שיטות אלה משלבות ניתוח דימות רצף וזרימה של הדור הבא. זה יכול לעזור לענות על שאלות מעניינות, כמו אם כמה שינויים פנוטיפיים הם מעורבים, במקום transcriptome, במיוחד בסביבת החשיפה מזהמים. היתרון העיקרי של שיטה פשוטה זו עבורנו הוא שאנחנו יכולים להשתמש בו כדי למדוד את colocalization של חלבון חשוב ביולוגית, כדי לפרש את התוצאות של ביטוי גנים דיפרנציאלי מפתח ברמה תפקודית.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת אבחון של תוצאות פתולוגיות וטוקסיקולוגיות. כגישה תמונה נורמלית, לחזות יש את היכולת לחבר ביטוי גנים לתפקוד החלבון. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הדרישות הטכניות הגבוהות של ההדמיה והניתוח התמלולי.
כדי לרצף את ספריית התאים הדנדריטיים המופקת מהמונותה האנושית, טען תחילה את הרצף והאינדקס של הריגנטים על גבי הביוסינתזה הרציפה והאינדקס של מתלים רייגנטים, בהתאמה, והצב את המדפים באמבט מים בדרגת מעבדה למשך שעה אחת, עד שכל הקרח נמס, והריגנטים מעורבבים ביסודיות. בזמן שהרייגנטים מפשרים, הפעל את הרצף, חבר את המחשב לכונן רשת כאשר כונן אל תפלט מופיע וה הפעל את תוכנת בקרת הרצף. לאחר מכן, הוסיפו כ-100 מיליליטר של תוסף לשטיפת תחזוקה לכל אחד מהבקבוקים במתלה הריג'נטים של רצף הביוסינתזה, והברגו מכסה משפך על כל בקבוק.
הוסף כ 12 מיליליטר של פתרון לשטוף תחזוקה לכל צינור חרוט 15 מיליליטר בארון הריג'נט אינדקס, ולהשליך את הכובעים. לאחר מכן טען את שני המדפים על הרצף. בחר שטיפת תחזוקה בתוכנת בקרת הרצף ובצע את ההוראות לניקוי מערכת נוזלי הרצף.
השתמש בפנס כדי לבדוק באופן חזותי את תא הזרימה עבור בועות העוברות בנתיבים, כדי לוודא שאין דליפה. לאחר סיום רצף הכביסה, פתח את הכרטיסיה רצף והתחל הפעלה חדשה, כשהוא מכוון את נתוני הפלט לכונן רשת. העלה גיליון לדוגמה עבור demultiplexing והזן את מידע הריג'נט המתאים.
השתמש בתא זרימה משומש כדי להפוך את המערכת לראשית, עם רייגנטים רצף. לאחר השלמת יצירת האשכול, הסר את תא הזרימה. ותרסס קלות את התא במים.
נגב את תא הזרימה יבש עם נייר עדשה, ואחריו תרסיס אור עם 95% אתנול. לאחר ניגוב תא הזרימה יבש שוב, לבדוק את פני השטח של תא הזרימה נגד האור כדי לוודא שהוא נקי, ללא פסולת או שאריות מלח. בסיום השלב הראשי, טען את תא הזרימה המקובץ באשכולות והתחל ברצף.
תוכנת מציג ניתוח הרצף תופעל באופן אוטומטי. כ-26 שעות לאחר מכן, נטר את איכות נתוני הרצף באמצעות תוכנת בקרת הרצף הגבוהה, ותוכנות תצוגת ניתוח רצף כדי להעריך את איכות הנתונים, וכל פתרון בעיות. לאחר מכן, כאשר הרצף הוא סיים, לשנות את אטם תא זרימה, ולבצע לשטוף תחזוקה לפני תחילת הריצה הבאה.
לאחר הדמיה ציטומטרית זרימה של התאים הדנדריטיים החשופים למזהמים, פתח את ImageJ Fiji, ומזג את 100 תמונות התאים ה שנשמרו עבור קבוצות מדגמי התאים הדנדריטיים האנושיים שאינם חשופים ומזהמים לקבצים בודדים על פי קבוצת הטיפול. כדי לנתח את CD1d ואת Colocalization Lamp1 בתוך שתי האוכלוסיות, פתח את תמונת התא הממוזגת 100 שנחשפה למזהמים ובחר תמונה, צבע וערוצי פיצול כדי לפצל את התמונה לשתי תמונות בודדות באמצעות פלואורופור יחיד לכל ערוץ. ליצירת תרשים פיזור של הפיקסלים שעברו קולוקליזציה, בחרו 'נתח', 'קולוקליזציה' ו'סף קולוקליזציה' והקש 'הדפס מסך' לשמירת תרשים פיזור.
