この方法は、生産的に感染した細胞のユニークな特性は何か、ウイルスが生産的な感染を確立することを可能にする宿主補因子、および治療介入においてこれらの細胞を標的にする方法など、宿主と病原体の相互作用の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一細胞内のタンパク質とmRNAの両方に定量的な対策を提供し、ほとんどの試薬が市販されている点です。細胞選別手順を実証するのは、マイケル・エラー博士の研究室のフローサイトメトリーコアの上級技術者、マシュー・クリーガンです。
まず、指定されたPCR前分子生物学ワークステーションで、96個の遺伝子発現アッセイをRNaseに組み合わせてアッセイミックスを準備し、DNaseフリーチューブは、各アッセイをフォワードおよびリバースプライマーの最終濃度180ナノモルに追加することを確認します。DNA懸濁液バッファーを追加して、アッセイミックスの適切な希釈を達成する。予想される各96個の96チップアレイについて、各アッセイのピペット6マイクロリットルを96ウェルPCRプレートの指定ウェルに入れ、その後、接着剤でプレートを密封します。
生細胞の表面染色を開始するには、組織培養バイオセーフティキャビネットで、まず、テキストプロトコルで概説されているように、補償サンプルと蛍光抗体カクテルのマスターミックスを調製する。37°Cの水浴で凍結保存された細胞を2分間解凍します。この後、12ミリリットルのPBSを含む15ミリリットルのチューブに細胞懸濁液の5〜2ミリリットルを加える。
500 Gで摂氏25度で3分間遠心分離し、PBSを吸引し、新鮮なPBSの3ミリリットルでペレットを再懸濁する。この混合物を5ミリリットルポリスチレンチューブに移します。25°Cで3分間500Gで再び遠心分離機。
上清を吸引し、約10マイクロリットルの残留PBSを残す。次に、80マイクロリットルの抗体カクテルで最大2,000万個の洗浄細胞を再懸濁します。光から保護しながら、摂氏25度で20分間インキュベートします。
この後、PBSを3ミリリットル加えます。500Gで遠心分離機を3分間、上清を吸引する。PBSの300〜500マイクロリットルで細胞を徹底的に再懸濁します。
35マイクロメートルのナイロンセルストレーナーキャップを通してピペット処理して、この溶液をフィルター処理します。その後、氷の上に細胞を維持し、並べ替えまで光から保護します。プリPCRワークステーションに戻って、テキストプロトコルで概説されているように、最初にRT preAMP反応ミックスを単一のRNase、DNaseフリー滅菌チューブで準備します。
マルチチャンネルピペットを使用して、この反応ミックスの10マイクロリットルを所望の96ウェルPCRソートコレクションプレートに分配します。粘着フィルムでプレートを密封し、プレートをあらかじめ冷やした96ウェルアルミニウムブロックの上に置きます。その後、セルソートの採座方式を確立し、テキストプロトコルで概説されているようにフローサイトメトリクスセルソーターを準備します。
適切な計器設定を入力して、各ウェルにソートするセルの数とサブセットを指定します。接着シールを取り外し、FACSは、調製した96ウェルPCRコレクションプレートに細胞をソートします。新鮮な粘着フィルムでプレートを再シールします。
すぐに再密封されたプレートを渦巻き、2000 Gで遠心分離機を摂氏4度で1分間回転させます。PCRマシンでプレートをサーモサイクルし、予熱蓋を50°Cで15分間加熱し、続いて摂氏95度を2分間加熱します。最後に、摂氏95度の18サイクルのサーモサイクルを15秒間、摂氏60度で4分間、PCR後のワークステーションで、新しい96ウェルPCRプレートで5マイクロリットルのcDNAをDNA懸濁液バッファーの20マイクロリットルに移します。
まず、各ウェルに4マイクロリットルのアッセイローディング試薬をピペット処理してqPCRアッセイプレートを調製します。次に、各アッセイの4マイクロリットルを2XアッセイプレートからqPCRプレートに移します。qPCRアッセイプレートを摂氏4度に保つ。
プライミングシリンジからチップの2つの取り込み弁に制御ラインの流体を分配します。プレートの下から保護プラスチックを取り外します。チップを IfC コントローラの A1 位置に切り込んだ位置に置き、主スクリプトを選択して実行します。
マイクロ流体チップごとに、サンプルローディング試薬の50マイクロリットルをPCRマスターミックスの500マイクロリットルと混合し、リアルタイム反応ミックスを調製します。この反応のピペット4.4マイクロリットルは、サンプルプレートとして指定された新しい96ウェルPCRプレートの各ウェルに混合します。次に、前に希釈したcDNAのピペット3.6マイクロリットルを、サンプルプレートの全ウェルに入れた。
