fazla baskı uygulanırsa, ince zar gözyaşı.<ol>
<li>Bu şarj edilmiş ve zavallı yapışma doku bölümlerin olma evde beslenen hayvan membran yol açar gibi montaj öncesinde slaytlar aşırı kullanımı önlemek. Membran slayt tezcan-montaj ve başarılı yapışma doku membran için etkinleştirmek için oda sıcaklığında tutulur emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slayt cryostat kaldırmak ve 3 dakika kurumasını bekleyin. LCM-LC/MS/MS hemen gerçekleştirilmez, slayt küçük hava geçirmez yapışmalı çanta ve diseksiyon için gerekli kadar-80 ° C depolama birimine transfer kapatın.</li>
	<li>10-12 µm ve tezcan-mount Hematoksilen ve Eozin (H & E) Boyama ve referans için standart cam slayt üzerindeki bitişik bir bölüm kesmek. Ek bölümler (Mycobacterium tüberküloz (MTB) görüntülenmesi için Ziehl-Niellsen gibi) diğer istenen histochemistry lekeler için şu anda kesebilir.</li>
</ol>3. mikrodiseksiyon
<ol><li>-80 ° C depolama slayt içeren mühürlü torba kaldırmak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ulaşmak için izin verir. Not: soğuk slayt hemen laboratuvar atmosfer yararlanılır, doku yoğunlaşma ile kaplı olmak ve ilaç kayma bütünlüğünü tehlikeye olabilir.</li>
	<li>Mikroskop ve lazer açın (kesme başlamak önce lazer 5-10 dakika kadar sıcak gerektirir). Düz-cap 0.20 mL PCR tüpleri yuvasına yükleyin.</li>
	<li>Slayt çantasından çıkarın ve Düz Yataklı Tarayıcı kullanarak evde beslenen hayvan slayt üzerinde doku bölümünün bir optik görüntü al.</li>
	<li>Slayt Slayt tutucusuna (doku yüzü aşağı bakacak şekilde) koyun ve ayrı toplama tüpler istimal mikroskop bilgisayar yazılımı ilgi belirli Granülom bölgelerine atayabilirsiniz. Genellikle, bunlar-ecek var olmak 'ilişki kurmadan akciğer,' 'hücresel Granülomu,' ve 'caseum' (nekrotik Merkez), ama olabilir Granülom/biyopsi belirli patoloji bağlı olarak değişir.</li>
	<li>5 X mikroskop objektif kullanarak doku odaklanmak. Bu büyütme dokusu hem hücresel ve nekrotik Granülom alanları içeren iyi bir bakış sağlamak. Yazılımda konum'un altında doku içine taşımak için 'caseum' belirlenmiş tüp seçin.</li>
	<li>İstenen diseksiyon parametrelerini girin. Lazer güç 30, hız 15 ve diyafram 35 (rasgele adet) 25 µm kalınlığında akciğer bölüm için tipik ayarlarıdır. Ancak, bunlar kullanılan mikroskop ve güç lazer yaş nedeniyle azalan potansiyel bağlı olarak farklı olacaktır.</li>
	<li>'Ücretsiz-beraberlik' aracını seçin ve bir fare veya dokunmatik ekran kalemi kullanarak, istenilen bölge diseksiyon için anahat. Bölgesinin yüzey alanı-ecek var olmak göstermek içinde belgili tanımlık bilgisayar yazılımı. Seçili bölgeler daha kolay diseksiyon kolaylaştırmak için 500.000 µm2 (0,5 mm2) altında tutun. Tüp şapkalı toplam 3 milyon µm2 (3 mm2) toplanan kadar diseksiyon yineleyin.<ol>
<li>Bazı durumlarda, disseke bölge (örneğin statik cazibe) nedeniyle çevredeki membran için takılıp kalır ve koleksiyon kap düşmek değil. Bu bölgeler seçerek ve el ile kaldırma yazılım içinde toplu yüzey alanındaki toplam silin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cap 'hücresel lezyon' için seçin ve 3 milyon µm2 adım 3.7 belirtildiği gibi aynı işlem kullanılarak doku toplamak.</li>
	<li>Cap 'ilişki kurmadan akciğer' için seçin ve 3 milyon µm2 adım 3.7 belirtildiği gibi aynı işlem kullanılarak doku toplamak. İlişki kurmadan Akciğer doku birçok bronchioles ve alveoler alanlarda içerdiğini unutmayın. Bunlar diseksiyon için tanımlanmış doku bölgelerden dışlamak için dikkat.</li>
	<li>Kapak Tutucu kaldırmak ve dikkatle Açıl, mühür ve her tüpün etiket. Hava bozuklukları (gibi) hava akışı kesintileri bir açılış kapıdan itibaren çevreleyen disseke doku korumak. Disseke dokularda hemen, analiz veya-80 ° C'de depolayın ve önceden işleme ve LCMS analiz çözülme.</li>
</ol>4. çıkarma ve LCMS analizi
<ol><li>1:1 Asetonitril/metanol etambutol d-10 dahili standart içeren ayıklama çözüm hazırlamak. Bir iç standart seçerken, kullanım analit uyuşturucu etiketli formun kararlı bir izotop önlemek için yeterli yığın shift ile (döteryum etiketli EMB Bu gösteride kullanılan gibi) çapraz konuşma analit uyuşturucu ve standart (genellikle en az 4 Dalton) arasında . Not: çünkü çok sınırlı denetim doku homogenate standartları oluşturmak için ilgili doku türlerinin homogenate içinde standartları oluşturmak zordur. Standartları bir çivili homogenate örnek yapma alternatif olarak, bir standart boş doku ve test bileşik birlikte ve açılan ekleyerek oluşturulabilir. Hedef birimin çalışma örnek doku bölümler eşleştirir bir homogenate kontrol doku hacmi doğrudan verilen bir konsantrasyon mevcut olurdu test bileşik bir miktar ile birleştirilmiştir.</li>
