המחברים נתמכו על ידי החברה יפן 17H 02223 של קידום המדע KAKENHI גרנט JP16K11200, המענק לחקר מ קנאזאווה רפואי באוניברסיטת S2016-8 ו- C2017-3. אנו מודים Yuhichi מלון התמיכה שלו לקחת את התמונות.

כל ההליכים נעשים על פי העקרונות המנחים של החברה פיזיולוגיים של יפן, באישור של בעלי חיים אכפת הוועדה של קנאזאווה רפואי האוניברסיטה.
1. בנייה של בעל Optrode זכוכית
הערה: כדי לבנות בעל optrode זכוכית, בעל אלקטרודה מסחרי משמש (איור 1 א').
<ol><li>משוך בעדינות החוצה את צינור פלדה לבקרת לחץ מתוך לוע של המחזיק.</li>
	<li>על ידי קידוח, להרחיב את החור של הצד המושב סיכה בקנה של בעל. להפוך את החור 3 מ מ בקוטר של 12 מ מ עומק.</li>
	<li>לשים צינור פלדה אל חלד (3 מ מ בקוטר של 0.5 מ מ עובי, 8 מ"מ אורך; איור 1A 2) בתוך החור.</li>
	<li>הכנס קרמיקה לפצל שרוול ההזדווגות עבור ⌀2.5 ferrules מ מ (איור 1 א'1) לתוך החור.</li>
	<li>לתקן את החבית של בעל אלקטרודה rabbet בצורת L עם דבק אפוקסי.</li>
	<li>להפוך את החורים (3 מ מ קוטר) rabbet ולחבר אותו תחמן עם ברגים.</li>
</ol>2. ראש פוסט התקנה
<ol><li>להכין פוסט ראש לפי הזמנה של כרווח המעגל. להפוך את מרווח טורי המעגל לצורה cuboidal בחותך הטחינה, לחתוך אותו ל 2 פוסטים בראש עם מסור (איור 1B). לשטח בתחתית העמוד הראשי בחותך הטחינה.</li>
	<li>הכנת החיה מהונדס שבו מתבטאת אופסין רגישים לאור סוג של תא עצב מסוים לצורך המחקר. בעבודה זו, נעשה שימוש בעכבר הטרנסגניים (VGAT-ChR2 עכברים) שבו הנוירונים מעכבות אקספרס channelrhodopsin-2 (ChR2)11 .</li>
	<li>עזים ומתנגד החיה עם תערובת של 0.3 מ"ג/ק"ג של medetomidine, 4.0 מ"ג/ק"ג של midazolam ו- 5.0 מ"ג/ק"ג של butorphanol על ידי מינהל בקרום הבטן. כדי לוודא כי החיה. הוא מורדם לחלוטין, בדיקת התגובות שלה אל הזנב צובט.</li>
	<li>הנח את העכבר בתוך מסגרת stereotaxic על כרית החימום. נקי את המסגרת stereotaxic וחימום פאד עם אלכוהול 70% מראש. למקם את השיניים בתוך החור של שורת ביס, והדק בקלילות את המלחציים האף. לתקן את שני צידי הראש באמצעות האוזן ברים. כאשר הראש כראוי קבוע בסורגים האוזן, להדק את המלחציים האף. משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים.</li>
	<li>לגלח את העור ראש עם מספריים קטנות, לנקות את הקרקפת באמצעות מקלון צמר גפן של chlorhexidine gluconate. לפני הניתוח, לעקר את כל שמכשירי הניתוח וראש פוסט עם החיטוי (121 מעלות, 15 דקות).</li>
	<li>לחתוך את הקרקפת לאורך הקו האמצעי עם מספריים ודחף אותו הצידה. לבצע את החתך מהחלק האחורי של הראש לעיניים (כ 20 מ מ). הסרת קרום העצם באמצעות מקלון צמר גפן טבול באלכוהול 70% ויבש את הגולגולת.</li>
	<li>לצרף את ההודעה לראש manipulator. מקם את ההודעה ראש שטוח על הגולגולת סביב bregma באמצעות manipulator.</li>
	<li>מערבבים את מונומר (4 טיפות), זרז (טיפה 1) ופולימר (1 כף קטנה) של מלט שיניים בצלחת קטנה זה הוא מקורר במקרר מראש. לשים את הבטון שיניים (להלן 1 g) על המצח ועל עצם הקודקוד של הגולגולת כדי לתקן את ההודעה לראש בגולגולת.</li>
	<li>לאחר הבטון שיניים נעשה קשה להסיר את העכבר המסגרת stereotaxic. לשים משחה לאנטיביוטיקה על העור החשוף. להזריק את medetomidine אנטגוניסט (0.3 מ"ג/ק"ג), האנטיביוטיקה (oxytetracycline; 20 מ"ג/ק"ג). מקום לנטר את העכבר על משטח חום בתוך כלוב עד התעורר ו להחזיר אותו לכלוב דיור.</li>
	<li>בית החיה בכלוב למגורים נפרדים עם איזה מכשיר העשרה. לשנות את הנייר בעלי חיים מצעים כל יום כדי לשמור על ניקיון הכלוב ולמנוע זיהום. בזהירות לפקח אם החיה מראה סימנים של אי נוחות. להחיל לידוקאין הפצע אם חשוד בשום כאב. מנהל meloxicam או carprofen פעם אחת בכל 24 שעות במשך 48 שעות אחרי שני בראש פוסט ניתוחי התקנה של גולגולת. הלידוקאין המקומי יכול להינתן בנוסף אם NSAID אינה מספיקה.
