저자는 승진의 과학 KAKENHI 그랜트 JP16K11200 및 17 H 02223, 일본 사회와 가나자와 의료 대학 S2016-8 및 C2017-3에서 연구 보조금에 의해 지원 되었다. 우리는 사진 촬영에 그의 지원에 대 한 Yuhichi 것을 감사 합니다.

모든 절차는 동물 관리 위원회의 가나자와 의과대학의 승인와 일본의 생리 사회의 원칙에 따라 수행 됩니다.
1입니다. 건설 유리 Optrode 홀더
참고: 유리 optrode 홀더를 구축 하는 상업 전극 홀더 사용 됩니다 (그림 1A).
<ol><li>부드럽게 소유자의 배럴에서 압력 제어를 위해 스틸 튜브 밖으로 당겨.</li>
	<li>드릴링에 의해 소유자의 배럴에서 핀 좌석 쪽의 구멍을 확대. 깊이 3 m m 직경에서 그리고 12mm 구멍을 확인 합니다.</li>
	<li>스테인리스 강 관 (직경에서 3 m m, 두께, 0.5 m m 그리고 길이; 8 m m를 넣어 그림 1A 2) 구멍에.</li>
	<li>구멍에 ⌀2.5 m m 깃 봉 (그림 1A1)에 대 한 짝짓기 소매를 분할 하는 세라믹을 삽입 합니다.</li>
	<li>에폭시 접착제는 L 자 모양의 사 개에 전극 홀더의 배럴을 수정 합니다.</li>
	<li>사 개에 구멍 (직경에서 3 m m)를 확인 하 고 나사와 조작에 첨부.</li>
</ol>2. 머리 포스트 설치
<ol><li>회로 보드 스페이서의 만든 맞춤식 머리 게시물을 준비. 열 회로 보드 스페이서 밀링 커터 cuboidal 모양으로 만들고 (그림 1B) 톱으로 2 머리 게시물에 그것을 잘라. 밀링 커터 헤드 게시물의 하단에 평평 하 게.</li>
	<li>빛에 민감한 opsin 연구에 대 한 특정 뉴런 형식에 표현 하는 유전자 변형 동물을 준비 합니다. 이 작품에는 억제 신경 channelrhodopsin-2 (ChR2)11 을 표현 하는 유전자 변형 마우스 (VGAT-ChR2 마우스) 사용 됩니다.</li>
	<li>복 관리에 의해 medetomidine의 0.3 mg/kg, 4.0 mg/kg, midazolam의 및 butorphanol의 5.0 mg/kg의 혼합물으로 동물을 anesthetize. 동물 마 취 완벽 하 게 확인, 곤란 꼬리의 반응을 테스트 합니다.</li>
	<li>생리대에 stereotaxic 프레임에 마우스를 놓습니다. 청소 stereotaxic 프레임 및 난방 패드 70% 알코올로 미리. 치아를 물린 바의 구멍에 놓고 가볍게 코 클램프를 조여. 귀 막대를 사용 하 여 머리의 양쪽 모두를 수정 합니다. 머리 귀 막대로 고정 올바르게 때 코 클램프를 조입니다. 눈에 눈 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>작은 위로 머리 피부를 면도 하 고 액체 글 루 콘 산의 면봉으로 두 피를 청소. 수술 하기 전에 수술 도구와 머리 압력솥 (121 ° C, 15 분)와 게시 모든 소독 합니다.</li>
	<li>두 피 중간 선 따라가 위로 잘라 고 옆으로 밀어. 눈 (약 20 m m)를 머리 뒤쪽에서 절 개를 확인 합니다. 70% 알코올에 담근 면봉으로 여과 제거 하 고 건조 한 두개골.</li>
	<li>조작자를 머리 게시물을 연결 합니다. 머리 게시물 두개골 bregma 조작자를 사용 하 여 주위에 배치 합니다.</li>
