עבודה זו נתמכה על ידי המחקר מפתח הלאומי ועל פיתוח תוכנית של סין (2017YFA0104604), התוכנית הכללית של נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (NSFC, 81772093), מדע, טכנולוגיה פיתוח תוכנית של סאזהאו (ZXL2015128), את מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (BK20161241), ופרס של שאנדונג טאישאן מלומד (tshw201502065).

ברקמות אנושיות בשימוש פרוטוקול זה יטופל בהתאם לקווים המנחים של ועדת האתיקה האנושית המחקר של המוסד (NO.2015120401, תאריך: מאי 12, 2015).
1. תכשירים
<ol><li>רקמות לאסוף טריים בעור בטן למבוגרים שנמחקו מן לכירורגיה פלסטית בבית החולים, שפופרת 50-mL עם 10 מ"ל של Dulbecco קר כקרח המתואמת של הנשר בינוני (DMEM). ניתן לשמור את הדגימה ב 4 ° C עבור עד 72 שעות מבלי להשפיע באופן משמעותי את הכדאיות התא.</li>
	<li>להכין את ריאגנטים תרבות בינוני כפי שמתואר להלן.<ol>
<li>להוסיף 1 מ"ל של פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 מ ג/ליטר) 50 מ של פתרון באגירה פוספט (PBS) כדי להכין את הפתרון כביסה.</li>
		<li>להכין שני סטים של אנזים עיכול פתרונות: (1) להכין 50 מ של dispase (2.5 מ"ג/מ"ל ב- DMEM), 50 מ של סוג אני collagenase (2.5 מ"ג/מ"ל ב- DMEM) בנפרד עבור השיטה המקובלת; (2) להכין 50 מ של תערובת של dispase, מסוג collagenase (התמוססות 125 מ ג של אבקת dispase ו- 125 מ"ג של להקליד אני אבקת collagenase 50 מ של DMEM) על השיטה החדשה. הערה: כל הפתרונות אנזים צריך להיות מסונן עם מסננת 0.22-מיקרומטר, המשיכה חברת at4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הכנת מערכת העיכול פתרונות עבור שתי שיטות: 0.05% טריפסין, 0.25% טריפסין נרכשו מסחרית. הכינו 10 mg/mL DNase אני הפתרון על ידי המסת 50 מ"ג של DNase אני לפדר ב 5 מ של PBS, תסנן את זה עם מסננת 0.22-מיקרומטר, ואחסן אותו ב-20 ° C.</li>
		<li>הכנת 500 מ"ל של מדיום כדי לנטרל. את עיכול אנזימטי: בינוני DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין.</li>
		<li>הכנת 500 מ"ל של חיסון בינוני (צמיחה פקטור-המכילות בינוני, בשם G-בינוני): DMEM/F12 בינונית (3:1) המכיל 1% פניצילין/סטרפטומיצין, fungizone µg/mL 40, 40 ng/mL פיברובלסט גורם גידול 2 (FGF2), 20 ng/mL גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), ו תוספת 2% B27.</li>
		<li>Pretreat תרבית תאים מ מ 100 מנות עם 2 מ של ציפוי מטריצה המכילה סוג אני קולגן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. השיטה המקובלת
<ol><li>
רעלני רקמת העור
	<ol>
<li>קח 1.5 ס מ2 של רקמת העור ולשטוף אותו x 1 עם 10 מ"ל של PBS; לאחר מכן, לשטוף אותו עם 10 מ"ל אתנול 70%-30 s דגירה זה 2 x עם 10 מ"ל לרחוץ את הפתרון (PBS המכיל 2% פניצילין, סטרפטומיצין), 5 דקות כל אחד. הערה: כל שוטף מבוצעות במנות תרבות תא 100-מ מ בתוך תא למינארי.</li>
		<li>חתוך את הרקמה במספריים סטרילי כדי להסיר את שכבת השומן התת עורית בצלחת תרבות תא 100-מ מ, ואז, שוקל רקמת העור (המשקל הוא 1 g בפרוטוקול זה). הערה: זמירה מספקת חיונית מאוד ההפרדה יעיל של האפידרמיס של הדרמיס. שכבת השומן צהבהב ניתן בקלות להבחין ויזואלית.</li>
		<li>להעביר הרקמה תבשיל סטרילי אחר של 100 מ מ עם הצד הדרמיס למטה וחותכים, ואז, רקמת העור לרצועות 3 ל 4-מ מכולו באמצעות להב סכין. הערה: הצד הדרמיס עם שכבת השומן בקלות מזוהה מבחינה ויזואלית.</li>
		<li>הוסף 10 מ"ל של 2.5 מ"ג/מ"ל dispase פתרון לרקמות העור בצלחת 100-מ מ תרבות ', לאחר מכן, דגירה המנה בין לילה ב 4 ° C (לא יותר מ- 20 h). הערה: ניתן לחשב את כמות dispase פתרון באמצעות 10 מ"ל של dispase פתרון למערכת העיכול של כל גרם של רקמת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ההפרדה של האפידרמיס של רקמת העור
	<ol>