	<li>Yüzey alanı ve doku bölümü kalınlığına göre hedeflenen doku hacmi hesaplamak ve standart ve QC örnekleri-ecek var olmak mülhak homogenate hacmi kullanarak homogenate için gerekli seyreltme faktörü belirlemek. Hesaplamalar aşağıda 3 milyon µm2 (3 mm2) disseke hedef alanı için bir 25 µm kalınlık ve homogenate hacmi 2 µL ile gösterilmiştir. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>1 g/mL, doku yoğunluğu varsayarak hazırlamak homogenate stok kontrol doku 50 mg ağırlığında ve sulandırmak için PBS arabellek ekleme (26.67 homogenate seyreltme faktörü kullanılarak hesaplanır adım 4.2, eritici 1.283 mL). Boncuk boncuk homogenizer 1750 devirde 5 dakika akciğer dokusu ve PBS arabellek yenerek tarafından lunaparkçı. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>1 mg/mL ilaç stokları konsantrasyonu 1:1 Asetonitril/su çözümleri spiking standart eğri oluşturmak için sulandırmak. Spike birim ve hedef doku birimi temel standart konsantrasyonları spiking belirlemek. Bir 100 ng/mL için bir 10 µL spike birim için standart resimli örnektir. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>-80 ° C depolama microdissected dokulardan içeren tüpler kaldırın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ulaşmak için izin.</li>
	<li>1:1 Asetonitril/su çözüm 10 µL ve PBS arabelleğinin 2 µL microdissected doku içeren tüpler ekleyin.</li>
	<li>Standart eğri ve kalite kontrol tüpleri için eriyik-e doğru kontrol akciğer homogenate 2 µL spiking 10 µL ekleyin.</li>
	<li>Ayıklama çözüm 50 µL her tüp için ekleyin.</li>
	<li>Girdap her tüpün 5 dakika, 5 dakika için solüsyon içeren temizleyicide ve Pelet film ve her tüpün doku oluşturmak için 5000 devirde 5 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>96-şey derin-şey plakasına süpernatant ile 50 µL aktarmak ve bir ek 50 µL her şey deiyonize su ile sulandırmak.</li>
	<li>Etambutol ve etambutol-d10 iç standart (daha önce ayrıntılı12' açıklandığı gibi) için en iyi duruma getirilmiş enstrüman parametrelerini kullanarak LC/MS/MS çözümlemesi gerçekleştirin.</li>
	<li>Seyreltme faktörü her örnek için disseke doku miktarı için düzeltmek için kullanın. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. yöntemi doğrulama
<ol><li>Bir homogenate 1 Bölüm akciğer, 2 parça PBS ve 3-4 çelik boncuk birleştirerek denetim akciğer dokusunda oluşturun. Akciğer dokusu ve PBS arabellek 1750 devirde boncuk homogenizer kullanarak 5 dakika yendi.</li>
	<li>Homogenate 10.000 ng/mL (10 mg/mL) ve girdap son konsantrasyon 1 dakika oluşturmak için 990 µL homogenate içine 1 mg/ml etambutol DMSO hisse senedi 10 µL ekleyerek spike.</li>
	<li>Tarafından homogenate bir cryomold dökme ve hızla 5 dakika kuru buza buz gibi donmuş homogenate Bloğu Oluştur.</li>
	<li>2.1-2,5 adımlarda açıklandığı gibi homogenate blok 25 µm kalınlığında bölümleri hazırlayın.</li>
	<li>Hedef doku alan adımları 3.2-3.10 belirtildiği gibi incelemek.</li>
	<li>10 µL 1:1 Asetonitril/su ve 2 µL PBS arabelleği microdissected doku içeren tüpler ekleyin.</li>
	<li>Ayıklama çözüm 50 µL her tüp için ekleyin. Standart bir eğri oluşturmak ve doku homogenate blok içinde ilaç konsantrasyonu belirlemek için 4,9-4.12 adımları izleyin.</li>
	<li>Ayıklama verimliliği aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+(DESI)+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection.">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling.">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li><li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections.">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li><li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies.">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li><li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging,+laser+capture+microdissection,+and+LC-MS/MS+of+the+same+tissue+section.">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li><li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics:+methodologies+and+clinical+applications.">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li><li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis.">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+A+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).</li><li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy.">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li><li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis.">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model.">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li><li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response.">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Dağınık şekilde çözülmüş miktar akciğer TB lezyonlar içinde ilaçların ilaç pozlama sterilize konsantrasyonları bakteriyel nüfus farklı lezyon bölmeleri içinde ikamet eden ulaşır olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Burada açıklanan LCM-LC/MS yöntemi kullanarak yalnızca 1-3 doku bölümleri toplam bakteri açısından zengin caseum de dahil olmak üzere bütün lezyon bölümler içinde anti-TB ilaçların mutlak miktar sağlar. Geleneksel doku homojenizasyon ve LC/MS yaklaşımlar iç...