	<li>단위체 (4 정), 촉매 (1 방울), 및 냉장고에 미리 냉장은 작은 접시에 치과 시멘트의 폴리머 (1 작은 스푼) 섞는다. 정면에 해골 머리 게시물 수정 두개골의 정수 리 뼈 (1 g) 아래 치과 시멘트를 넣어.</li>
	<li>치과 시멘트 하드 후, stereotaxic 프레임에서 마우스를 제거 합니다. 노출 된 피부에 항생제 연 고를 넣어. Medetomidine 길 항 제 (0.3 mg/kg)과 항생제 (oxytetracycline; 20 mg/kg) 주사. 깨우 고, 주택 케이지를 반환 때까지 장소와 모니터에 마우스에에서 패드.</li>
	<li>하우스 몇 가지 농축 장치 개별 주택 장에 동물. 케이지를 청결 한 유지 하 고 감염을 방지 하기 위해 매일 침구 동물 종이 변경 합니다. 신중 하 게 모니터링 동물 표시 불편의 어떤 표시 든 지. 상처에 적용 lidocaine 통증이 의심 되는 경우. 관리 meloxicam 또는 carprofen 두 머리 포스트 설치 및 craniotomy 수술 후 48 h 한 번 모든 24 h. 로컬 lidocaine 주어질 수 있다 또한 경우에 NSAID 적합 하지 않습니다.
</li>
</ol>3입니다. 새 환경 순응
<ol><li>2 일 (최소), 마 취에서 회복 후 녹음 실에서 머리 고정 상태로 동물 적응. 적어도 5 일 동안 새 환경 순응 세션을 수행 합니다.</li>
	<li>새 환경 순응 세션 동안 사용자 클램프에 고정 머리 게시물 사용 녹음 실에서 동물을 놓습니다. 움직임을 제한 하기 위하여 세션 동안 커버 맞춤 수 지 반 튜브 (그림 1C), 시체 3 차원 프린터를 사용 하 여 만든. 참고: 1 일, 새 환경 순응 세션 5 분 긴를 이어야 한다. 그것은 다음 증가 매일 10, 20, 40, 및 60 분 동안 2, 3, 4, 및 5, 각각.</li>
	<li>각 세션의 끝에, 동물을 음식 보상을 제공 합니다. 동물에 새 환경 순응 기간 동안 지속적으로 투쟁을 하는 경우는 세션을 중지 합니다.</li>
</ol>4입니다. craniotomy
참고: 새 환경 순응, 후 한 craniotomy가 이루어집니다 녹음에 대 한 뇌 영역을 통해. craniotomy 마 취, 머리로 설치 게시물 stereotaxic 프레임에서 수행 됩니다. 사후 작업 절차는 머리 게시물 설치는 동일 합니다.
<ol><li>Craniotomy, 하기 전에 액체 글 루 콘 산 및 70% 알코올 면봉으로 두개골을 청소.</li>
	<li>조심 스럽게 치과 함께 녹음 사이트를 통해 두개골을 다쳤어요. 뼈를 충분히 얇은 되 면 메스의 팁으로 넘어가지 고 그것을 제거 합니다.</li>
	<li>두개골을 강화 노출 지역의 치과 시멘트를 넣어.</li>
	<li>치과 시멘트 하드 후 실리콘 접착제로 노출 된 뇌 영역을 커버. 수술 후 절차는 2.8 단계에서 설명한 대로.</li>
</ol>5. electrophysiological 기록
<ol><li>동물 electrophysiological 녹화를 수행 하기 전에 craniotomy 후 최소 1 일에 대 한 복구를 허용 합니다. 같은 방법으로 그것을 녹음 시작 될 때 새 환경 순응 세션 동안 한 녹음 실에서 동물을 놓습니다.</li>
