שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום של אינטראקציות מארח פתוגן כגון מה הם המאפיינים הייחודיים של תאים נגועים באופן פרודוקטיבי, מה קופקטורים מארחים לאפשר וירוסים להקים זיהום פרודוקטיבי, וכיצד למקד תאים אלה בהתערבויות טיפוליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת אמצעים כמותיים הן לחלבון והן ל- mRNA בתוך תאים בודדים, ורוב הריוגנטים זמינים מסחרית. הדגמת הליך מיון התאים תהיה מתיו קריגן, טכנאי בכיר מעולם ציטומיית הזרימה במעבדה של ד"ר מייקל אלר.
כדי להתחיל, בתחנת עבודה ייעודית לביולוגיה מולקולרית לפני PCR, הכינו את תערובת המבחנה על ידי שילוב של 96 בדיקות ביטוי גנים לתוך RNase, הצינור החופשי DNase הקפד להוסיף כל בדיקה לריכוז סופי של 180 ננומולרים של פריימרים קדימה ואחורי. הוסף מאגר השעיית DNA כדי להשיג את הדילול המתאים של תערובת הבדיקות. עבור כל צפוי 96 על ידי 96 מערך שבבים, פיפטה שישה microliters של כל בדיקה לתוך באר ייעודית של צלחת PCR 96 היטב, ולאחר מכן לאטום את הצלחת עם דבק.
כדי להתחיל כתם פני השטח תאים קיימא, ב ארון biosafety תרבות הרקמה, תחילה להכין את דגימות הפיצוי ותערובת הורים של קוקטייל נוגדנים פלואורסצנטי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. להפשיר את התאים cryopreserved באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. לאחר מכן, להוסיף בין 5 לשני מיליליטר של ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר המכיל 12 מיליליטר של PBS.
צנטריפוגה ב 500 G במשך שלוש דקות ב 25 מעלות צלזיוס, ואז שאף PBS ולתלות את גלולה בשלושה מיליליטר של PBS טרי. מעבירים את התערובת לצינור פוליסטירן חמישה מיליליטר. צנטריפוגה שוב ב 500 G במשך שלוש דקות ב 25 מעלות צלזיוס.
שאף את העל-טבעי, והותיר כ-10 מיקרוליטרים המתגוררים ב-PBS. לאחר מכן, יש להשתמש מחדש ב-20 מיליון תאים שטופים ב-80 מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים. דגירה במשך 20 דקות ב 25 מעלות צלזיוס בעוד מוגן מפני אור.
לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של PBS. צנטריפוגה ב 500 G במשך שלוש דקות ושואפים את supernatant. ביסודיות resuspend התאים ב 300 כדי 500 microliters של PBS.
סנן פתרון זה על-ידי צינורות אותו דרך כובע 35 מיקרומטר ניילון תא-מסננת. ואז לשמור על התאים על קרח מוגן מפני אור עד למיון. בחזרה בתחנת העבודה שלפני PCR, הכינו תחילה את תערובת התגובות של RT preAMP בצינור סטרילי אחד של RNase, DNase בחינם כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.
באמצעות פיפטה רב ערוצית, לוותר על 10 microliters של תגובה זו לערבב לתוך המספר הרצוי של 96 גם PCR מיון צלחות איסוף. לאטום את הצלחת עם סרט דבק ולאחר מכן למקם את הצלחת על בלוק אלומיניום 96 היטב מקורר מראש. לאחר מכן, צור את ערכת המיון התאים והכן את סדרן התאים הציטומטרי של הזרימה כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
הזן את הגדרות הכלים המתאימות כדי לציין את המספר ואת קבוצת המשנה של התאים שיש למיין לתוך כל באר. הסר את החותם דבק, ולאחר מכן FACS למיין את התאים לתוך מוכן 96 גם לוחות איסוף PCR. סותמים מחדש את הצלחת עם סרט דבק טרי.
מיד מערבולת צלחת חותם מחדש ולאחר מכן צנטריפוגה ב 2000 G במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. Thermocycle את הצלחת במכונת PCR עם מכסה שחומם מראש ב 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ואחריו 95 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. לבסוף, תרמוצ'יצ'ל עבור 18 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס במשך ארבע דקות, ולאחר מכן בתחנת עבודה שלאחר PCR, להעביר חמישה microliters של cDNA לתוך 20 microliters של חיץ ההשעיה DNA בצלחת חדשה 96 גם PCR.
כדי להתחיל, להכין את צלחת הבדיקה qPCR על ידי צינור ארבעה microliters של reagent הטעינה בדיקה בכל באר. לאחר מכן, להעביר ארבעה microliters של כל בדיקה מצלחת בדיקה 2X לצלחת qPCR. שמור על צלחת ההתמדה של qPCR בארבע מעלות צלזיוס.
מחלקים את נוזלי קו הבקרה מהמזרקים לתוך שני שסתומי הצריכה של השבב. מוציאים את הפלסטיק המגן מתחת לצלחת. מקם את השבב על בקר IFC עם הצד הנוון במיקום A1 ולאחר מכן בחר והפעל את קובץ ה- Script הראשי.
עבור כל שבב microfluidic, לערבב 50 microliters של ריאגנט טעינת מדגם עם 500 microliters של תערובת מאסטר PCR כדי להכין את תערובת התגובה בזמן אמת. פיפטה 4.4 microliters של תגובה זו לערבב לתוך כל באר של צלחת PCR חדשה 96 היטב עכשיו מיועד כצלחת המדגם. לאחר מכן, פיפטה 3.6 microliters של cDNA מדולל בעבר לתוך כל באר של צלחת המדגם.
