우리는 긴장, 자연과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 꼬마 유전학 센터 및 캐나다 재단 혁신 (CFI)에 대 한 자금에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리 박사 Exing 왕 (부 교수 감독, 광학 이미징 시설 뿐만 아니라 Lizhen 첸 박사 (셀 시스템의 부 및 해부학, UT 건강 샌 안토니오) 모든 선 충 C. 실험에 대 한 그녀의 실험실 시설의 무제한 사용 허용에 대 한 감사 하 고 싶습니다. UT 건강 샌 안토니오)를 통해 confocal 현미경 검사 법. 우리 또한 박사 마 이런 Ignatius 지원 및 비디오 촬영을 촉진 하기 위하여 격려를 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.

1. 얼룩 및 장 리소좀 이미지
<ol><li>씨 선 충 성장 매체 (NGM) OP50와 플레이트
	<ol>
<li>권장된 프로토콜19 당 NGM 접시를 준비 하 고 실 온에서 2 일 동안 건조 닫힌된 접시 허용.</li>
		<li>OP50 박테리아 살 균 Luria 국물 (파운드) 국물에 접종 하 고 36 h 또는 마약은 0.2 ~ 0.4까지 37 ° C에서 떨고 인큐베이터 또는 물 목욕에서 성장. OD와 세균성 문화를 사용 하지 마십시오 > 1 또는 OD < 0.2.</li>
		<li>NGM 접시 건조 되 면, 드롭 (~ 30 µ L)는 격판덮개의 센터에 OP50 inoculum의 장소와 다음 패치에 대략 2 cm x 2 cm 크기에서에 드롭 확산. 참고: 모든 나머지 OP50 inoculum 최대 한 달에 4 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>OP50 플레이트는 inoculum (약 10 또는 15 분), 건조가 되 면 반전 하 고 36 h에 대 한 37 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
		<li>36 h 후 나중에 사용할 때까지 판 인큐베이터와 4 ° C에서 저장소에서 제거 합니다. 참고: 격판덮개는 4 ° c.에 최대 1 달 좋은 되어야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>OP50에 cDCFDA를 보충
	<ol>
<li>보완 하기 위해 cDCFDA OP50 격판덮개에, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 10 m m cDCFDA의 작업 재고를 준비 합니다. 빛과 나중에 사용-20 ° C에서 저장소에서 보호 cDCFDA 솔루션을 유지.</li>
		<li>전체 패치 cDCFDA 덮여 균일 하 게 되도록 부드럽게 2 cm x 2 cm OP50 패치, 표면에 10 mM cDCFDA 솔루션의 100 µ L를 놓습니다. 참고: 그것은 매우 중요 한 OP50의 전체 패치 cDCFDA 덮여 있다입니다. 필요한 경우, cDCFDA의 최대 150 µ L를 사용 하 여 각 접시. 그것은 또한 절대적으로 모든 cDCFDA OP50 패치에서 흐르는 음식에 통합 되지 것입니다 얼룩 강도 감소 귀 착될 것 이다 이후 cDCFDA 솔루션 OP50 패치의 국경을 넘어 확장 되지 않습니다.</li>
		<li>OP50 번호판을 벤치 위에 어두운 상자 에서도 cDCFDA 솔루션의 모든 세균 패치에 흡수 될 때까지 (일반적으로 약 25 ~ 30 분).</li>
	</ol></li>
	<li>CDCFDA를 사용 하 여 웜 얼룩
	<ol>
<li>일단은 cDCFDA는 완전히 OP50 패치를 침투 해, 접시 당 20 개 이상 벌레 놓고 14 h의 최소 20 ° C에서 거꾸로 접시를 품 어. 참고: 그것은 빛에 노출을 최소화 하기 위해 불투명 한 상자에서 cDCFDA 접시를 권장.</li>
		<li>섭취 량 차이 실험 제어 하 고 cDCFDA 신호를 정상화 (권장) 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) (공동 얼룩 difluoro) 붕 소 (갓 만든된 1mm 솔루션의 2.5 µ L), 산 성 pH 스펙트럼을 통해 그 형광은 크게 비 변형 acidotropic 약한 아민 염료 (시 약의 일반적인 이름에 대 한 재료의 표 참조). 이후이 부적당 한 cDCFDA 착 강도 제공할 수 있습니다 lysosomal pH의 잘못 된 해석에 게 참고: 14 h에 대 한 웜 착 색 하지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>현미경 검사 법에 대 한 슬라이드를 준비
	<ol>
<li>테이프 약 3 인치 미러 (그림 1)과 같은 부드럽고 평평한 표면에 떨어져 라벨의 두 개의 병렬 스트립을 놓습니다.</li>
		<li>코트 발 수 스프레이, 거울의 표면 그리고 과잉 액체를 닦아.</li>
