الكتاب تؤيدها الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم كاكينهي منحة JP16K11200 وح 17 02223، والمنحة لتمويل البحوث من كانازاوا الطبية جامعة S2016-8 و C2017 3. ونشكر يوهيتشي كودا لدعمه في أخذ الصور.

وتتم جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية من "المجتمع اليابانية الفيزيولوجية" ومع الموافقة على الحيوان رعاية اللجنة كانازاوا الطبية جامعة.
1-بناء على حامل أوبترودي الزجاج
ملاحظة: لإنشاء حامل أوبترودي زجاج، حامل قطب تجاري يستخدم (الشكل 1A).
<ol><li>بلطف سحب أنبوب الصلب للتحكم في الضغط من فوهة الحامل.</li>
	<li>بالحفر وتوسيع ثقب الجانب المقعد دبوس في برميل حامل. جعل الحفرة 3 مم وقطرها 12 مم في العمق.</li>
	<li>وضع أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ (3 مم في القطر 0.5 مم في السمك و 8 مم في الطول؛ الشكل 1A 2) في الحفرة.</li>
	<li>إدراج سيراميك تقسيم الحفرة الأكمام التزاوج للحلقات, ومم ⌀2.5 (1A الشكل1).</li>
	<li>إصلاح ماسورة صاحب القطب إلى وصلة على شكل L مع لاصق الإيبوكسي.</li>
	<li>جعل الثقوب (3 مم في القطر) في وصلة وإرفاقه مناور بمسامير.</li>
</ol>2-رئيس مرحلة ما بعد التثبيت
<ol><li>تعد وظيفة رئيس مبنية خصيصا لفاصل حلبة المجلس. جعل فاصل عمودي مجلس الدائرة إلى شكل كوبويدال مع قطع طحن ومقطعة 2 وظيفة الرأس مع رأي (الشكل 1B). تسطيح الجزء السفلي من وظيفة الرأس مع قطع طحن.</li>
	<li>إعداد الحيوانات المحورة وراثيا الذي أعرب فيه عن أوبسين حساسة للضوء في نوع معين من الخلايا العصبية للدراسة. في هذا العمل، استخدام الماوس المحورة وراثيا (الفئران ChR2 فجأت) الذي يعرب عن الخلايا العصبية المثبطة تشانيلرهودوبسين-2 (ChR2)11 .</li>
	<li>تخدير الحيوان مع خليط من 0.3 ملغ/كغ ميديتوميديني و 4.0 مغ/كغ من الميدازولام 5.0 مغ/كغ من بوتورفانول داخل الإدارة. للتأكد من أن الحيوان تم تخديره تماما، اختبار ردود أفعاله إلى الذيل معسر.</li>
	<li>ضع الماوس في إطار ستيريوتاكسيك على وسادة تدفئة. تنظيف الإطار ستيريوتاكسيك والتدفئة لوحة بالكحول 70% مقدما. وضع الأسنان في الحفرة الشريط لدغة، وتشديد طفيفة المشبك الآنف. إصلاح كلا الجانبين من الرأس باستخدام أشرطة الإذن. عند الرأس ثابتة بشكل صحيح بأشرطة الإذن، تشديد المشبك الآنف. تطبيق مرهم العيون إلى العيون.</li>
	<li>الحلاقة جلد الرأس مع مقص صغير وتنظيف فروة الرأس مع مسحه القطن من غلوكونات الكلورهيكسيدين. قبل الجراحة، تعقيم جميع الأدوات الجراحية ورأس آخر مع اﻷوتوكﻻف (121 درجة مئوية، 15 دقيقة).</li>
	<li>قص فروة الرأس على طول خط الوسط مع المقص ودفعها جانبا. جعل الشق من الجزء الخلفي الرأس إلى العيون (حوالي 20 مم). إزالة في السمحاق مع مسحه القطن مغموسة في الكحول 70% وجاف في الجمجمة.</li>
	<li>إرفاق منصب رئيس المناول. ضع منصب رئيس شقة في الجمجمة حول بريجما استخدام المناول.</li>
	<li>مزيج مركب (4 قطرات)، ومحفِّز (قطره 1)، والبوليمر (1 ملعقة صغيرة) من الأسمنت الأسنان على طبق صغير هو مبردة في الثلاجة مسبقاً. وضع الأسمنت الأسنان (أقل من 1 غ) أمامي والعظم الجداري الجمجمة لإصلاح هذا المنصب الرئيسي في الجمجمة.</li>
	<li>بعد أن يصبح الأسمنت الأسنان الثابت، إزالة الماوس من الإطار ستيريوتاكسيك. وضع مرهم مضاد حيوي على البشرة المكشوفة. إدخال خصم ميديتوميديني (0.3 مغ/كغ) والمضادات الحيوية (أوكسي تتراسيكيلين؛ 20 مغ/كغ). وضع ورصد الماوس على لوحة الحرارة في قفص حتى أنه يصحو، وإعادته إلى قفص إسكان.</li>
	<li>بيت الحيوان في قفص إسكان فردية مع بعض الأجهزة في تخصيب اليورانيوم. تغيير الورقة الحيوان الفراش يوميا الحفاظ على نظافة القفص ومنع العدوى. ترصد بدقة ما إذا كان هذا الحيوان يظهر أي علامة على عدم الراحة. تطبيق ليدوكائين على الجرح إذا كان يشتبه بأي ألم. ميلوكسيكام إدارة أو والايبوبروفين مرة كل 24 ساعة عن 48 ساعة بعد كل رئيس بعد جراحات التثبيت واوديما. يمكن إعطاء الليدوكايين المحلية بالإضافة إلى ذلك إذا لم تكن كافية الأدوية المضادة للالتهاب.
