Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия хост-патогенов, такие как уникальные характеристики продуктивно инфицированных клеток, какие кофакторы-хосты позволяют вирусам устанавливать продуктивную инфекцию и как нацеть эти клетки на терапевтические вмешательства. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает количественные показатели как для белка, так и для мРНК в пределах отдельных клеток, и большинство реагентов являются коммерчески доступными. Демонстрация процедуры сортировки клеток будет Мэтью Криган, старший техник из потока цитометрии ядра в лаборатории доктора Майкла Эллера.
Для начала, в назначенной предварительно PCR молекулярной биологии рабочей станции, подготовить анализ смеси путем объединения 96 анализа экспрессии генов в RNase, DNase свободной трубки убедившись, чтобы добавить каждый анализ к окончательной концентрации 180 наномоляр вперед и обратной грунтовки. Добавьте буфер подвески ДНК для достижения соответствующего разбавления смеси анализа. Для каждого ожидаемого 96 на 96 чип массива, пипетки шесть микролитров каждого анализа в назначенный колодец 96 хорошо ПЦР пластины, а затем запечатать пластину с клеем.
Для начала поверхностного окрашивания жизнеспособных клеток, в шкафу биобезопасности культуры тканей, сначала подготовье компенсационных образцов и мастер-микс флуоресцентных антител коктейль, как указано в текстовом протоколе. Оттепель криоконсервированных клеток в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение двух минут. После этого добавьте от 5 до 2 миллилитров клеточной подвески в 15 миллилитровую трубку, содержащую 12 миллилитров PBS.
Центрифуга при 500 G в течение трех минут при 25 градусах по Цельсию, затем аспирировать PBS и повторно гранулы в три миллилитров свежего PBS. Перенесите эту смесь в пятими миллилитровую полистироловую трубку. Центрифуга еще раз при 500 Г в течение трех минут при 25 градусах по Цельсию.
Аспирировать супернатант, оставляя около 10 микролитров остаточного PBS. Далее, повторное использование до 20 миллионов промывают клетки в 80 микролитров антител коктейль. Инкубировать в течение 20 минут при 25 градусах по Цельсию, будучи защищенным от света.
После этого добавьте три миллилитров PBS. Центрифуга при 500 Г в течение трех минут и аспирировать супернатант. Тщательно повторное распределение клеток в 300 до 500 микролитров PBS.
Фильтр этого решения, трубя его через 35 микрометровый нейлоновый клеточный ситечко крышка. затем держать клетки на льду и защищены от света до рода. Вернувшись на рабочую станцию перед ПЦР, сначала подготовьте смесь реакции RT preAMP в одной RNase, DNase бесплатной стерильной трубке, как указано в текстовом протоколе.
Используя многоканальный пипетку, обойтись 10 микролитров этой реакции смеси в нужное количество 96 хорошо PCR сортировать пластины сбора. Печать пластины с клейкой пленкой, а затем поместить пластину на предварительно охлажденный 96 хорошо алюминиевый блок. После этого установите схему сортировки клеток и подготовьте сортер цитометрических клеток потока, как указано в текстовом протоколе.
Введите соответствующие настройки инструмента, чтобы указать количество и подмножество ячеек, которые должны быть отсортированы в каждой хорошо. Удалите клей печать, а затем FACS сортировать клетки в подготовленных 96 хорошо ПЦР коллекции пластин. Запечатать пластину свежей клейкой пленкой.
Немедленно вихрь перепечатанные пластины, а затем центрифуги на 2000 G в течение одной минуты при четырех градусах по Цельсию. Термоцикл пластины в машине ПЦР с разогретой крышкой при 50 градусах по Цельсию в течение 15 минут с последующим 95 градусов по Цельсию в течение двух минут. Наконец, термоцикл в течение 18 циклов 95 градусов по Цельсию в течение 15 секунд и 60 градусов по Цельсию в течение четырех минут, а затем в пост-PCR рабочей станции, передача пяти микролитров cDNA в 20 микролитров буфера подвески ДНК в новой пластине 96 хорошо PCR.
Для начала подготовьте анализную пластину qPCR, засовав в каждую колодец четыре микролитров реагента для анализа нагрузки. Затем перенесите четыре микролитера каждого анализа с 2X-анализной пластины на пластину qPCR. Поддерживайте анализную пластину qPCR при четырех градусах по Цельсию.
Выпредельте жидкости линии управления из грунтовки шприцев в два впускных клапана чипа. Удалите защитный пластик из-под пластины. Поместите чип на контроллер IFC с зазубриной стороной в положении A1, а затем выберите и запустите главный скрипт.
Для каждого микрофлюидного чипа смешайте 50 микролитров реагента для загрузки образца с 500 микролитров смеси PCR master для подготовки смеси реакции в режиме реального времени. Pipette 4.4 микролитров этой реакции смешиваются в каждый колодец нового 96 хорошо ПЦР пластины в настоящее время назначен в качестве образца пластины. Далее, пипетка 3,6 микролитров ранее разбавленной кДНК в каждой колодец образца пластины.