		<li>2 %agarose (증류수 H2O에서에서 해산) 완전히 액 화 될 때까지 전자 레인지에 녹여 다음 테이프의 2 개의 지구 사이 agarose의 50 µ L 드롭 놓고 슬라이드의 스트립에 수직이 되도록 신속 하 게 드롭 현미경 슬라이드 커버 테이프입니다. agarose는 경화 후 슬라이드를 뒤집어 슬라이드, 아래 원형 패드 형성 고 5mm 나트륨 아 지 드 (NaN3) agarose 패드에의 10 ~ 15 µ L를 추가 합니다. 참고: 앤3 시 토 크롬 C 억제제는 그 때 낮은 농도에서 사용, 그들은 이미징 동안 이동 하지 것입니다 벌레를 anesthetizes 역.</li>
		<li>CDCFDA, 보충 OP50 접시에서 벌레를 선택 하 고 어떤 OP50 없이 깨끗 한 NGM 접시에 그들을 전송. 벌레는 벌레의 표면에서 제거 하는 OP50의 대부분을 허용 하는 몇 초 동안에 대 한 이동 하 고 agarose 패드 5 m m 나트륨 아 지 드를 포함 하는 벌레를 전송.</li>
		<li>즉시 커버 슬립을 agarose 패드 커버. 때문에이 벌레 파열 귀 착될 수 있다 너무 많은 압력을 적용 하지 않고 부드럽게 커버 슬립을 배치 해야 합니다. 참고: OP50 박테리아 cDCFDA 보충 형광 현미경 검사 법에 의해 시각화 하는 때, 따라서 그건 나트륨 아 지 드를 포함 하는 agarose 패드에 그들을 배치 하기 전에 가능한 만큼 최고로 벌레를 청소 하는 것이 중요. C. 선 충 (를 포함 하 여 N2, 야생 유형 제어)의 이상의 6 종자를 준비 하는 경우 그것은 agarose 패드에 벌레를 건조 하지 않습니다 있도록 6의 일괄 처리에서 샘플을 준비 하는 것이 좋습니다. 일부 변종에 외 음부는 적절 하 게 계획 하는 것이 중요 하다 그래서 압력 커버 슬립으로 인해 시간의 연장된 기간 후 파열 시작 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Confocal 현미경 검사 법 참고: 일부 현미경 형광의 가변 레벨을 보상 형광 강도 자동으로 증가 하는 내장 기능이 있습니다. 이러한 현미경 이미징 벌레 때문에 그들은 본질적으로 샘플의 형광 강도 증가 것입니다 cDCFDA, 물에 잘 작동 하지 않을 수 있습니다.<ol>
<li>여기/방출 파장 488/530 설정을 사용 하 여 표준 confocal 현미경 이미징 수행 cDCFDA에 대 한 nm. 단일 평면 이미지 (Z 스택을 하지) 장 리소좀의 고 강도 정량화에 대 한 초점 (최대 신호 강도)은 리소좀만 사용. 참고: 아마도 염료 여부의 차이 때문에 인 두를 직접 후부 창 자 세포의 lysosomes 유지 cDCFDA 유전자 형 이나 나이 관계 없이 강도 얼룩, 따라서 주의 해야 이미징 리소좀이이 세포에서 피하려고.</li>
		<li>N2 첫째로 벌레 2 일 오래 된 야생 타입 포함 된 슬라이드 이미지. 이렇게 하는 동안 레이저 전력 등, 작은 구멍, 조리개 cDCFDA 강도 얼룩 하지 oversaturated 되도록 confocal 영상 매개 변수를 조정 합니다. 참고: 일단이 설정을 변경 하지 마십시오 그들 그날 영상의 전체 기간에 대 한.</li>
		<li>소장 (벌레 당 3 ~ 4 이미지)의 단일 평면 1024 x 1024 픽셀의 이미지 캡처는 60 배 확대 렌즈를 사용 하 여. 참고: 벌레에 cDCFDA 방출 스펙트럼 520 nm의 보고 된 형광 스펙트럼20은 장 autofluorescence (그림 3)에서 특정 신호 판독을 제공와 동시에 하나의 눈에 띄는 피크를 얻을 것입니다.</li>
		<li>각 채널에 대 한.tiff 파일로 원시 confocal 이미지 (.lsm 파일)를 내보냅니다.</li>
		<li>다음, ImageJ를 열고 파일을 클릭 | 오픈 측정할 수에 이미지 파일을 엽니다. 이미지 로드, 일단 관심 (ROI)의 영역을 선택 ImageJ에 타원형 모양을 선택 도구를 사용 합니다.</li>
		<li>그 후, 분석 클릭 | 측정 형광 강도 그 투자 수익에 대 한 척도를. 이미지 당 4-5 다른 포커스 리소좀을 선택 하 고 각 지역 관심 (ROI)의 평균 상대 형광 강도 계산.</li>
		<li>각 이미지에 대 한 리소좀 사이 내장의 영역에 배경 형광 강도 측정 합니다. 배경 형광 강도 값을 lysosomal 형광 강도 값에서 뺍니다.</li>
		<li>총, 약 30 ~ 50 테스트할 각 변형에 대 한 cDCFDA 강도 (6 ~ 10 동물)에 대 한 개별 정규화 된 값을 수집 합니다. 이 값을 사용 하 여 적절 한 통계 소프트웨어를 사용 하 여 상자와 수염 음모를. 참고: 얼룩 달라질 수 있습니다 상당히 온도, 보육 시간 및 동물의 전반적인 건강/나이 같은 요인에 따라 형광 강도 비교 같은 얼룩 실험 샘플 프로세스 내에서 관련만 되도록. 그것은 따라서 모든 얼룩 실험에서 컨트롤을 처리 하는 것이 중요입니다. 통계적 차이 계산 (t-테스트) 어떤 적절 한 통계 소프트웨어를 사용 하 여.</li>
		<li>모든 이미지는 이미지 매개 변수를 변경 하지 않도록 주의 복용 순서로 (같은 날에 스테인드) 같은 실험에서 변종.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

