이 방법은 생산적으로 감염된 세포의 독특한 특성이 무엇인지, 호스트 보조 인자가 바이러스가 생산적인 감염을 확립할 수 있도록 허용하는 것과 같은 호스트 병원체 상호 작용 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있으며 치료 내정간섭에서 이러한 세포를 표적으로 하는 방법. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포 내에서 단백질과 mRNA 모두에 대한 정량적 측정을 제공하고 대부분의 시약이 시판된다는 것입니다. 세포 선별 절차를 보여주는 것은 닥터 마이클 엘러의 실험실에 있는 유동 세포측정 코어에서 수석 기술자 매튜 Creegan, 일 것입니다.
우선, 지정된 사전 PCR 분자 생물학 워크스테이션에서 96개의 유전자 발현 분석제를 RNase, DNase 프리 튜브에 결합하여 분석 믹스를 준비하여 각 분석기를 180 나노몰라의 최종 농도에 추가하여 전방 및 역 프라이머의 최종 농도를 추가합니다. DNA 서스펜션 버퍼를 추가하여 분석 믹스의 적절한 희석을 달성한다. 96칩 어레이로 예상되는 각 96의 마이크로리터에 대해 각 분석의 6마이크로리터를 96개의 잘 PCR 플레이트의 지정된 웰에 넣은 다음 접착제로 플레이트를 밀봉합니다.
표면 염색 가능한 세포를 시작하려면, 조직 배양 생물 안전 캐비닛에서, 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 보상 샘플과 형광 항체 칵테일의 마스터 믹스를 준비한다. 냉동 보존 된 세포를 섭씨 37도 의 수조에서 2 분 동안 해동하십시오. 그 후, PBS의 12 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브에 세포 현탁액의 5 그리고 2 밀리리터 사이를 추가합니다.
500G의 원심분리기는 섭씨 25도에서 3분 동안 PBS를 흡입한 다음 신선한 PBS 3밀리리터로 펠릿을 재차 놓습니다. 이 혼합물을 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 옮킨다. 원심분리기는 섭씨 25도에서 3분 동안 500G로 다시 한 번 원심분리기.
슈퍼나탈자를 흡인하여 약 10개의 마이크로리터 잔류 PBS를 남깁니다. 다음으로, 항체 칵테일 80 마이크로리터에서 최대 2천만 개의 세척 된 세포를 다시 중단하십시오. 빛으로부터 보호하면서 섭씨 25도에서 20분 동안 배양하십시오.
그 후 PBS의 3 밀리리터를 추가합니다. 500 G의 원심분리기는 3분 동안 슈퍼나탈것을 흡인시합니다. PBS의 300에서 500 마이크로 리터에서 세포를 철저히 재중단합니다.
35 마이크로미터 나일론 셀 스트레이너 캡을 통해 파이프팅하여 이 솔루션을 필터링합니다. 그런 다음 세포를 얼음 위에 보관하고 종류까지 빛으로부터 보호합니다. 다시 사전 PCR 워크 스테이션에서, 먼저 텍스트 프로토콜에 설명 된 대로 단일 RNase, DNase 무료 멸균 튜브에 RT preAMP 반응 믹스를 준비합니다.
멀티채널 파이펫을 사용하여 이 반응의 10마이크로리터를 원하는 96개의 PCR 정렬 컬렉션 플레이트로 분배합니다. 접착제 필름으로 접시를 밀봉한 다음 미리 냉각된 96 개의 알루미늄 블록에 접시를 놓습니다. 그런 다음 셀 정렬 게이팅 체계를 설정하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유동 세포 식 세포 선별기를 준비합니다.
적절한 계측기 설정을 입력하여 각 웰로 정렬할 셀의 수와 하위 집합을 지정합니다. 접착제 씰을 제거한 다음 FACS는 셀을 준비된 96 개의 잘 PCR 수집 플레이트로 정렬합니다. 신선한 접착제 필름으로 접시를 다시 밀봉합니다.
즉시 다시 밀봉 된 플레이트와 원심 분리기를 섭씨 4도에서 1 분 동안 2000 G에서 소용돌이합니다. PCR 기계의 온도 순환은 15분 동안 섭씨 50도에서 예열된 뚜껑을 한 다음 2분 동안 섭씨 95도입니다. 마지막으로, 18사이클동안 섭씨 95도95°C의 15°C를 4분 동안 15초, 섭씨 60도, PCR 이후 워크스테이션에서 새로운 96웰 PCR 플레이트에서 DNA 서스펜션 버퍼 20마이크로리터로 5마이크로리터를 전송합니다.
시작하려면 각 웰에 분석 로딩 시약 4 개의 마이크로 리터를 파이프하여 qPCR 분석 플레이트를 준비하십시오. 다음으로, 각 분석기의 4개의 마이크로리터를 2X 분석 플레이트에서 qPCR 플레이트로 옮기. qPCR 분석판을 섭씨 4도에서 유지합니다.
프림 프림 주사기에서 제어 라인 유체를 칩의 두 개 내포 밸브에 분배합니다. 접시 아래에서 보호 플라스틱을 제거합니다. A1 위치에 노치 측이 있는 IFC 컨트롤러에 칩을 배치한 다음 프라임 스크립트를 선택하고 실행합니다.
각 미세 유체 칩에 대해, 실시간 반응 믹스를 준비하기 위해 500 마이크로 리터의 PCR 마스터 믹스와 샘플 로딩 시약의 50 마이크로 리터를 혼합. 이 반응의 파이펫 4.4 마이크로리터는 이제 샘플 플레이트로 지정된 새로운 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 혼합됩니다. 다음으로, 이전에 희석된 cDNA의 파이펫 3.6 마이크로리터가 샘플 플레이트의 모든 우물로 들어갑니다.
