يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التفاعلات التي تتم بين المضيفين والأمراض مثل ما هي الخصائص الفريدة للخلايا المصابة بشكل منتج، وما تسمح العوامل المساعدة المضيفة للفيروسات بإنشاء عدوى منتجة، وكيفية استهداف هذه الخلايا في التدخلات العلاجية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر مقاييس كمية لكل من البروتين والميرنا داخل الخلايا المفردة، ومعظم الكواشف متاحة تجاريا. إثبات إجراء فرز الخلايا سيكون ماثيو كريغان، وهو فني كبير من جوهر تدفق الخلايا في مختبر الطبيب مايكل إيلر.
للبدء ، في محطة عمل البيولوجيا الجزيئية قبل PCR المعينة ، وإعداد مزيج من الفحص من خلال الجمع بين 96 مُجراً في 96 مُجرّيات التعبير الجيني في RNase ، أنبوب حر DNase مع التأكد من إضافة كل مقايسة إلى تركيز نهائي من 180 نانوموللار من البهائم الأمامية والالعكسية. إضافة العازلة تعليق الحمض النووي لتحقيق التخفيف المناسب من مزيج المقايسة. لكل من المتوقع 96 من 96 رقاقة مجموعة، ماص ستة ميكرولترات من كل مقايسة في بئر معين من 96 بئر لوحة PCR، ثم ختم لوحة مع لاصقة.
لبدء السطح تلطيخ الخلايا القابلة للحياة، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ثقافة الأنسجة، أولا إعداد عينات التعويض ومزيج رئيسي من كوكتيل الأجسام المضادة الفلورية كما هو مبين في بروتوكول النص. اذيب الخلايا المبردة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. بعد ذلك، إضافة بين 5 واثنين ملليلتر من تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على 12 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
جهاز طرد مركزي في 500 G لمدة ثلاث دقائق في 25 درجة مئوية، ثم الpirate برنامج تلفزيوني وإعادة تثبيت بيليه في ثلاثة ملليلترات من برنامج تلفزيوني جديد. نقل هذا الخليط إلى أنبوب البوليسترين 5 ملليلتر. مرة أخرى في جهاز طرد مركزي 500 G لمدة ثلاث دقائق في 25 درجة مئوية.
استلهمت المُتطّع، تاركةً ما يقرب من 10 ميكروليترز متبقية من برنامج تلفزيوني. بعد ذلك، إعادة تعليق ما يصل إلى 20 مليون خلية مغسولة في 80 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة. احتضان لمدة 20 دقيقة في 25 درجة مئوية في حين محمية من الضوء.
بعد هذا، إضافة ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. جهاز طرد مركزي في 500 G لمدة ثلاث دقائق ويتبخر المابير. إعادة اعتماد الخلايا بدقة في 300 إلى 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.
تصفية هذا الحل عن طريق الأنابيب من خلال 35 ميكرومتر مصفاة خلية النايلون. ثم إبقاء الخلايا على الجليد ومحمية من الضوء حتى الفرز. مرة أخرى في محطة العمل قبل PCR، أولاً إعداد مزيج رد فعل PREAMP RT في RNase واحد، DNase أنبوب عقيم الحرة كما هو مبين في بروتوكول النص.
باستخدام ماصة متعددة القنوات، الاستغناء 10 ميكرولترات من هذا المزيج التفاعل في العدد المطلوب من 96 جيدا لوحات فرز PCR. ختم لوحة مع فيلم لاصق ومن ثم وضع لوحة على كتلة 96 الألومنيوم ما قبل المبردة جيدا. بعد ذلك، تأسيس نظام جسور فرز الخلايا وإعداد تدفق فرز الخلايا الخلوية كما هو موضح في بروتوكول النص.
أدخل إعدادات الأداة المناسبة لتحديد عدد الخلايا التي سيتم فرزها في كل بئر وفرزها. إزالة الختم لاصق، ثم FACS فرز الخلايا في لوحات مجموعة PCR 96 جيدا أعدت. إعادة التصاق لوحة مع فيلم لاصقة جديدة.