노화, 세포 및 분자 이벤트의 다양 한 기여 생활사 특성 및 유전적 요인에 의해 영향을 받습니다. 우리의 최근 연구22 생식 주기 lysosomal pH 역학의 규제를 통해 소마의 피트 니스 조절에 중요 한 역할을 건의 한다. 우리는 동물에 산 성 리소좀 보장 v ATPase 전사의 upregulation에 의해 적극적으로 재현 하는 동안 그 중재 lysosomal 베이스 승진은 보여주었다. 복제, v ATPase 식 상품의 끝 리소...

단백질의 외관은 진 핵 세포1,2,3, 그리고 대형의 생각 된다 세포 노화4 의 원리 드라이버 중에 노화의 각 인 될 널리 허용 , 5 , 6 , 7. 나이, 세포로 단백질 놓을 장애인, 단백질 집계에 증가로 이어지는 성장 증거가 있다. 세포 노화에 베이스의 붕괴 autophagy8 프로테아좀 중재 단백질 저하9의 장애를 포함 한다. 마지막으로, 돌이킬 수 없는 단백질 산화 단백질 놓을10더 혼란, 오래 된 세포에서 증가 된다.
Autophagy 처음 손상 된 단백질의 대량 저하에 대 한 비 선택 과정이 될 생각 하지만 최근 연구 결과 그 autophagy는 단백질 집계 되지 않은 역 기능 세포의 놓을에 매우 선택적 표명 의무가 다른 단백질 정리 메커니즘11통해 저하. Autophagy 과정에서 손상 되 고 집계 된 단백질은 autophagosome 라는 이중 막 소포에 격리 됩니다. 이 autophagosome 다음 리소좀, 라는 산 성 세포와 autophagosome 화물12의 저하에 이르게 퓨즈. Lysosomes autophagic 통로의 끝점을 나타내는 고 막 수리, transcriptional 제어 및 영양소 감지; 같은 다른 세포질 과정에 참여 세포질 항상성 (참고 13에서 검토 한 결과)에 그들의 중앙된 역할을 강조 합니다. 여러 연구 lysosomal 함수에는 연령에 따라 감소와 다양 한 신경 장애13사이 연결 표시. 일관 되 게, 이전 셀에 lysosomal 기능을 복원 노화 관련 고기14,15의 발병을 지연 수 있습니다. Intralumen 환경 구성의 연구 이전 셀에 lysosomal 기능의 붕괴 lysosomal 프로 테아 제16의 생산에 있는 감소 때문에 하지는 것이 좋습니다. 또는, intralysosomal 산, 그것의 효소 활동의 중요 한 요구의 손실 리소좀 중재 베이스17드롭 기초 수 있습니다 제안 되었습니다. 이 가설을 찾아보기 수 있도록, 시 약 및 복제 하 고 일관 된 방식으로 라이브 셀에 lysosomal pH에서 동적인 변화를 조사 하는 프로토콜 개발에 필수적 이다.
C. 선 충 의 창 자 벌레에서 주요 대사 조직 이며 조직의 항상성 및 수명의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 우리는 변화를 평가 하기 위해 분석 실험 개발 어떻게 리소좀 중재 하는 베이스를 결정 하는 벌레의 장 리소좀의 루멘의 산 성도에 노화에 기여. PH에 민감한 fluorophores에서에서 사용 된 이전 C. 선 충 장 리소좀을 표시, 하지만 아직 lysosomal pH vivo에서18. 에 있는 작은 증가 감지할 수 있는 성공적인 프로토콜을 설정 하는 노력 되지 않았습니다. 여기, 우리 OP50 음식으로 pH에 민감한 fluorophore (cDCFDA)를 통합 하는 간단 하 고 편리한 먹이 프로토콜을 사용 하 여 C. 선 충 의 장 셀에 lysosomal 산 성도의 손실을 감지 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 제공 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1166">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:475px;">OP50 (E. coli)</td>
			<td style="width:188px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:385px;">Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">5(6)-carboxy-2&#8217;,7&#8217;-dichlorofluorescein diacetate&#160;</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">C369</td>
			<td>Commonly known as cDCFDA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:475px;">9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">L7528</td>
			<td>Commonly known as Lysotracker Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">ImageJ</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">LB Broth powder</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5306-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">NaCl</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Bacto Peptone</td>
			<td style="width:188px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S71604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Cholesterol powder</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3045&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">CaCl2</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">MgSO4</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">K3PO4</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">DMSO</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:188px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Cover Slips</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">3406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Agarose</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Incubator</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Mirror or other smooth flat surface</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing lysosomal alkalinization in the intestine of live caenorhabditis elegans