この後、チップのノッチ側にある対応するウェルにアッセイプレートから5マイクロリットルを移します。サンプルプレートからチップの反対側の対応するウェルに5マイクロリットルを移します。IFC コントローラに搭載されたチップを挿入し、ロード ミックス スクリプトを実行します。
次に、チップをBioMarkプラットフォームに転送し、テキストプロトコルで概説されているように機器を設定し、チップ実行ファイルを指定されたフォルダに保存します。チップの実行が完了したら、リアルタイム PCR 解析ソフトウェアを開き、ファイルを選択して開き、チップランを開きます。bml ファイル。
ソフトウェアウィンドウの左上隅で、チップエクスプローラとチップ実行サマリーを見つけます。[チップの実行の概要] で、ディテクタの設定をクリックします。[タスク] で[新規]をクリックし、コンテナタイプ SBS プレートとコンテナフォーマット SBS 96 を選択します。
マッピングの横に省略記号が付いたボタンをクリックし、M96-アッセイ-SBS96.dspを選択します。解析ビューをクリックします。タスクの下の qPCR タブで、ユーザー検出器の線形誘導体および CT しきい値方式のベースライン補正を選択します。
[CT しきい値] タブで、[自動で初期化] ボックスをオンにし、[分析] ボタンをクリックします。分析ビューの右上の領域で、2 番目のタブの結果表をクリックします。ドロップダウン メニューから [ヒート マップ] ビューを選択すると、データを含むヒート マップが表示されます。
ヒート マップの下で、[しきい値とログ グラフ] をクリックします。ヒートマップ上の列で表されるアッセイをクリックし、必要に応じてしきい値をドラッグして指数位相の増幅曲線を交差させることで、検出器ごとに手動でCT閾値を調整します。完了したら、[分析] をクリックします。
次に、qPCR データを csv ファイルとしてエクスポートします。QPCR データを BioMark コンピュータからデスクトップに転送します。データをスプレッドシートまたは統計解析ソフトウェアにインポートし、チップ上のサンプルとアッセイ位置で結果をマッピングします。
新しい列を作成し、条件式を使用して、ウイルス遺伝子の発現に基づいて細胞をグループに編成します。[解析] で、[X によるフィット Y] を選択し、遺伝子発現対グループをプロットします。この後、FlowJo バージョン 9 を使用して、96 ウェル プレートに対応する FACS ソートから FCS ファイルを開きます。
ファイル名を強調表示して、プラットフォーム、イベント番号ゲートを選択し、インデックス付きソートゲートを作成します。個々のセルが行ごとに表示されます。96 個のセルをすべてハイライト表示し、ワークスペースを選択し、エクスポートして、補償された床をすべて選択します。
[データ] の下で [FCS ファイル] を選択し、[エクスポート] をクリックして、指定したフォルダを選択します。個々のセルの新しい FCS ファイルを新しい FlowJo ワークスペースにドラッグします。すべてのセルをハイライト表示し、シグマボタン、平均、およびすべての蛍光パラメータで表される統計を追加をクリックします。
テーブルエディタを開き、最初のセルのすべての床をハイライト表示し、テーブルエディタウィンドウにドラッグします。このウィンドウで、[テーブルの作成と表示] をクリックします。その後、コピー貼り付けまたは保存してアプリケーションを起動ボタンをクリックして、統計ソフトウェアにコピーして出力します。
単一セルFACSデータをJMPのqPCRデータと組み合わせ、プレート番号とウェル位置で行います。最後に、結合されたデータに対して、グラフィカルおよび統計分析を実行します。本研究では、マルチパラメータフローサイトメトリーによる単一細胞表面タンパク質定量は、高多重化されたRTqPCRによる定量的単一細胞mRNA発現と統合されている。
ここに示されているのは、FACSから単一細胞定量的ウイルス遺伝子発現が、アカゲザルCD4陽性T細胞を選別した。陰性細胞のTat/rev陽性Nは、安定前の感染の初期段階および部分的にスプライスされたウイルスRNAの核輸出と一致する濃緑色の陽性細胞のNよりもタット/rev RNAのコピーが少ない。正の細胞のtat/rev陽性NにおけるスプライシングされていないGag-RNAの豊富な存在は、豊富なゲノムRNAが発現し、出芽ビリオンにパッケージ化される後期生産感染と一致する。
この三変量プロットは、単一細胞ウイルス遺伝子、宿主遺伝子、および宿主表面タンパク質発現を示すプロットは、CD4およびCD3転写産物が持続しているにもかかわらず緑色で示されるtat/rev陽性細胞において表面CD4およびCD3タンパク質発現が減少することを示している。一度習得すると、この技術は2〜3日で行うことができます。このビデオを見た後、ウイルス感染細胞の遺伝子とタンパク質の異例発現に関する質問に対処するために、標的単一細胞原転写評価を行う方法をよく理解する必要があります。