</li>
</ol>3. להתאקלמות
<ol><li>שני ימים (לפחות) לאחר ההתאוששות מן ההרדמה, להתאקלם החיות למצב שבו הראש-קבוע בבית הבליעה הקלטה. לבצע את ההפעלות להתאקלמות למשך 5 ימים לפחות.</li>
	<li>במהלך המפגשים והפיזיולוגי, להכניס החיה בבית הבליעה הקלטה עם הדואר ראש קבוע כדי מלחציים לפי הזמנה. במהלך ההפעלה, כדי להגביל את התנועה, כיסוי הגוף בעזרת צינור חצי שרף בהזמנה אישית (איור 1C), עשה שימוש במדפסת תלת-ממד. הערה: ביום 1, הפעלת להתאקלמות צריך להיות ארוך 5 דקות. זה ואז גדל מדי יום כדי 10, 20, 40 ו- 60 דקות ימים 2, 3, 4 ו-5, בהתאמה.</li>
	<li>בסוף כל מפגש, תן החיה לפרס של אוכל. אם החיה נאבק באופן רציף במהלך להתאקלמות, להפסיק את ההפעלה.</li>
</ol>4. גולגולת
הערה: לאחר והפיזיולוגי, גולגולת נעשית השתלטה על האזור במוח להקלטה. הניתוח מבוצע במסגרת stereotaxic תחת הרדמה, כמו עם הראש פוסט ההתקנה. ההליך פעולה-מאוחרת זה אותו הדבר כמו הראש פוסט התקנה
<ol><li>לפני הניתוח, ינקה את הגולגולת באמצעות מקלון צמר גפן עם chlorhexidine gluconate ו- 70% אלכוהול.</li>
	<li>בזהירות לגרד את הגולגולת מעל האתר הקלטה עם מקדח שיניים. כאשר העצם הופכת מספיק דק, חותכים את זה עם קצה האזמל ולהסיר אותו.</li>
	<li>לשים מלט שיניים באזור חשוף על מנת לחזק את הגולגולת.</li>
	<li>לכסות את האזור במוח חשוף עם דבק סיליקון לאחר הבטון שיניים נעשה קשה. הנוהל לאחר הניתוח הוא כפי שמתואר בשלב 2.8.</li>
</ol>5. אלקטרופיזיולוגיות הקלטה
<ol><li>לאפשר את החיה להתאושש במשך לפחות יום אחד לאחר הניתוח לפני ביצוע ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות. למקם את החיה בבית הבליעה הקלטה באותה דרך שזה נעשה במהלך המפגשים להתאקלמות מתי התחלת הקלטת.</li>
	<li>להפוך פיפטות זכוכית של נימים זכוכית בורוסיליקט (OD = 1.5 מ מ, ID = 0.9 מ מ, 90.0 מ"מ) של פולר אלקטרודה. קוטר עצה שלהם היא 3-2 מיקרומטר, ההתנגדות שלהם הוא 4-6 MΩ כאשר הם מלאים 10 מ ל- PBS. האורך של האלקטרודה הוא 40 – 50 מ מ. בכמה הקלטות, 2% neurobiotin נוסף של 10 מ ל- PBS.</li>
	<li>לצרף את פיפטה מזכוכית מלא בעל optrode בהזמנה אישית.</li>
	<li>מכניסים את החוט כסף Ag-Cl מצופה (0.2 מ"מ קוטר) פיפטה מזכוכית. לחבר את החוט כסף מספר הזיהוי האישי שלך באמצעות חוט חשמל דק מצופה. לחבר את ה-pin headstage של המגבר הקלטה.</li>
	<li>חבר את כבל סיבים אופטיים תיקון (הליבה = 960 מיקרומטר, חיפוי = 1,000 מיקרומטר, NA = 0.63) עם ferrule זרקוניה (OD = 2.5 מ מ) כדי הפיצול ההזדווגות שרוול על בעל optrode. דחוף את תיקון כבל לתוך השרוול עד קצה ferrule הקשר האחורי של פיפטה מזכוכית. תיקון כבל מספק את האור (אורך גל = 465 nm) מ LED. נורית ה-LED נשלטת על ידי נהג LED ערוץ אחד.</li>
	<li>הסר את דבק סיליקון מעל הניתוח. במקום ומחוממת תמיסת מלח (38 ° C) על פני המוח מעת לעת כדי למנוע את פני השטח של המוח ייבוש במהלך להקלטות. במידת הצורך, הסר את השכבה הקשה של המוח עם פינצטה חדה.</li>
	<li>הכנס את אלקטרודת זכוכית רקמת המוח עם תחמן. נטר את ההתנגדות אלקטרודה הוספתו. החלף את האלקטרודה כאשר ההתנגדות היא נמוכים מהמצופה כי קצה האלקטרודה עלולים להינזק. בעומק של עניין, חיפוש ולבודד את הקוצים יחידה על-ידי התאמת העומק בשלבים 2-5 מיקרומטר.</li>
	<li>לאחר היחידה מבודדת, לספק נורית ה-LED ולבחון את התגובה לגירויים קלים.</li>