</li>
</ol>3-التأقلم
<ol><li>(الحد الأدنى) بعد يومين التعافي من التخدير، تأقلم الحيوانات للدولة رئيس--الثابتة في دائرة التسجيل. إجراء دورات التأقلم لمدة 5 أيام على الأقل.</li>
	<li>خلال دورات التأقلم، وضع الحيوان في دائرة تسجيل مع منصب رئيس ثابت المشبك مبنية خصيصا. خلال الدورة، بغية الحد من الحركة، التي تغطي الجسم مع أنبوب نصف راتنج مصنوعة خصيصا (الشكل 1)، استخدام طابعة ثلاثية الأبعاد. ملاحظة: في يوم 1، ينبغي أن تكون الدورة التأقلم 5 دقيقة طويلة. فإنه ثم تزداد يوميا إلى 10 و 20, 40، و 60 دقيقة لأيام 2، 3، 4، و 5، على التوالي.</li>
	<li>في نهاية كل دورة، إعطاء الحيوان مكافأة غذاء. إذا كان الحيوان تناضل باستمرار خلال التأقلم، توقف الدورة.</li>
</ol>4-اوديما
ملاحظة: بعد التأقلم، يرصد اوديما عبر منطقة الدماغ لتسجيل. يتم تنفيذ في اوديما في الإطار ستيريوتاكسيك تحت التخدير، كما مع الرئيس آخر التثبيت. إجراءات ما بعد العملية هو نفسه كالرئيس في مرحلة ما بعد التثبيت.
<ol><li>قبل اوديما، تنظيف الجمجمة مع مسحه القطن بالكحول 70% وغلوكونات الكلورهيكسيدين.</li>
	<li>كشط الجمجمة عبر موقع التسجيل مع حفر أسنان بعناية. عندما تصبح العظام رقيقة ما يكفي، قطع عليه مع طرف دون مشرط وإزالته.</li>
	<li>وضع الأسمنت الأسنان حول منطقة مكشوفة وتعزيزا للجمجمة.</li>
	<li>تغطي منطقة الدماغ مكشوفة مع لاصق السيليكون بعد الأسمنت الأسنان يصبح من الصعب. يتم إجراء جراحة بعد كما هو موضح في الخطوة 2.8.</li>
</ol>5-تسجيل الكهربية
<ol><li>السماح للحيوان لاسترداد لمدة يوم واحد على الأقل بعد اوديما قبل إجراء تسجيل الكهربية. ضع الحيوان في قاعة التسجيل بنفس الطريقة التي تم القيام به خلال دورات التأقلم عند بدء تشغيل التسجيل.</li>
	<li>جعل الزجاج الماصات من زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية (OD = 1.5 ملم، معرف = 0.9 مم، طويلة 90.0 مم) سحبت على ساحبة كهربائي. هو تلميح قطرها 2 – 3 ميكرومتر، ومقاومتهم MΩ 4 – 6 عندما كانت تمتلئ 10 ملم برنامج تلفزيوني. طول مسرى 40-50 ملم. في بعض التسجيلات، تتم إضافة نيوروبيوتين 2% إلى 10 ملم من برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>إرفاق ماصة زجاجية مليئة بحامل أوبترودي مصنوعة خصيصا.</li>
	<li>وضع سلك الفضة Ag-Cl المغلفة (0.2 مم في القطر) ماصة زجاجية. قم بتوصيل الأسلاك الفضية دبوس عبر أسلاك كهربائية مغلفة رقيقة. قم بتوصيل pin هيدستاجي لتسجيل مكبر للصوت.</li>
	<li>قم بتوصيل سلك التصحيح الألياف البصرية (الأساسية = 960 ميكرومتر، الكسوة = 1,000 ميكرومتر، غ = 0.63) مع التسليح زركونيا (OD = 2.5 ملم) إلى سبليت التزاوج الأكمام على حامل أوبترودي. ادفع الحبل التصحيح في الأكمام حتى اتصالات غيض التسليح الجزء الخلفي ماصة زجاجية. يسلم الحبل التصحيح الضوء (الطول الموجي = 465 nm) من الصمام. ويسيطر على ضوء LED برنامج تشغيل الصمام قناة واحدة.</li>
	<li>إزالة لاصق السيليكون اوديما. وضع حرارة المحلول الملحي (38 درجة مئوية) على سطح الدماغ دورياً لمنع سطح الدماغ من جفاف خلال الدورة تسجيل. إذا لزم الأمر، إزالة في بلده دوراً بالملقط حادة.</li>
	<li>إدراج مسرى الزجاج في أنسجة المخ مع مناور. رصد مقاومة قطب كهربائي عندما يتم إدراجها. استبدال الكهربائي عند المقاومة أقل مما كان متوقعا لأنه قد يكون معطوباً غيض مسرى. في عمق الفائدة، البحث وعزل التموج وحدة واحدة عن طريق ضبط العمق في الخطوات 2 إلى 5 ميكرومتر.</li>
	<li>بعد وحدة وحيدة منعزلة، تسليم الصمام الخفيفة ومراقبة الاستجابة للمحفزات الخفيفة.</li>