Dağınık şekilde çözme ve ilaç düzeyleri ölçmek özelliğini Anti-tüberküloz ilaçlar bakteriyel altgrupları konsantrasyonları1sterilize, akciğer lezyonları içinde ulaşmak olup olmadığını belirlemek için çok önemli bir gereksinimdir. Belirli önemi uyuşturucu penetrasyon (caseum denir) lezyon genellikle basiller en yüksek sayısını içerir ve ilaçlara vaskülarizasyon yokluğu nedeniyle erişilebilir olabilir nekrotik çekirdek içine belirliyor.
Homojenizasyon eksize pulmoner lezyonların dahil lezyon penetrasyon, değerlendirmek için geleneksel yöntemleri ardından solvent ekstraksiyon ve sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LC/MS) analizi, son derece hassas ve uyuşturucu için seçici faiz. Ancak, bu yöntemleri özgün homojenize doku boyutunu sınırlı yoksul mekansal bilgi sunuyoruz. Kütle spektrometresi tabanlı görüntüleme yaklaşımlar, matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonlaşma (maldı)2,3gibi electrospray iyonlaşma (DESI)4 ya da yüzey çıkarma sıvı gelişmiş5desorption, 6 teklif görüntüleme yetenekleri son derece dağınık şekilde çözüldü, ama doğrudan miktar son derece zor ya da imkansız heterojen iyon bastırma etkileri ve çeşitli hücreden analit farklı ayıklama verimliliği nedeniyle olabilir veya doku7türleri. Ayrıca, en doğrudan doku MS görüntüleme yaklaşımlar doğal olarak daha az LC/MS iyonlaşma ve uyuşturucu dokusundan daha düşük solvent ekstraksiyon verimliliği için rekabet endojen türlerin Kromatografik ayırma eksikliği nedeniyle daha duyarlıdır.
LC/MS analizi ile kombine lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yalıtmak ve proteomik8,9 çalışmalar için farklı doku bölgeleri karakterize için rutin olarak uygulanan ve son zamanlarda uyuşturucu miktar için kullanılan içinde ilaç hayvan doku10. Burada en iyi duruma getirilmiş bir protokol farklı Granülom bölmeleri içinde anti-TB uyuşturucu ölçmek için LCM LC/MS (LCM-LC/MS) analizi ile birlikte uygulama mevcut. Lazer yakalama mikrodiseksiyon işlemi bir UV lazer ile mikroskop objektif keser ve kullanıcı tarafından tanımlanan bir yolu takip ederek istenilen doku alan izole doku bölümü üzerine odaklanmıştır. Yerçekimi destekli LCM için (Bu araştırma için kullanılan teknik), doku bölümü (PET veya kalem) bir ince polimer membran slayt monte edilir ve doku slayt oturtulmuş bir koleksiyon tüp şapkalı yakalanır. Uyuşturucu eksize dokudan ayıklanır ve standart LC/MS yaklaşımları kullanarak sayılabilir. Doku toplanması için gerekli miktarı sonuçta dokuda mevcut uyuşturucu beklenen konsantrasyonu ve LC/MS yöntemi duyarlılık belirlenir. Terapötik düzeyde ilaç ve bir rutin triple quadrupole Kütle Spektrometre, 3 milyon µm2 (3 mm2) dokusunun kullanılarak analiz ilaçların çoğu analizleri için yüzey alanı yeterlidir.
Bu iletişim kuralı kayma profil oluşturma güçlü bir kombinasyon açıklar ve mutlak ilaç konsantrasyonları TB granülomlar bütün bölümler içinde sağlayan tam miktar LCM-LC/MS tarafından sunulan. Teknik aynı zamanda birçok farklı hastalıklı dokuları hayati ilaç bulma ve geliştirme bilgi veren konsantrasyonlarda uyuşturucu belirlemek için uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">New Zealand White rabbits</td>
			<td style="width:159px;">Covance</td>
			<td style="width:155px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">HN878 Mycobacterium tuberculosis</td>
			<td style="width:159px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:155px;">NR-13647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Virbac</td>
			<td style="width:155px;">710101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A955-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A456-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Formic Acid (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Water (LC-MS grade)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">W6212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">0.2 mL flat-cap PCR tubes</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">07-200-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Steel frames, PET-membrane</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">11505151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Premium Frosted Microscope Slides</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#160;96 Deep well plate 2.0ML PP RB&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">NC0363259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Zorbax SB-C8&#160;column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &#956;m)</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;">820631-001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#34;Zipper&#8221; Seal Sample Bags</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">01-816-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Equipment</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CM1850&#160;cryostat</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica CM1860 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Laser Microdissection System 6500</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica LMD 6 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Agilent 1260 Infinity II HPLC&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:159px;">Sciex</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