	<li>붕 규 산 유리 모 세관에서 유리 펫 만들기 (OD = 1.5 m m, ID = 0.9 m m, 길이 90.0 m m) 전극 끌어당기는 사람에. 그들의 팁 직경은 2-3 µ m 이다, 그리고 그들의 저항에서 4-6 m ω가 때 그들은 10mm PBS로 가득. 전극의 길이 40-50 m m입니다. 일부 녹음에 2% neurobiotin 10 m m PBS에 추가 됩니다.</li>
	<li>주문 품 optrode 홀더를 채워진된 유리 피 펫을 연결 합니다.</li>
	<li>유리 피 펫에 Ag Cl 코팅 실버 와이어 (직경에서 0.2 m m)를 넣어. 실버 와이어를 핀을 통해 얇은 코팅된 전기 와이어를 연결 합니다. 녹음 앰프의 headstage에 핀을 연결 합니다.</li>
	<li>광섬유 패치 코드를 연결 (코어 = 960 µ m, 클 래 딩 1000 µ m, NA = = 0.63) 지 르 코니 아 깃 봉을 가진 (OD = 2.5 m m) optrode 홀더에 소매 짝짓기 분할. 아무의 팁 연락처 유리 피 펫의 뒷면까지 소매에 패치 코드를 밀어. 패치 코드 제공 빛 (파장 = 465 nm) LED에서. LED 빛은 단일 채널 LED 드라이버에 의해 제어 됩니다.</li>
	<li>craniotomy 통해 실리콘 접착제를 제거 합니다. 넣어 예 열된 염 분 (38 ° C) 기록 세션 동안 건조에서 뇌 표면 방지 하기 위해 주기적으로 뇌 표면에. 필요한 경우 날카로운 핀셋으로 경질을 제거 합니다.</li>
	<li>유리 전극 조작자와 뇌 조직에 삽입 합니다. 이 삽입 될 때 전극 저항을 모니터링 합니다. 저항 되는 전극의 팁 손상 될 수 있습니다 때문에 예상 보다 낮은 전극을 교체 합니다. 관심의 깊이에서 검색 하 고 2 ~ 5 µ m 단계에 깊이 조정 하 여 단일 단위 스파이크를 분리 합니다.</li>
	<li>단일 단위 격리 된 후에, LED 빛을 전달 하 고 빛 자극에 응답을 관찰.</li>
	<li>세포 유형의 식별 후 신경 활동을 기록 합니다. 2-3 h에 대 한 녹음을 수행 합니다. 녹음에서 만든 연속 일 (최대 2 일의), 경우 실리콘 접착제 craniotomy 커버. 녹음을 완료 하 고 동물 희생, 머리 게시물을 검색 하 고 세척 하 고 그것을 다시 아세톤에 넣어.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neural+circuits.">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li><li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons:+triumphs+and+challenges.">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).</li><li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. 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V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation.">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li><li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons.">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