فورًا، دوامة اللوحة التي أعيد طلاؤها، ثم جهاز الطرد المركزي على 2000 جيجا لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. ثيرموسيت لوحة في جهاز PCR مع غطاء محمّى مسبقاً في 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تليها 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين. وأخيرا، الحرارية لمدة 18 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة أربع دقائق، ثم في محطة عمل ما بعد PCR، ونقل خمسة ميكرولترات من cDNA إلى 20 ميكرولترات من الحمض النووي العازلة تعليق في لوحة جديدة 96 جيدا PCR.
للبدء، إعداد لوحة المقايسة qPCR عن طريق الأنابيب أربعة microliters من كاشف تحميل المقايسة في كل بئر. بعد ذلك، قم بنقل أربعة ميكروليترات من كل مقايسة من لوحة المقايسة 2X إلى لوحة qPCR. الحفاظ على لوحة المقايسة qPCR عند أربع درجات مئوية.
الاستغناء عن سوائل خط التحكم من الحقن فتيلة في صمامات المداهمة اثنين من رقاقة. إزالة البلاستيك واقية من تحت لوحة. ضع الرقاقة على وحدة تحكم مؤسسة التمويل الدولية مع الجانب المُرقم في موضع A1، ثم حدد البرنامج النصي الرئيسي وتشغيله.
لكل رقاقة microfluidic، مزيج 50 ميكرولترات من كاشف تحميل العينة مع 500 ميكرولترات من مزيج ماجستير PCR لإعداد مزيج رد الفعل في الوقت الحقيقي. Pipette 4.4 ميكرولترات من هذا المزيج رد فعل في كل بئر من جديد 96 جيدا لوحة PCR المعينة الآن كلوحة عينة. المقبل، ماصة 3.6 ميكرولترات من cDNA المخفف سابقا في كل بئر من لوحة العينة.
بعد هذا، نقل خمسة ميكرولترات من لوحة المقايسة إلى بئر المقابلة على الجانب من رقاقة. نقل خمسة ميكروليتر من لوحة العينة إلى البئر المقابلة على الجانب الآخر من الشريحة. إدراج رقاقة تحميل في وحدة تحكم مؤسسة التمويل الدولية وتشغيل البرنامج النصي مزيج تحميل.
بعد ذلك ، قم بنقل الشريحة إلى منصة BioMark وقم بإعداد الأداة كما هو موضح في بروتوكول النص ، ثم احفظ ملف تشغيل الشريحة في مجلد معين. عند اكتمال تشغيل رقاقة، فتح في الوقت الحقيقي PCR تحليل البرمجيات ثم حدد الملف، فتح، لفتح chiprun. bml الملف.
في الزاوية اليسرى العليا من نافذة البرنامج، حدد موقع مستكشف الرقاقة وملخص تشغيل الشريحة. تحت ملخص تشغيل رقاقة، انقر على إعداد كاشف. ضمن المهمة، انقر فوق جديد وحدد نوع حاوية SBS لوحة و حاوية تنسيق SBS 96.
انقر على الزر مع علامة القطع بجانب التعيين، ثم حدد M96-Assay-SBS96.dsp. انقر على طرق عرض التحليل. في علامة التبويب qPCR تحت المهمة، حدد تصحيح خط الأساس للأسلوب المشتق الخطي وعتبة CT للكشف عن المستخدم.
في علامة التبويب عتبات CT، تحقق من تهيئة مع تلقائي ثم انقر فوق الزر تحليل. في الربع الأيمن العلوي من طرق عرض التحليل، انقر على علامة التبويب الثانية، جدول النتائج. من القائمة المنسدلة، حدد عرض الخريطة الحرارية وستظهر الخريطة الحرارية مع البيانات.
تحت خريطة الحرارة، انقر فوق الرسم البياني العتبة وسجل. اضبط عتبات التصوير المقطعي يدوياً لكل كاشف بالنقر على المقايسات، التي تمثلها الأعمدة على الخريطة الحرارية، وسحب العتبة حسب الضرورة لتتقاطع مع منحنيات التضخيم في المرحلة الأسية. عند الانتهاء، انقر فوق تحليل.