그 후, 분석 플레이트에서 칩의 노치 측에 해당하는 우물으로 5개의 마이크로리터를 옮길 수 있습니다. 샘플 플레이트에서 5개의 마이크로리터를 칩의 반대편에 있는 해당 우물로 옮기. 로드된 칩을 IFC 컨트롤러에 삽입하고 로드 믹스 스크립트를 실행합니다.
그런 다음 칩을 BioMark 플랫폼으로 전송하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 계측기를 설정한 다음 지정된 폴더에 칩 실행 파일을 저장합니다. 칩 실행이 완료되면 실시간 PCR 분석 소프트웨어를 열고 파일을 열고 열어 칩런을 엽니다. bml 파일.
소프트웨어 창의 왼쪽 위 모서리에 칩 탐색기및 칩 실행 요약을 찾습니다. 칩 실행 요약에서 검출기 설정을 클릭합니다. 작업에서 새 를 클릭하고 컨테이너 유형 SBS 플레이트 및 컨테이너 형식 SBS 96을 선택합니다.
매핑 옆에 있는 타원이 있는 버튼을 클릭한 다음 M96-Assay-SBS96.dsp를 선택합니다. 분석 보기를 클릭합니다. 작업 아래 qPCR 탭에서 사용자 감지기에 대한 선형 유도체 및 CT 임계값 메서드에 대한 기준 수정을 선택합니다.
CT 임계값 탭에서 자동 상자로 초기화를 확인한 다음 분석 단추를 클릭합니다. 분석 뷰의 오른쪽 상단 사분면에서 두 번째 탭인 결과 테이블을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 열맵 보기를 선택하고 데이터가 있는 열지도가 나타납니다.
히트 맵 아래에서 임계값및 로그 그래프를 클릭합니다. 열지도의 열로 표시된 assays를 클릭하고 필요에 따라 임계값을 드래그하여 각 검출기에 대해 CT 임계값을 수동으로 조정하여 지수 단계의 증폭 곡선을 교차합니다. 완료되면 분석을 클릭합니다.
다음으로 qPCR 데이터를 csv 파일로 내보냅니다. BioMark 컴퓨터에서 바탕 화면으로 qPCR 데이터를 전송합니다. 데이터를 스프레드시트 또는 통계 분석 소프트웨어로 가져오고 칩의 샘플 및 분석 위치로 결과를 매핑합니다.
새로운 컬럼을 만들고 조건부 포뮬러를 사용하여 바이러스 유전자의 발현에 기초하여 세포를 그룹으로 구성합니다. 분석에서 X별로 맞는 Y를 선택하고 유전자 발현대 그룹을 플롯합니다. 그런 다음 FlowJo 버전 9을 사용하여 96 웰 플레이트에 해당하는 FACS 정렬에서 FCS 파일을 엽니다.
파일 이름이 강조 표시되면 플랫폼, 이벤트 번호 게이트를 선택하고 인덱싱된 정렬 게이트를 만듭니다. 개별 셀이 행별로 표시됩니다. 모든 96 개의 셀을 강조 표시 한 다음 작업 영역을 선택하고 내보내고 보상 된 모든 바닥을 선택합니다.
데이터에서 FCS 파일을 선택하고 내보내기를 클릭하고 지정된 폴더를 선택합니다. 개별 셀에 대한 새 FCS 파일을 새 FlowJo 작업 공간으로 드래그합니다. 모든 셀을 강조 표시하고 시그마 버튼, 평균 및 모든 형광 매개 변수로 표시되는 통계를 추가합니다.
테이블 편집기를 열고 첫 번째 셀의 모든 바닥을 강조 표시하고 테이블 편집기 창으로 드래그합니다. 이 창에서 테이블 만들기 및 보기를 클릭합니다. 그런 다음 복사 붙여넣기또는 저장 및 시작 응용 프로그램 단추를 클릭하여 통계 소프트웨어에 복사하고 출력합니다.
단일 셀 FACS 데이터를 JMP의 qPCR 데이터와 플레이트 번호 및 위치별로 병합합니다. 마지막으로 결합된 데이터에 대한 그래픽 및 통계 분석을 수행합니다. 본 연구에서, 다중 파라미터 유량 세포측정에 의한 단세포 표면 단백질 수량은 고다중 멀티플렉스 RTqPCR에 의한 정량적인 단세포 mRNA 발현과 통합된다.
여기에 도시된 단세포 정량적 바이러스 유전자 발현은 Rhesus 마카크 CD4 양성 T 세포를 분류하였다. 부정적인 세포의 Tat/rev 양성 N은 안정화 전에 감염의 초기 단계와 부분적으로 접합된 바이러스성 RNA의 핵 수출과 일치하는 어두운 녹색에 있는 양성 세포의 N 보다는 tat/rev RNA의 더 적은 사본을 표현합니다. 양성 세포의 타/레브 양성 N에 있는 접합되지 않은 개그 RNA의 높은 풍부는 풍부한 게놈 RNA가 발현되고 신진 비온으로 포장되는 동안 말기 생산적인 감염과 일치합니다.
단일 세포 바이러스 유전자, 숙주 유전자 및 숙주 표면 단백질 발현을 나타내는 이러한 트리변량플롯은 CD4 및 CD3 전사체가 유지되더라도 녹색으로 표시된 tat/rev 양성 세포에서 표면 CD4 및 CD3 단백질 발현이 감소한다는 것을 보여준다. 이 기술을 마스터하면 2~3일 후에 이 기술을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 바이러스에 감염된 세포에서 분화된 유전자 및 단백질과 관련된 질문을 해결하기 위해 표적 단일 세포 프로토레틱 평가를 수행하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야 합니다.