Optogenetics 신경 과학에 강력한 도구가 되고있다. 그것은 특정 신경 통로의 활동을 조작 뿐만 아니라 특정 신경 형식에서을 식별 비보에 이용 되었습니다. 신경 종류의 신경 활동의 명확한 신경 회로의 메커니즘의 이해를 촉진합니다. 여기, 우리는 깨어 VGAT ChR2 쥐의 IC에 유리 전극을 통해 녹음 사이트에 빛을 전달 하는 방법을 설명 했다.
설명 하는 방법을 몇 가지 중요 ?...

다양 한 종류의 다른 기능을 하는 신경 중추에 의하여 이루어져 있다. 이러한 서로 다른 유형의 신경 신경 회로 내에서 작동 하는 어떻게 신경 과학에서 중요 한 관심사 중 하나입니다. 그러나, 많은 두뇌 지구에서 그것은 되었습니다 하지 몇 가지 예외와 함께 전기 스파이크 신호 자체에 분명 차이가 있기 때문에 전기 활동의 비보에 녹음에 신경 종류를 구별 하는 것. Optogenetics의 최근 발전 돌파구1,2를 만들었습니다. 빛에 민감한 opsin (예를 들어, channelrhodopsin-2) 특정 신경 종류에 표현 하는 유전자 변형 동물을 사용 하 여, 그것은 되었다 vivo에서 녹음3, 에서 효율적으로 신경 종류를 구별할 수 4,,56. 이 동물에 빛에 민감한 opsin와 뉴런 전기 녹음 하는 동안 가벼운 자극을 제공 하 여 흥분 하지만 다른 신경 있습니다. Opsin 양성 신경, 따라서 쉽게 구별 된다 다른 신경 종류에서 빛에 대 한 답변으로.
Optogenetics 실험, 그것이 기록 사이트에 빛을 전달 하기 위해 중요 합니다. 비-침략 적 방법으로 빛은 종종 뇌의 표면에서 감독. 그러나, 빛의 강도 감소 뇌 조직 속으로, 때문에 두뇌의 표면에서 깊은 두뇌 지구를 자극 하기 어렵다. 특히, 그것은 종종 깨어 있는 동물에서 녹음의 경우 뇌 표면의 광 투명성은 낮은, 깊은 두뇌 지역 도달 자극 빛 어렵습니다. 마 취 동물에 electrophysiological 실험 자주 수행 되었습니다 몸 움직임 녹음에 잡음을 발생 하기 때문에. 그러나 잘 설명 된 대로, 마 취 신경 응답7,8,,910변경으로 알려져 있다. 따라서, 그것은 깨어 있는 동물을 사용 하 여 마 취의 인공 효과 없이 신경 응답을 공부 하기 위하여 필요가 있다. 마 취 동물 실험, 달리 electrophysiological 녹음 깨어 동물 실험에서 수술에서 회복 후 수행 됩니다. 수술과 기록 사이 간격 동안 조직 exudate 자주 뇌 표면에 축적 하 고 낮은 뇌 표면의 광 투명성을 만든다.
여기, 우리는 주문 품 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 단일 단위 기록 기록 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에서는, 빛은 안정적으로 깊은 두뇌 지구에서 빛으로 기록 된 신경 자극 수 있도록 녹음 유리 전극을 통해 배달 됩니다. 이 주문 품 optrode 시스템 접근 가능 하 고 저렴 한 재료를 이루어져 있고 조립 하기 쉽습니다.

<table><tbody><tr><td>Electrode holder</td><td>Molecular Device</td><td>1-HL-U</td><td>pipette holder for microelectrode amplifier</td></tr><tr><td>Ceramic split mating sleeve</td><td>Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>f2.5 mm ferrule</td></tr><tr><td>Circuit board spacer</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>f8.0 mm, 20.0 mm long</td></tr><tr><td>Stereotaxic frame for mice</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>Stereotaxic instruments for mice</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>Manual manipulator</td></tr><tr><td>Superbond</td><td>Sun Medical</td><td>M: 204610557</td><td>Dental adhesive resin cement</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td>NA</td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>Low toxicity silicone adhesive</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long</td></tr><tr><td>Fiber-optic patch cord</td><td>Doric Lenses</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63</td></tr><tr><td>Connectrized LED</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDC-1B_FC</td><td>Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA )</td></tr><tr><td>LED driver</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDRV_1CH_1000</td><td>1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA</td></tr><tr><td>Electrode puller</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>Dual-stage glass micropipette puller</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., Ltd</td><td>185711173</td><td>Antibiotic ointment</td></tr><tr><td>Terramycin&amp;reg;-LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>Oxytetracycline</td></tr><tr><td>Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td><td>Jackson Labs</td><td>#14548</td><td>VGAT-ChR2 mice</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>Microelectrode amplifier</td></tr></tbody></table>

optogenetics identification of a neuronal type with a glass optrode in awake mice