	<li>להקליט את פעילות עצבית לאחר הזיהוי של סוגי תאים. לבצע ההקלטות עבור 2-3 h. אם ההקלטה מתבצעת על ימים רצופים (מקסימום של 2 ימים), לכסות את הניתוח עם דבק סיליקון. בעת ההקלטה הסתיימה, החיה הוא הקריב, לאחזר את ההודעה לראש ושם אותו בתוך אצטון לשטוף ולהשתמש מחדש זה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neural+circuits.">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li><li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons:+triumphs+and+challenges.">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).</li><li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+mouse+inferior+colliculus+share+similar+response+properties.">Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).</li><li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+sound-evoked+afterdischarge+in+the+auditory+midbrain.">Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain.</a> Scientific Reports. 6, 20757 (2016).</li><li>Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-assisted+patching:+in+vivo+recording+of+genetically+and+morphologically+identified+neurons+throughout+the+brain.">Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain.</a> Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).</li><li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINP:+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording.">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4 (7), e6099 (2009).</li><li>Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monaural+and+binaural+response+properties+of+neurons+in+the+inferior+colliculus+of+the+rabbit:+effects+of+sodium+pentobarbital.">Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital.</a> Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).</li><li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetics+change+the+excitation/inhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus.">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).</li><li>Duque, D., Malmierca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-specific+adaptation+in+the+inferior+colliculus+of+the+mouse:+anesthesia+and+spontaneous+activity+effects.">Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects.</a> Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).</li><li>Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+predictable+versus+random+temporally+complex+stimuli+from+single+units+in+auditory+thalamus:+impact+of+aging+and+anesthesia.">Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia.</a> Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+GABAergic+neurons+in+the+inferior+colliculus.">Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).</li><li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse:+electrophysiological+and+morphological+properties.">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+using+Thy1-GCaMP+transgenic+mice.">Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice.</a> Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).</li><li>Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recording+of+fluorescence+and+electrical+signals+by+photometric+patch+electrode+in+deep+brain+regions+in+vivo.">Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).</li><li>LeChasseur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microprobe+for+parallel+optical+and+electrical+recordings+from+single+neurons+in+vivo.">A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo.</a> Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).</li><li>Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation.">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li><li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons.">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