	<li>سجل الأنشطة العصبية بعد تحديد أنواع الخلايا. إجراء التسجيلات ح 2 – 3. إذا كان يتم إجراء التسجيل في أيام متتالية (الحد الأقصى من أيام 2)، تغطي اوديما مع لاصق سيليكون. عند الانتهاء من التسجيل، وهو التضحية بالحيوان، استرداد منصب رئيس ووضعها في الأسيتون تغسل وإعادة استخدامها.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neural+circuits.">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li><li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons:+triumphs+and+challenges.">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).</li><li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+mouse+inferior+colliculus+share+similar+response+properties.">Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).</li><li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+sound-evoked+afterdischarge+in+the+auditory+midbrain.">Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain.</a> Scientific Reports. 6, 20757 (2016).</li><li>Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-assisted+patching:+in+vivo+recording+of+genetically+and+morphologically+identified+neurons+throughout+the+brain.">Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain.</a> Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).</li><li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINP:+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording.">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4 (7), e6099 (2009).</li><li>Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monaural+and+binaural+response+properties+of+neurons+in+the+inferior+colliculus+of+the+rabbit:+effects+of+sodium+pentobarbital.">Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital.</a> Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).</li><li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetics+change+the+excitation/inhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus.">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).</li><li>Duque, D., Malmierca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-specific+adaptation+in+the+inferior+colliculus+of+the+mouse:+anesthesia+and+spontaneous+activity+effects.">Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects.</a> Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).</li><li>Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+predictable+versus+random+temporally+complex+stimuli+from+single+units+in+auditory+thalamus:+impact+of+aging+and+anesthesia.">Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia.</a> Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+GABAergic+neurons+in+the+inferior+colliculus.">Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).</li><li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse:+electrophysiological+and+morphological+properties.">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+using+Thy1-GCaMP+transgenic+mice.">Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice.</a> Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).</li><li>Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recording+of+fluorescence+and+electrical+signals+by+photometric+patch+electrode+in+deep+brain+regions+in+vivo.">Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).</li><li>LeChasseur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microprobe+for+parallel+optical+and+electrical+recordings+from+single+neurons+in+vivo.">A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo.</a> Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).</li><li>Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation.">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li><li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons.">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