그것은 어떻게 다른 신경 과학에서 중요 한 관심사 종류 뉴런의 신경 회로에서 작동. Optogenetics의 최근 발전은 광범위 한 뇌 영역에 vivo에서 electrophysiological 실험에서 신경 유형 식별을 활성화 했습니다. Optogenetics 실험, 그것이 기록 사이트에 빛을 전달 하기 위해 중요 합니다. 그러나, 그것은 종종 뇌의 표면에서 깊은 두뇌 영역을 자극 빛을 제공 어렵다입니다. 특히, 그것은 종종 깨어 있는 동물에서 녹음의 경우 뇌 표면의 광 투명성은 낮은, 깊은 두뇌 지역 도달 자극 빛 어렵습니다. 여기, 우리는 주문 품 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 빛을 스파이크 응답 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에서는, 빛은 안정적으로 깊은 두뇌 지구에서 빛으로 기록 된 신경 자극 수 있도록 녹음 유리 전극을 통해 배달 됩니다. 이 주문 품 optrode 시스템 접근 가능 하 고 저렴 한 재료를 이루어져 있고 조립 하기 쉽습니다.

그림 2, 우리는 팁 크기의 효과 유리 펫 펫 (그림 2A-B)의 끝에 빛 파워에의 길이 검사합니다. 가벼운 힘 1 m m 팁에서 배치 하는 광 파워 미터에 의해 측정 되었다. 팁 크기 전체 길이 변화 때 2.5 µ m 팁 크기 설정 하는 동안, 변화 하는 때 전체 길이 50 ± 2 mm로 설정 되었습니다. 유리 피 펫의 샹 크 8 m m로 설정 되었습니다...

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Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

깨어 있는 쥐에 유리 Optrode 신경 형식의 Optogenetics 식별

이 작품은 optogenetic 단일-단위 맞춤 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 안정적으로 녹화를 수행 하는 방법을 소개 합니다.

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

optogenetics-identification-neuronal-type-with-glass-optrode-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.7K 조회수.  Kanazawa Medical University. 이 작품은 optogenetic 단일-단위 맞춤 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 안정적으로 녹화를 수행 하는 방법을 소개 합니다.

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Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

연구

신경과학

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

행동분석학

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

에 가이드<em&gt; 생체</emOptogenetically 확인 된 대뇌 피질의 억제의 interneurons에서&gt; 단일 단위 기록

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

청각 통로의 Optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

마우스에서 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학 적 조작

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective neural modulation or monitoring. As specific types of neuronal cells can be genetically modified to express opsin proteins, optogenetics enables optical stimulation or inhibition of the selected neurons. There have been several technological advances in the optical system for optogenetics. Recently, it was proposed to combine the optical waveguide for light delivery with electrophysiological recording to simultaneously monitor the neural responses to optogenetic stimulation or inhibition. In this study, an implantable optrode array (2x2 optical fibers) was developed with embedded multichannel electrodes. 
A light-emitting diode (LED) was employed as a light source, and a microfabricated microlens array was integrated to provide sufficient light power at the tip of the optical fibers. The optrode array system comprises the disposable part and the reusable part. The disposable part has optical fibers and electrodes, while the reusable part has the LED and electronic circuitry for light control and neural signal processing. The novel design of the implantable optrode array system is introduced in the accompanying video in addition to the procedure of the optrode implantation surgery, optogenetic light stimulation, and the electrophysiological neural recording. The results of in vivo experiments successfully showed time-locked neural spikes evoked by the light stimuli from hippocampal excitatory neurons of mice.

Here, we present the fabrication method of an optrode system with optical fibers for light delivery and an electrode array for neural recording. In vivo experiments with transgenic mice expressing channelrhodopsin-2 show the feasibility of the system for simultaneous optogenetic stimulation and electrophysiological recording.

동시 광유전학적 변조 및 전기 신경 기록을 위한 광섬유 어레이

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective ...

깨어 있는 쥐에 유리 Optrode 신경 형식의 Optogenetics 식별

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는 방법

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

에 가이드

청각 통로의 Optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

마우스에서 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학 적 조작

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