Tüberküloz hala morbidite ve mortalite dünya çapında önde gelen bir nedenidir. İlerleme-e doğru mevcut uyuşturucu rejimleri ve roman therapeutics gelişimi şiddetle ihtiyaç vardır. Ulaşmak ve bakteri kötü skarların nekrotik bölgeler (caseum), pulmoner granülomlar içinde sterilize etmek için biraz dozlayıp TB uyuşturucu başarılı terapötik müdahale için çok önemli bir özelliğidir. Etkili tedavi rejimleri bu nedenle uyuşturucu ile olumlu caseum penetrasyon özellikleri içermesi gerekir. Biyolojik dokuların seviyelerinde ilaç miktarının geçerli LC/MS yöntemler sınırlı Uzaysal çözünürlük yetenekleri, doğru küçük doku bölmeleri içinde bulunanlar gibi içinde mutlak ilaç konsantrasyonu belirlemek üzere nekrotik granülomlar. Burada lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) patolojik olarak farklı doku bölgeleri LC/MS miktar ile birleştiren bir iletişim kuralı mevcut. Bu teknik granuloma caseum, hücresel lezyon ve ilişki kurmadan Akciğer doku çevreleyen içinde ilaçların mutlak miktar sağlar ve bu nedenle, doğru bir şekilde bakterisidal konsantrasyonları elde olup olmadığını belirler. Tüberküloz araştırma ek olarak, teknik hastalıklı dokularda dağınık şekilde çözülmüş miktar uyuşturucu için birçok potansiyel uygulamalar var.