أوبتوجينيتيكس أصبحت أداة قوية في علم الأعصاب. وقد استخدمت لتحديد الخلايا العصبية محددة أنواع في فيفو ، فضلا عن التلاعب بأنشطة محددة المسارات العصبية. توضيح الأنشطة العصبية من مختلف أنواع الخلايا العصبية تعزز فهم إليه الدوائر العصبية. هنا، نحن أثبتت طريقة لإيصال الضوء إلى موقع التسج?...

الجهاز العصبي المركزي يتكون من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية، التي لها وظائف مختلفة. كيف تعمل هذه الأنواع المختلفة من الخلايا العصبية داخل الدائرة العصبية أحد الشواغل الرئيسية في علم الأعصاب. ومع ذلك، في العديد من مناطق الدماغ، كان من المستحيل التمييز بين أنواع الخلايا العصبية في التسجيلات في فيفو الأنشطة الكهربائية لأنه لا يوجد أي اختلاف واضح في الإشارة الكهربائية سبايك نفسها، مع بعض الاستثناءات. التقدم الذي أحرز مؤخرا في أوبتوجينيتيكس جعلت اختراق1،2. استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا التي يتم التعبير عن أوبسين حساسة للضوء (مثلاً، تشانيلرهودوبسين-2) في أنواع معينة من الخلايا العصبية، أصبح من الممكن التمييز بين أنواع الخلايا العصبية في كفاءة في فيفو تسجيلات3، 45،،6. في هذه الحيوانات، متحمسون الخلايا العصبية مع opsin حساسة للضوء بإعطاء المنبهات الخفيفة خلال التسجيلات الكهربائية، ولكن لا تكون الخلايا العصبية الأخرى. الخلايا العصبية أوبسين-إيجابية، ولذلك بسهولة تتميز عن سائر أنواع الخلايا العصبية بردودهم على ضوء.
في تجارب أوبتوجينيتيكس، أنها حاسمة بالنسبة لإيصال الضوء إلى موقع التسجيل. كطريقة غير الغازية، كثيرا ما يوجه الضوء من سطح الدماغ. ومع ذلك، لأنه يقلل القوة على ضوء ما يذهب من خلال أنسجة المخ، من الصعب أن تحفيز مناطق الدماغ العميقة من السطح في الدماغ. وبخاصة، من الصعب على ضوء التحفيز للوصول إلى مناطق الدماغ العميق عند الشفافية الضوئية من سطح الدماغ منخفض، كما الحال بالنسبة لتسجيلات من الحيوانات مستيقظا غالباً. وكثيراً ما تم إجراء التجارب الكهربية على الحيوانات تخديره لحركة الجسم يسبب الضوضاء في التسجيلات. كما هو موثق جيدا، إلا أن التخدير المعروف لتغيير الاستجابات العصبية7،،من89،10. وبالتالي، من الضروري استخدام الحيوانات مستيقظا من أجل دراسة الاستجابات العصبية دون آثار التخدير الاصطناعي. على عكس التجارب مع الحيوانات تخديره، تتم التسجيلات الكهربية بعد الشفاء من جراحة في التجارب مع الحيوانات مستيقظا. أثناء الفاصل الزمني بين الجراحة والتسجيلات، الإفرازات الأنسجة كثيرا ما يتراكم على سطح الدماغ ويجعل الشفافية الضوئية من سطح الدماغ منخفضة.
هنا، نحن تصف طريقة لتسجيل تسجيلات وحدة واحدة من ماوس مستيقظا استخدام أوبترودي من زجاج مصنوعة خصيصا. في هذا الأسلوب، يتم تسليم الضوء من خلال تسجيل الزجاج الكهربائي حيث أنه من الممكن أن تحفز موثوق العصبية مسجل مع الضوء في المناطق العميقة من الدماغ. هذا النظام أوبترودي مصنوعة خصيصا ويتألف من مواد متاحة وغير مكلفة وسهلة لتجميع.