לאחר מכן, להעביר חמישה microliters מצלחת ההתדגם ל באר המתאימה בצד חריץ של השבב. מעבירים חמישה מיקרוליטרים מצלחת הדגימה לתוך באר המתאימה בצד השני של השבב. הכנס את השבב שנטען לבקר IFC והפעל את קובץ ה- Script של ערבוב העומס.
לאחר מכן, העבר את השבב לפלטפורמת BioMark והגדר את המכשיר כמפורט בפרוטוקול הטקסט ולאחר מכן שמור את קובץ הפעלת השבב בתיקיה ייעודית. לאחר השלמת הפעלת השבב, פתח את תוכנת ניתוח PCR בזמן אמת ולאחר מכן בחר קובץ, פתח, כדי לפתוח את chiprun. קובץ bml.
בפינה השמאלית העליונה של חלון התוכנה, אתר את סייר השבבים ואת סיכום הפעלת השבבים. תחת סיכום הפעלת שבב, לחץ על הגדרת גלאי. תחת פעילות, לחץ על חדש ובחר את לוחית SBS של סוג הגורם המכיל ותבנית הגורם המכיל SBS 96.
לחץ על הכפתור עם שלוש הנקודות לצד מיפוי ולאחר מכן בחר M96-Assay-SBS96.dsp. לחץ על תצוגות ניתוח. בכרטיסיה qPCR תחת משימה, בחר תיקון בסיסי עבור נגזרת ליניארית ושיטת סף CT עבור גלאי משתמשים.
בכרטיסיה ספי CT, סמן את התיבה אתחל באמצעות אוטומטי ולאחר מכן לחץ על לחצן נתח. ברביע הימני העליון של תצוגות ניתוח, לחץ על הכרטיסיה השניה, טבלת תוצאות. מהתפריט הנפתח, בחר תצוגת מפת חום ומפת החום עם הנתונים תופיע.
תחת מפת החום, לחץ על סף וגרף יומן רישום. התאם את סף ה- CT באופן ידני עבור כל גלאי על-ידי לחיצה על בדיקות, המיוצגות על-ידי עמודות במפת החום וגרירת הסף לפי הצורך כדי להדק את עקומות ההגברה בשלב המעריכי. כשתסיים, לחץ על נתח.
לאחר מכן, יצא את נתוני qPCR כקובץ csv. העבר נתוני qPCR ממחשב BioMark לשולחן העבודה שלך. יבא את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני או תוכנת ניתוח סטטיסטי ומפה את התוצאות לפי עמדות מדגם והסתערות על השבב.
צור עמודה חדשה ולהשתמש בנוסחה מותנית כדי לארגן את התאים לקבוצות המבוססות על ביטוי של גנים ויראליים. תחת ניתוח, בחר התאם Y לפי X והתווית ביטוי גנים לעומת קבוצה. לאחר מכן, השתמש ב- FlowJo גירסה 9 כדי לפתוח קבצי FCS ממיון FACS התואם לצלחת באר 96.
כאשר שם הקובץ מסומן, בחר פלטפורמה, שער מספר אירוע וצור שערי מיון הכלולים באינדקס. תאים בודדים יופיעו מוצגים לפי שורה. סמן את כל 96 התאים ולאחר מכן בחר סביבת עבודה, יצא, בחר את כל הקומות המפוצות.
תחת נתונים, בחר קובץ FCS, לחץ על ייצוא ובחר תיקיה ייעודית. גרור את קבצי FCS החדשים עבור תאים בודדים לסביבת עבודה חדשה של FlowJo. סמן את כל התאים ולחץ על הוסף סטטיסטיקה, המיוצגת על-ידי לחצן סיגמא, ממוצע וכל הפרמטרים הפלואורסצנטיים.
פתח את עורך הטבלה ולאחר מכן סמן את כל הקומות של התא הראשון וגרור אותן לחלון עורך הטבלה. בחלון זה, לחץ על צור והצג טבלה. לאחר מכן, העתק ופלט לתוכנה סטטיסטית על-ידי הדבקת העתקה או על-ידי לחיצה על לחצן שמור וה הפעל יישום.
מזג את נתוני FACS של תא יחיד עם נתוני qPCR ב- JMP לפי מספר הלוחית ומיקום הבאר. לבסוף, בצע ניתוחים גרפיים וסטטיסטיים על הנתונים המשולבים. במחקר זה, כימות חלבון פני השטח של תא יחיד על ידי ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים משולב עם ביטוי mRNA כמותי של תא יחיד על ידי RTqPCR מרובה מאוד.
מוצג כאן ביטוי גנים ויראלי כמותי תא יחיד מתא FACS ממוין רזוס מאקי CD4 חיובי T תאים. Tat /rev חיובי N של תאים שליליים לבטא פחות עותקים של tat / rev RNA מאשר N של תאים חיוביים בירוק כהה אשר עולה בקנה אחד עם שלב מוקדם של זיהום לפני התייצבות וייצוא גרעיני של RNA ויראלי שותק חלקית. שפע גבוה של Gag-RNA unspliced ב tat / rev חיובי N של תאים חיוביים עולה בקנה אחד עם זיהום פרודוקטיבי בשלב מאוחר שבמהלכו RNA גנומי בשפע מתבטא ונארז לתוך ניצנים virions.
עלילה זו trivariate המציג את הגן ויראלי תא יחיד, גן מארח, ביטוי חלבון משטח המארח מראה כי ביטוי חלבון CD4 ו- CD3 פני השטח הוא ירד תאים חיוביים tat / rev המוצגים בירוק למרות CD4 ו CD3 תעתיקים מתמשכים. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות ביומיים עד שלושה ימים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לבצע הערכה prototranscriptional תא יחיד ממוקד כדי לענות על שאלות הנוגעות גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי וחלבונים בתאים נגועים ויראלי.