선 충 류 꼬마 선 충 (C. 선 충) 널리 장 수 및 발달 경로 연구 하는 데 사용 되는 모델 시스템입니다. 이러한 연구는 동물, 앞으로 고 역 유전자 분석, 붙일 레이블된 생성 단백질의 상대적 용이성 및 초기에 microinjected도 수 형광 염료의 사용 능력의 투명도 의해 촉진 된다 배아 세포 세포 (예 9-diethylamino-5 H-benzo (a) phenoxazine-5-1 및 (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-를 그것의 음식 (E. 콜라이 긴장 OP50)에 법인 또는 [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron)입니다. 여기, 선물이 장 리소좀 얼룩 형광 pH에 민감한 염료를 사용 하 여 라이브 벌레에 lysosomal 산에서 동적, 생리 적 변화를 영상 판독을 제공. 이 프로토콜 lysosomal pH를 측정 하지 않습니다 하지만 오히려 lysosomal 산 성도에 관련 된 생리 적 변화를 평가 하는 신뢰할 수 있는 방법을 설정 하는 것을 목표로. cDCFDA는 형광 fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) 가수분해 시 세포내 esterases 변환 되는 셀 permeant 화합물 이다. 리소좀 안에 Protonation cDCF 어디 축적이 세포에서 트랩 합니다. 4.8의 그것의 낮은 pKa 때문이 염료는 효 모에는 pH 센서로 사용 되었습니다. 여기에 장 리소좀의 산도 평가 하기 위해 음식 보충으로 cDCFDA 사용 하 여 설명 C. 선 충. 이 기술은 살아있는 동물, alkalinizing 리소좀의 검출에 대 한 허용 하 고 노화와 autophagy, lysosomal 속에 대 한 연구를 포함 하는 실험적인 응용 프로그램의 광범위 한 범위를 하고있다.

cDCFDA 얼룩 리소좀 pH 의존 방식에서 그리고 그것의 낮은 pKa와 리소좀에 준비 통풍 관은 이상적인 pH 센서21. cDCFDA 강도 얼룩은 lysosomal pH (즉 착 강도 증가 pH 감소도)18,22에 반비례 한다. cDCFDA 신호는 일관 되 게 약 20mm 클로로퀸, lysosomal 산성화의 억제제로 치료 하는 동물의 리소좀과 웜 v ATPase, 양성자 가져?...

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Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

C. 선 충 pH에 민감한 중요 한 염료 5 (6)-카-를 사용 하 여 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)의 소장에 lysosomal 산의 손실을 조사 하는 단계별 가이드

라이브 창 꼬마 선 충 에 Lysosomal Alkalinization 평가

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

5.9K 조회수.  University of Saskatchewan. C. 선 충 pH에 민감한 중요 한 염료 5 (6)-카-를 사용 하 여 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)의 소장에 lysosomal 산의 손실을 조사 하는 단계별 가이드

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

연구

발생학

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜<em&gt; Cre 호텔-LOX</em&gt; 마우스 모델

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em&gt; C. 엘레</em&gt; 생식선

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

라이브 창 꼬마 선 충 에 Lysosomal Alkalinization 평가

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