<table><tbody><tr><td>Electrode holder</td><td>Molecular Device</td><td>1-HL-U</td><td>pipette holder for microelectrode amplifier</td></tr><tr><td>Ceramic split mating sleeve</td><td>Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>f2.5 mm ferrule</td></tr><tr><td>Circuit board spacer</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>f8.0 mm, 20.0 mm long</td></tr><tr><td>Stereotaxic frame for mice</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>Stereotaxic instruments for mice</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>Manual manipulator</td></tr><tr><td>Superbond</td><td>Sun Medical</td><td>M: 204610557</td><td>Dental adhesive resin cement</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td>NA</td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>Low toxicity silicone adhesive</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long</td></tr><tr><td>Fiber-optic patch cord</td><td>Doric Lenses</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63</td></tr><tr><td>Connectrized LED</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDC-1B_FC</td><td>Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA )</td></tr><tr><td>LED driver</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDRV_1CH_1000</td><td>1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA</td></tr><tr><td>Electrode puller</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>Dual-stage glass micropipette puller</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., Ltd</td><td>185711173</td><td>Antibiotic ointment</td></tr><tr><td>Terramycin&amp;reg;-LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>Oxytetracycline</td></tr><tr><td>Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td><td>Jackson Labs</td><td>#14548</td><td>VGAT-ChR2 mice</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>Microelectrode amplifier</td></tr></tbody></table>

optogenetics identification of a neuronal type with a glass optrode in awake mice

مصدر قلق كبير في علم الأعصاب كيف مختلف أنواع الخلايا العصبية تعمل في الدوائر العصبية. وقد مكنت التقدم الذي أحرز مؤخرا في أوبتوجينيتيكس تحديد نوع الخلايا العصبية في فيفو التجارب الكهربية في مناطق واسعة من الدماغ. في تجارب أوبتوجينيتيكس، أنها حاسمة بالنسبة لإيصال الضوء إلى موقع التسجيل. ومع ذلك، من الصعب غالباً ما يسلم على ضوء التحفيز في المناطق العميقة من الدماغ من سطح الدماغ. وبخاصة، من الصعب على ضوء التحفيز للوصول إلى مناطق الدماغ العميق عند الشفافية الضوئية من سطح الدماغ منخفض، كما الحال بالنسبة لتسجيلات من الحيوانات مستيقظا غالباً. هنا، نحن تصف طريقة لتسجيل استجابات سبايك للضوء من ماوس مستيقظا استخدام أوبترودي من زجاج مصنوعة خصيصا. في هذا الأسلوب، يتم تسليم الضوء من خلال تسجيل الزجاج الكهربائي حيث أنه من الممكن أن تحفز موثوق العصبية مسجل مع الضوء في المناطق العميقة من الدماغ. هذا النظام أوبترودي مصنوعة خصيصا ويتألف من مواد متاحة وغير مكلفة وسهلة لتجميع.