LCM-LC/MS yaklaşım genel bakış şekil 1' de gösterilen. Gama-ışın tarafından doku sterilize sonra (doku itibaren kesit) üzerinden tüm sonraki adımları BSL3 koşullar dışında gerçekleşecek. Şekil 2 lezyon öncesi ve sonrası doku yalıtım LCM tarafından biyopsisi bölümleri gösterir. TB lezyonlar nekrotik ve hücresel bölgelerin kolayca tespit ve optik görüntü (olmadan bitişik doku histolojik olarak lek...

Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Burada, LC/MS analizi ile birleştiğinde lazer yakalama mikrodiseksiyon dağınık şekilde ölçmek-akciğer tüberkülozu granülomlar içinde uyuşturucu dağıtımı için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Yaklaşım ilaç konsantrasyonları yüksek uzaysal detay dokularda miktarının için geniş uygulanabilirliği vardır.

Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Görüntüleme.  Rutgers, The State University of New Jersey. Burada, LC/MS analizi ile birleştiğinde lazer yakalama mikrodiseksiyon dağınık şekilde ölçmek-akciğer tüberkülozu granülomlar içinde uyuşturucu dağıtımı için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Yaklaşım ilaç konsantrasyonları yüksek uzaysal detay dokularda miktarının için geniş uygulanabilirliği vardır.

Video: Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating and exposing these cells to mainstream cigarette smoke (CS), in order to study epithelial cell responses to CS exposure. The protocol consists of three parts: the isolation of airway epithelial cells from mouse trachea, the culturing of these cells at air-liquid interface (ALI) as fully differentiated epithelial cells, and the delivery of calibrated mainstream CS to these cells in culture. The ALI culture system allows the culture of respiratory epithelia under conditions that more closely resemble their physiological setting than ordinary liquid culture systems. The study of molecular and lung cellular responses to CS exposure is a critical component of understanding the impact of environmental air pollution on human health. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the etiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and other tobacco-related diseases, which represent major global health problems.

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating, culturing and exposing these cells to mainstream cigarette smoke, in order to study molecular responses to this environmental toxin.

Hava Sıvı Arabirimi Fare Solunum Epitel Hücreleri ve Deneysel sigara dumanına maruz kalma izolasyonu

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Tıp

Magnetic Resonance Imaging Quantification of Pulmonary Perfusion using Calibrated Arterial Spin Labeling

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, fraction (FIO2) = 0.21) hypoxia (FIO2 = 0.125), and hyperoxia 
(FIO2 = 1.00). In addition, the physiological responses of the subject are monitored in the MR scan environment. MR images 
were obtained on a 1.5 T GE MRI scanner during a breath hold from a sagittal slice in the right lung at functional residual capacity. An arterial 
spin labeling sequence (ASL-FAIRER) was used to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow 1,2 and a multi-echo fast 
gradient echo (mGRE) sequence 3 was used to quantify the regional proton (i.e. H2O) density, allowing the quantification 
of density-normalized perfusion for each voxel (milliliters blood per minute per gram lung tissue). 
With a pneumatic switching valve and facemask equipped with a 2-way non-rebreathing valve, different oxygen concentrations 
were introduced to the subject in the MR scanner through the inspired gas tubing. A metabolic cart collected expiratory gas via expiratory tubing. Mixed expiratory O2 and CO2 concentrations, oxygen consumption, carbon dioxide production, respiratory exchange ratio, 
respiratory frequency and tidal volume were measured. Heart rate and oxygen saturation were monitored using pulse-oximetry. 
Data obtained from a normal subject showed that, as expected, heart rate was higher in hypoxia (60 bpm) than during normoxia (51) or hyperoxia (50) and the arterial oxygen saturation (SpO2) was reduced during hypoxia to 86%. Mean ventilation was 8.31 L/min BTPS during hypoxia, 7.04 L/min during normoxia, and 6.64 L/min during hyperoxia. Tidal volume was 0.76 L during hypoxia, 0.69 L during normoxia, and 0.67 L during hyperoxia. 
Representative quantified ASL data showed that the mean density normalized perfusion was 8.86 ml/min/g during hypoxia, 8.26 ml/min/g during normoxia and 8.46 ml/min/g during hyperoxia, respectively. In this subject, the relative dispersion4, an index of global heterogeneity, was increased in hypoxia (1.07 during hypoxia, 0.85 during normoxia, and 0.87 during hyperoxia) while the fractal dimension (Ds), another index of heterogeneity reflecting vascular branching structure, was unchanged (1.24 during hypoxia, 1.26 during normoxia, and 1.26 during hyperoxia). 
Overview. This protocol will demonstrate the acquisition of data to measure the distribution of pulmonary perfusion noninvasively under conditions of normoxia, hypoxia, and hyperoxia using a magnetic resonance imaging technique known as arterial spin labeling (ASL). 
Rationale: Measurement of pulmonary blood flow and lung proton density using MR technique offers high spatial resolution images which can be quantified and the ability to perform repeated measurements under several different physiological conditions. In human studies, PET, SPECT, and CT are commonly used as the alternative techniques. However, these techniques involve exposure to ionizing radiation, and thus are not suitable for repeated measurements in human subjects.