بعد ذلك، قم بتصدير بيانات qPCR كملف csv. نقل بيانات qPCR من الكمبيوتر BioMark إلى سطح المكتب الخاص بك. استيراد البيانات إلى جدول بيانات أو برنامج تحليل إحصائي وخريطة النتائج حسب العينة ومواضع الفحص على الشريحة.
إنشاء عمود جديد واستخدام صيغة شرطية لتنظيم الخلايا في مجموعات على أساس التعبير عن الجينات الفيروسية. تحت التحليل، حدد احتواء Y بواسطة X و رسم التعبير الجيني مقابل المجموعة. بعد ذلك، استخدم FlowJo الإصدار 9 لفتح FCS الملفات من FACS الفرز المقابلة للوحة 96 جيدا.
مع تمييز اسم الملف، حدد النظام الأساسي، بوابة رقم الحدث، وقم بإنشاء بوابات فرز مفهرسة. ستظهر الخلايا الفردية معروضة بالصف. تسليط الضوء على جميع الخلايا 96 ثم حدد مساحة العمل ، والتصدير ، حدد جميع الطوابق التعويض.
ضمن البيانات، حدد ملف FCS، وانقر فوق تصدير، وحدد مجلد معين. اسحب ملفات FCS الجديدة للخلايا الفردية إلى مساحة عمل FlowJo جديدة. تمييز كافة الخلايا وانقر فوق إضافة إحصائيات، ممثلة بزر سيجما، ومتوسط، وجميع معلمات الفلوريسنس.
افتح محرر الجدول، ثم قم بتمييز كافة طوابق الخلية الأولى واسحبها إلى نافذة محرر الجدول. في هذا الإطار، انقر فوق إنشاء وعرض الجدول. بعد ذلك، نسخ وإخراج في برنامج إحصائي إما عن طريق نسخ اللصق أو عن طريق النقر على زر حفظ وبدء التطبيق.
دمج بيانات FACS الخلية الواحدة مع بيانات qPCR في JMP من خلال رقم اللوحة ووضع البئر. وأخيرا، قم بإجراء تحليلات رسومية وإحصائية على البيانات المجمعة. في هذه الدراسة، تتكامل كمية بروتين سطح الخلية المفردة بواسطة قياس تدفق متعدد المعلمة مع تعبير مرنا أحادي الخلية الكمي بواسطة RTqPCR متعدد للغاية.
يظهر هنا هو وحيد خلية كمية التعبير الجيني الفيروسي من FACS فرز ريسوس المكاك CD4 الخلايا T إيجابية. تات / rev إيجابية N من الخلايا السلبية التعبير عن نسخ أقل من تات / ريف الجيش الملكي النيبالي من N من الخلايا الإيجابية في الأخضر الداكن الذي يتفق مع مرحلة مبكرة من العدوى قبل تحقيق الاستقرار وتصدير النووية من الحمض النووي الريبي الفيروسية جزئيا. وهناك وفرة عالية من هغ-RNA غير مُبجَّه في تات/ ريف إيجابية N من الخلايا الإيجابية يتسق مع مرحلة متأخرة من العدوى المنتجة التي يتم خلالها التعبير عن الحمض النووي الريبي الجينومي وفيرة وتعبئتها في فيرة في مهدها.
هذه المؤامرة ثلاثي المتغيرات عرض الجين الفيروسي خلية واحدة، الجينات المضيفة، ومضيف تعبير البروتين السطح يظهر أن سطح CD4 و CD3 بروتين التعبير انخفض في تات / ريف الخلايا الإيجابية المعروضة باللون الأخضر على الرغم من CD4 وD3 يتم الحفاظ على النصوص. مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الأسلوب في يومين إلى ثلاثة أيام. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ تقييم بروتونسكريونيونية خلية واحدة مستهدفة لمعالجة الأسئلة المتعلقة الجينات والبروتينات التي أعرب عنها بشكل تفاضلي في الخلايا المصابة بالفيروس.