После этого перенесите пять микролитров с анализной пластины на соответствующий колодец на зазубрины чипа. Перенесите пять микролитров из образца пластины в соответствующий колодец на другой стороне чипа. Вставьте загруженный чип в контроллер IFC и запустите скрипт нагрузок.
Затем перенесите чип на платформу BioMark и навеяте инструмент, изложенный в текстовом протоколе, а затем сохраните файл запуска чипа в назначенной папке. Когда запуск чипа будет завершен, откройте программное обеспечение для анализа ПЦР в режиме реального времени, а затем выберите файл, открытый, чтобы открыть чипран. bml файл.
В верхнем левом углу окна программного обеспечения, найти чип исследователь и чип запустить резюме. Под резюме запуска чипа нажмите на установку детектора. В соответствии с задачей щелкните новый и выберите контейнер типа SBS пластины и формат контейнера SBS 96.
Нажмите на кнопку с ellipsis рядом с отображением, а затем выберите M96-Assay-SBS96.dsp. Нажмите на представления анализа. Во вкладке qPCR под задачей выберите базовую коррекцию для линейного производного и КТ порогового метода для пользовательских детекторов.
Во вкладке пороговых значений CT проверьте инициализируемую с помощью автоматической коробки, а затем нажмите кнопку анализа. В правом верхнем квадранте аналитических представлений нажмите на вторую вкладку таблицу результатов. Из меню высадки выберите вид тепловой карты и появится тепловая карта с данными.
Под тепловой картой щелкните порог и зайдите на график журнала. Отрегулируйте пороговые значения КТ вручную для каждого детектора, нажав на анализы, представленные столбцами на тепловой карте, и перетащив порог по мере необходимости, чтобы пересекать кривые усиления в экспоненциальной фазе. Когда это будет сделано, нажмите анализ.
Далее экспорт данных qPCR в качестве файла csv. Передача данных qPCR с компьютера BioMark на рабочий стол. Импортируют данные в электронную таблицу или программное обеспечение статистического анализа и картируют результаты по образцам и позициям анализа на чипе.
Создайте новую колонку и используйте условную формулу для организации клеток в группы на основе экспрессии вирусных генов. При анализе выберите fit Y by X и экспрессию генов сюжета по сравнению с группой. После этого используйте 9-ю версию FlowJo для открытия файлов FCS из сортировки FACS, соответствующих пластине 96 хорошо.
С выделенным именем файла выберите платформу, ворота номера событий и создайте индексные ворота сортировки. Отдельные ячейки будут отображаться по строкам. Выделите все 96 ячеек, а затем выберите рабочее пространство, экспорт, выберите все компенсированные этажи.
В соответствии с данными выберите файл FCS, нажмите на экспорт и выберите назначенную папку. Перетащите новые файлы FCS для отдельных ячеек в новое рабочее пространство FlowJo. Выделите все ячейки и нажмите добавить статистику, представленную кнопкой сигмы, среднее, и все параметры флуоресценции.
Откройте редактор таблицы, затем выделите все этажи первой ячейки и перетащите их в окно редактора таблицы. В этом окне щелкните таблицу создания и просмотра. После этого скопируйте и выводируйте в статистическое программное обеспечение либо путем копирования, либо нажав кнопку сохранения и запуска приложения.
Слияние данных единой ячейки FACS с данными qPCR в JMP по номеру пластины и положению хорошо. Наконец, провести графический и статистический анализ объединенных данных. В этом исследовании одноклеточная поверхностная квантификация белка по цитометрии многотактного потока интегрирована с количественным выражением одноклеточной мРНК с помощью высоко мультиплексного RTqPCR.
Здесь показана одноклеточная количественная вирусная экспрессия генов от FACS отсортированная резус макака CD4 положительные Т-клетки. Tat/rev положительный N отрицательных клеток выражает меньше копий TAT/rev РНК, чем N положительных клеток в темно-зеленом, который согласуется с ранней стадией инфекции до стабилизации и ядерного экспорта частично сращивания вирусной РНК. Высокое обилие непликации Gag-РНК в tat/rev положительном N положительных клеток согласуется с поздней стадией продуктивной инфекции, во время которой обильные геномные РНК выражается и упакованы в начинающие виры.
Этот тривариатный участок, отображающий одноклеточный вирусный ген, ген хозяина и экспрессию белка поверхности хозяина, показывает, что экспрессия белка поверхности CD4 и CD3 снижается в tat/rev положительных клетках, показанных зеленым цветом, даже несмотря на то, что стенограммы CD4 и CD3 поддерживаются. После освоения, этот метод может быть сделано в течение двух-трех дней. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как выполнять целевые одноклеточной прототрансплантуционной оценки для решения вопросов, относящихся к дифференцированно выраженных генов и белков в вирусно инфицированных клеток.