Optogenetics הפך להיות כלי רב עוצמה במדעי המוח. היא ניצלה זיהוי נוירון מסוים סוגי ויוו , כמו גם מניפולציה הפעילות של מסלולים עצביים מסוימים. ההבהרה של הפעילות העצבית של סוגים עצביים שונים מקדם את ההבנה של המנגנון של מעגלים עצביים. כאן, אנחנו הפגינו שיטה להעברת האור לאתר הקלטה דרך אלקטרודת זכ...

מערכת העצבים המרכזית מורכבת מסוגים שונים של נוירונים, אשר יש פונקציות שונות. איך עובדים אלה סוגים שונים של נוירונים בתוך המעגל העצבי הוא אחד החששות העיקריים במדעי המוח. עם זאת, באזורים במוח רבים, עבר בלתי. אפשרי להבחין את סוגי עצביים ויוו בהקלטות של פעילויות חשמל כי אין הבדל ברור בתוך האות החשמלי ספייק עצמו, עם מספר חריגים. התפתחויות אחרונות optogenetics הפכו את פריצת הדרך1,2. באמצעות בעלי חיים מהונדס שבו רגישים לאור אופסין (למשל, channelrhodopsin-2) מתבטא בסוגי עצביים מסוימים, ניתן היה להבחין את סוגי עצביים יעיל בויוו הקלטות3, 45,,6. החיות הללו, הנוירונים עם רגישים לאור אופסין שמחים על ידי מתן גירויים קלים במהלך הקלטות חשמל, אך נוירונים אחרים אינם. הנוירונים אופסין-חיוביים, ולכן בקלות נבדלים סוגים אחרים נוירון על ידי תשובותיהן לאור.
בניסויים optogenetics, חיוני כדי לספק את האור אל אתר הקלטה. כמו שיטה לא פולשנית, האור מכוונת בדרך כלל מפני השטח של המוח. עם זאת, כי כוחו של האור מפחית כמו זה עובר דרך רקמת המוח, קשה לעורר את האזורים מוחי עמוק ממשטח של המוח. במיוחד, קשה לאור גירוי להגיע אל האזורים מוחי עמוק כאשר שקיפות אופטית של המשטח המוח נמוך, כפי שקורה לעיתים קרובות עם הקלטות חיות ער. ניסויים אלקטרופיזיולוגיות לעיתים קרובות בוצעו על חיות מורדם בגלל תנועת הגוף גורם רעש בהקלטות. כפי מתועד היטב, עם זאת, הרדמה ידוע כדי לשנות את תגובות עצביות7,8,9,10. לפיכך, יש צורך להשתמש בבעלי חיים ער ללימוד תגובות עצביות ללא השפעת הרדמה מלאכותי. בניגוד הניסויים בחיות מרדימים, ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות מבוצעות לאחר ההחלמה מניתוח בניסויים בחיות ער. במהלך מרווח בין הניתוח ובין ההקלטות, תפליט רקמת לעיתים קרובות מצטבר על פני המוח והופכת את שקיפות אופטית של המשטח המוח נמוך.
כאן, אנו מתארים שיטה כדי להקליט הקלטות יחיד-יחידה העכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית. בשיטה זו, האור מועברת באמצעות אלקטרודת זכוכית ההקלטה כך ניתן לעורר בצורה אמינה נוירון שהוקלט עם אור באזורים עמוקים במוח. מערכת optrode לפי הזמנה זו כוללת חומרים נגיש וזול והוא קל להרכיב.

<table><tbody><tr><td>Electrode holder</td><td>Molecular Device</td><td>1-HL-U</td><td>pipette holder for microelectrode amplifier</td></tr><tr><td>Ceramic split mating sleeve</td><td>Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>f2.5 mm ferrule</td></tr><tr><td>Circuit board spacer</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>f8.0 mm, 20.0 mm long</td></tr><tr><td>Stereotaxic frame for mice</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>Stereotaxic instruments for mice</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>Manual manipulator</td></tr><tr><td>Superbond</td><td>Sun Medical</td><td>M: 204610557</td><td>Dental adhesive resin cement</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td>NA</td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>Low toxicity silicone adhesive</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long</td></tr><tr><td>Fiber-optic patch cord</td><td>Doric Lenses</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63</td></tr><tr><td>Connectrized LED</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDC-1B_FC</td><td>Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA )</td></tr><tr><td>LED driver</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDRV_1CH_1000</td><td>1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA</td></tr><tr><td>Electrode puller</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>Dual-stage glass micropipette puller</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., Ltd</td><td>185711173</td><td>Antibiotic ointment</td></tr><tr><td>Terramycin&amp;reg;-LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>Oxytetracycline</td></tr><tr><td>Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td><td>Jackson Labs</td><td>#14548</td><td>VGAT-ChR2 mice</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>Microelectrode amplifier</td></tr></tbody></table>

optogenetics identification of a neuronal type with a glass optrode in awake mice