في الشكل 2، قمنا بدراسة آثار حجم تلميح وطول الماصات الزجاجية على طاقة الضوء في غيض الماصات (الشكل 2 أ-ب). تم قياس قوة الضوء بعداد طاقة ضوئية وضع 1 ملم بعيداً عن الحافة. تم تعيين طول كامل إلى 50 ± 2 مم عند اختلاف حجم تلميح، بينما تم تعيين ...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice at JoVE.com

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

تحديد نوع الخلايا العصبية مع أوبترودي زجاج في الفئران مستيقظا أوبتوجينيتيكس

ويدخل هذا العمل وسيلة لأداء وحدة-أوبتوجينيتيك واحد تسجيل موثوق من ماوس مستيقظا استخدام أوبترودي من زجاج مصنوعة خصيصا.

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

optogenetics-identification-neuronal-type-with-glass-optrode-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.7K Views.  Kanazawa Medical University. ويدخل هذا العمل وسيلة لأداء وحدة-أوبتوجينيتيك واحد تسجيل موثوق من ماوس مستيقظا استخدام أوبترودي من زجاج مصنوعة خصيصا.

Video: Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

توصيف بالسكان خلية كهربية من GFP - يعرب عن السليمة في الشبكية

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

وهناك طريقة للتحكم عالي الدقة Optogenetic من الخلايا العصبية الفردية الهرمية<em&gt; في الجسم الحي</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

الليزر مسح ضوئي للدوائر الدماغ الأمامي المستهدفة Optogenetically

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

Optogenetic التلاعب بالنشاط العصبي لتعديل السلوك في الفئران تتحرك بحرية

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Behavior

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

دليل ل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تسجيل وحدة واحدة من التي تم تحديدها Optogenetically القشرية التثبيطي Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

التصور المباشر من الفئران الظهرية القوقعة نواة لOptogenetic تحفيز من المسار السمعي

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

موجهة بالليزر العصبية للبحث عن المفقودين في إإكسبلنتس الدماغ

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

التلاعب الجيني البصري للدوائر العصبية أثناء مراقبة حالات النوم/اليقظة في الفئران

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective neural modulation or monitoring. As specific types of neuronal cells can be genetically modified to express opsin proteins, optogenetics enables optical stimulation or inhibition of the selected neurons. There have been several technological advances in the optical system for optogenetics. Recently, it was proposed to combine the optical waveguide for light delivery with electrophysiological recording to simultaneously monitor the neural responses to optogenetic stimulation or inhibition. In this study, an implantable optrode array (2x2 optical fibers) was developed with embedded multichannel electrodes. 
A light-emitting diode (LED) was employed as a light source, and a microfabricated microlens array was integrated to provide sufficient light power at the tip of the optical fibers. The optrode array system comprises the disposable part and the reusable part. The disposable part has optical fibers and electrodes, while the reusable part has the LED and electronic circuitry for light control and neural signal processing. The novel design of the implantable optrode array system is introduced in the accompanying video in addition to the procedure of the optrode implantation surgery, optogenetic light stimulation, and the electrophysiological neural recording. The results of in vivo experiments successfully showed time-locked neural spikes evoked by the light stimuli from hippocampal excitatory neurons of mice.

Here, we present the fabrication method of an optrode system with optical fibers for light delivery and an electrode array for neural recording. In vivo experiments with transgenic mice expressing channelrhodopsin-2 show the feasibility of the system for simultaneous optogenetic stimulation and electrophysiological recording.

مصفوفة Optrode للتعديل البصري الوراثي المتزامن والتسجيل العصبي الكهربائي

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective ...

تحديد نوع الخلايا العصبية مع أوبترودي زجاج في الفئران مستيقظا أوبتوجينيتيكس

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video