A MR imaging method to study the distribution of pulmonary blood flow under a variety of physiological conditions, in this case exposure to three different inspired oxygen concentrations: hypoxia, normoxia, and hyperoxia, is described. This technique utilizes human pulmonary physiology research techniques in an MR scanning environment.

Akciğer Perfüzyon Kalibreli Arter Spin Etiketleme kullanarak Manyetik Rezonans Görüntüleme Niceleme

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, ...

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

Parkinson Hastalığında nöropeptitler MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

LC-MS / MS kullanarak Kurutulmuş Kan Spotlar Immünosupresan Tacrolimus Niceleme

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a specific anatomical region. Within the brain, metals have a highly compartmentalized distribution, depending on the primary function they play within the central nervous system. Imaging the spatial distribution of metals has provided unique insight into the biochemical architecture of the brain, allowing direct correlation between neuroanatomical regions and their known function with regard to metal-dependent processes. In addition, several age-related neurological disorders feature disrupted metal homeostasis, which is often confined to small regions of the brain that are otherwise difficult to analyze. Here, we describe a comprehensive method for quantitatively imaging metals in the mouse brain, using laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) and specially designed image processing software. Focusing on iron, copper and zinc, which are three of the most abundant and disease-relevant metals within the brain, we describe the essential steps in sample preparation, analysis, quantitative measurements and image processing to produce maps of metal distribution within the low micrometer resolution range. This technique, applicable to any cut tissue section, is capable of demonstrating the highly variable distribution of metals within an organ or system, and can be used to identify changes in metal homeostasis and absolute levels within fine anatomical structures.

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Quantitatively mapping metals in tissue by laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) is a sensitive analytical technique that can provide new insight into how metals participate in normal function and disease processes. Here, we describe a protocol for quantitatively imaging metals in thin sections of mouse neurological tissue.

İndaktif Plazma - - Lazer Ablasyon Beyin Dokusu Görüntüleme Metaller Kütle Spektrometresi (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

Gut-kan bariyerini ve karaciğer metabolizması Microbiota ürünlerin değerlendirilmesi için In Vivo yöntemi

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease susceptibility, drug target discovery, and precision medicine. Alternative IgG N-glycans have been reported in several common chronic diseases and suggested to have great potential in clinical applications (i.e., biomarkers for diagnosis and prediction of diseases). IgG N-glycans are widely characterized using the method of hydrophilic interaction chromatography (HILIC) ultra-performance liquid chromatography (UPLC). UPLC is a stable detection technology with good reproducibility and high relative quantitative accuracy. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated, and glycan composition and relative abundance in plasma are characterized.

Immunoglobulin G (IgG) N-glycan is characterized using hydrophilic interaction chromatography UPLC. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated. Presented here is an introduction to this experimental method so that it can be widely used in research settings.