לחישוב מקדם הקולוקאליזציה של מנדר עבור כל תמונה חד-תאית, השתמשו בכלי הבחירה אליפסה לבחירת תמונה של תא בודד בקובץ התמונה עם הערוצים המפוצלים, ובחרו שוב 'נתח', 'קולוקליזציה' ו'סף קולוקליזציה'. לאחר מכן בחרו ערוץ 1 מתיבת הדו-שיח של אזור העניין ולחצו על הלחצן 'אשר'. כאשר המקדם חושב עבור כל 100 תמונות התאים, יבא את התוצאות לגיליון אלקטרוני מתאים וחזור על הניתוח עבור דגימת התא הלא חשופה של הפקד. באמצעות רצף RNA וניתוחי נתונים תמלוליים, מספר אשכולות גנים גדולים שהשתנו, כולל חילוף החומרים של השומנים ופונקציות אנדוציטיות זוהו במקרי ה- DCs החשופים למזהמים.
ברמת תמונת התא הבודדת, תאים דנדריטיים חיוביים של HLADR CD11c יכולים להיות מגודרים, על פי הדיכוי הדו-קומתי CD1d ו- Lamp1 שלהם. תאים דנדריטיים שאינם חשופים לשליטה מדגימים קולוקליזציה מינימלית של חלבון CD1d ו- Lamp1, המציינת רמה בסיסית של סחר אנדוציטי CD1D, ורמה גבוהה של ביטוי פני השטח בתנאים פיזיולוגיים. בעוד CD1d נשמר בתאים האנדוקטיים המאוחרים של תאים דנדריטיים חשופים מזהמים, המאשר פרופילי גנים אנדוציטיים שהשתנו באוכלוסיית תאים ניסיונית זו.
לאחר מיזוג התמונות הסלולריות הבודדות לקובץ תמונה יחיד, ניתן לפצל את התמונות הבודדות בהתאם לביטוי הפלואורופור שלהן, ו ניתן לדמיין את הקולוקליזציה של עוצמת הפיקסל בין שני הערוצים בעלילת פיזור. לאחר מכן ניתן לכמת את מידת הקולוקליזציה בין החלבונים CD1d ו- Lamp1 בשתי קבוצות הטיפול באמצעות מקדמי מנדר. אם עוצמת החלבון היא הטרוגנית בין האזורים colocalized ולא colocalized, עוצמת colocalized לא יהיה מקביל לאזורים colocalized, ולכן חשוב גם להעריך עוד יותר את colocalization של שני חלבונים, בהתבסס על עוצמת הפיקסל.
לאחר השליטה, ניתן להשלים את ניתוח התמונה תוך שעתיים, ואת ההתקנה רצף RNA ניתן להשלים בתוך שלוש שעות, אם כל טכניקה מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי כל reagents נטענים כראוי בעמדות הנכונות, כי אין דליפה ברצף. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות, כמו מיקרו RNA, exome, או רצף תא התורן יכול להתבצע כדי לענות על שאלות נוספות על ביטוי מיקרו RNA גלובלי, מוטציה בגנים, או מתילציה DNA, בהתאמה.
אז אחרי ההתפתחות שלה, טכניקה זו תסייע לחוקרים בתחום ניתוח ההדמיה התאית, ואת רצף הדור הבא כדי לחקור את ההשפעה של המזהם הסביבתי על ביטוי גנים ותפקוד החלבון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להגדיר את רצף הדור הבא, ואת ניתוח imager של קולוקליזציה חלבון. אל תשכח שעבודה עם כימיקלים מזהמים רעילים בדגימות דם אנושיות יכולה להיות מסוכנת ביותר.
אמצעי זהירות כגון שימוש ברדס אדים כימיים, וציוד מגן אישי, תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליכים אלה.