זה הדאגה העיקרית במדעי המוח שונה סוגי נוירונים עובדים את המעגלים העצביים. התפתחויות אחרונות optogenetics אפשרו את הזיהוי של הסוג עצביים בניסויים ויוו אלקטרופיזיולוגיות באזורים במוח רחבה. בניסויים optogenetics, חיוני כדי לספק את האור אל אתר הקלטה. עם זאת, קשה לעתים קרובות לספק את האור גירוי לאזורים מוחי עמוק ממשטח של המוח. במיוחד, קשה לאור גירוי להגיע אל האזורים מוחי עמוק כאשר שקיפות אופטית של המשטח המוח נמוך, כפי שקורה לעיתים קרובות עם הקלטות חיות ער. כאן, אנו מתארים שיטה כדי להקליט את ספייק אל האור של תגובות העכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית. בשיטה זו, האור מועברת באמצעות אלקטרודת זכוכית ההקלטה כך ניתן לעורר בצורה אמינה נוירון שהוקלט עם אור באזורים מוחי עמוק. מערכת optrode לפי הזמנה זו כוללת חומרים נגיש וזול והוא קל להרכיב.

איור 2, בדקנו את ההשפעות של גודל הטיפ ואורך פיפטות זכוכית על כוח האור בקצה מדי סוכר (איור 2 א-ב'). אור החשמל נמדדה על ידי מד הכוח האופטי להציב 1 מ"מ מן הקצה. אורך מלא הוגדר 50 ± 2 מ מ כאשר גודל קצה מגוונים, ואילו גודל קצה הוגדר 2.5 מיקרומטר כ?...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice at JoVE.com

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Optogenetics זיהוי של סוג עצביים עם Optrode זכוכית בעכברים ער

עבודה זו מציגה שיטה לבצע optogenetic יחיד-יחידת הקלטה אמינה מכל עכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית.

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

optogenetics-identification-neuronal-type-with-glass-optrode-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.7K Views.  Kanazawa Medical University. עבודה זו מציגה שיטה לבצע optogenetic יחיד-יחידת הקלטה אמינה מכל עכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית.

Video: Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

Photostimulation לייזר לסריקת של מעגלים מוח קדמי ממוקדים Optogenetically

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

מניפולציה אופטוגנטית של פעילות עצבית לווסת את ההתנהגות בעכברים נעים בחופשיות

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Behavior

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

מדריך ל<em&gt; בשנת vivo</em&gt; הקלטה חד-יחידה מקליפת המוח המעכבת interneurons המזוהות Optogenetically

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

הדמיה ישירה של Murine הגבי שבלול Nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

מניפולציה אלקטרואופטיקה של מעגלים עצביים בזמן ניטור שינה/ערות מדינות עכברים

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective neural modulation or monitoring. As specific types of neuronal cells can be genetically modified to express opsin proteins, optogenetics enables optical stimulation or inhibition of the selected neurons. There have been several technological advances in the optical system for optogenetics. Recently, it was proposed to combine the optical waveguide for light delivery with electrophysiological recording to simultaneously monitor the neural responses to optogenetic stimulation or inhibition. In this study, an implantable optrode array (2x2 optical fibers) was developed with embedded multichannel electrodes. 
A light-emitting diode (LED) was employed as a light source, and a microfabricated microlens array was integrated to provide sufficient light power at the tip of the optical fibers. The optrode array system comprises the disposable part and the reusable part. The disposable part has optical fibers and electrodes, while the reusable part has the LED and electronic circuitry for light control and neural signal processing. The novel design of the implantable optrode array system is introduced in the accompanying video in addition to the procedure of the optrode implantation surgery, optogenetic light stimulation, and the electrophysiological neural recording. The results of in vivo experiments successfully showed time-locked neural spikes evoked by the light stimuli from hippocampal excitatory neurons of mice.

Here, we present the fabrication method of an optrode system with optical fibers for light delivery and an electrode array for neural recording. In vivo experiments with transgenic mice expressing channelrhodopsin-2 show the feasibility of the system for simultaneous optogenetic stimulation and electrophysiological recording.

מערך Optrode לאפנון אופטוגנטי סימולטני והקלטה עצבית חשמלית

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective ...

Optogenetics זיהוי של סוג עצביים עם Optrode זכוכית בעכברים ער

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video