<li>ביום השני, לקלף האפידרמיס של הדרמיס באמצעות פינצטה משובחים. הערה: אם קשה לקלף את האפידרמיס, עיכול dispase לא הספיק, שהוא בדרך כלל עקב מחסור חיתוך של הרקמה. במקרה זה, הרקמה צריך זמן דגירה ארוך יותר.</li>
		<li>מינצ האפידרמיס קלופים עם 500 µL תא תרבות בינוני לתוך slurry רקמות באמצעות להבים ומהדקים; לאחר מכן, resuspend זה עם 10 מ"ל של 0.25% טריפסין בשפופרת 50-mL, דגירה זה 20 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C, ברעידות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ואוסף culturing התאים הראשי
	<ol>
<li>לנטרל את פעילות טריפסין על-ידי הוספת אמצעי שווה של פתרון ניטרול (10 מ"ל ב פרוטוקול זה).</li>
		<li>מביצועם התאים באפידרמיס מאת pipetting הפתרון לכל אורך 20 x עם פיפטה סרולוגית 10-mL ולהעביר את הפתרון הסלולרי דרך מסננת תא 100-מיקרומטר כדי להסיר את כל פסולת רקמות שיורית.</li>
		<li>Centrifuge הפתרון תא ב x 200 גרם במשך 5 דקות לאחר סינון; resuspend בגדר תא במדיום ניטרול לרחצה, ואז, centrifuge אותו שוב ב x 200 גרם להשיג בגדר תא.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של סידן נמוכה, ללא סרום תקין בינוני (SFM). לקחת 10 µL של פתרון זה כדי לספור את המספר בתא סכום, צלחת עם 2 x 106 תאים עם 10 מ"ל של SFM לתוך תא 100-מ מ תרבות מאכלים מיוחדים עם ציפוי מטריקס (המכיל מסוג קולגן). הערה: ציפוי היא צעד הכרחי עבור השיטה המקובלת.</li>
		<li>לשנות את המדיום תרבות כל d 2. הערה: בדוק את הידבקות תאים במיקרוסקופ לפני ואחרי שינוי המדיום תרבות.</li>
		<li>המעבר את התאים כאשר הם מגיעים כ- 80% הנהרות. הערה: כל המנות תרבות הם מיוחדים עם המטריצה ציפוי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. השיטה החדשה
<ol><li>
רעלני רקמת העור
	<ol>
<li>לאסוף את הרקמה כמפורט לעיל (שלב 2.1) עבור השיטה המקובלת.</li>
		<li>לשטוף את רקמת העור 1 x עם 10 מ"ל ל- PBS, ואז, שוקל אותה בתוך מיכל פלסטיק סטרילית מאת מידה אלקטרוניים (המשקל הוא בסביבות 1 g בפרוטוקול זה). הערה: המשקל המזערי של רקמות לצורך פרוטוקול זה הוא 0.1 g, שכן הוא קשה להשיג מספר מספיק של תאים אם הדגימה רקמות בשימוש הוא קטן מדי. אין שום משקל מקסימלי של רקמה עבור פרוטוקול זה, אשר בסופו של דבר תלוי יכולת טיפול של המפעיל.</li>
		<li>להשתמש מלקחיים ולשטוף את רקמת העור עם 10 מ"ל אתנול 70%-30 s.</li>
		<li>דגירה הרקמה 2 x עם 10 מ"ל של כביסה לפתרון (להכין בשלב 2.1.1), 5 דקות בכל פעם. הערה: כל השלבים כביסה שצוין לעיל מתבצעות ב- 100-מ מ תא מנות תרבות בתוך תא למינארי (ברדס תרביות רקמה).</li>
		<li>להעביר את הרקמה תבשיל סטרילי תרבות 100-מ מ תא אחר.</li>
		<li>באמצעות להבים ומהדקים, מינצ הרקמה ביסודיות לתוך slurry רקמות.</li>
		<li>להוסיף 200 µL ל- PBS כל 5 דקות כדי לשמור על הרקמות רטוב. הערה: לוקח בערך 15 דקות לקבלת צעדים 3.1.5 - 3.1.7. כל הצעדים הנ ל מתבצעים בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
העיכול של רקמת עור
	<ol>
<li>להעביר את פתרון הומוגני רקמה לתוך צינור 50-mL. להוסיף 10 מ של אנזים תערובת עבור כל 1 g של רקמת העור. מערבבים האנזימים ביסודיות עם הרקמות homogenized.</li>
		<li>דגירה התערובת ברעידות באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C עבור 1 h.</li>
		<li>להוסיף נפח 1/5 של 0.25% טריפסין (2.5 מ ל פרוטוקול זה) לתערובת לעיכול עבור עוד 30 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 º c</li>
		<li>להוסיף DNase אני הפתרון לתערובת האנזימים ביחס של 1: 100 (v/v) (250 µL ב פרוטוקול זה) דגירה זה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ואוסף culturing התאים הראשי
	<ol>
<li>לעצור את תהליך העיכול על-ידי הוספת מ"ל של ניטרול בינוני על יחס 1:1. Pipette הפתרון למעלה ולמטה במשך 20 x, באמצעות פיפטה סרולוגית 10-mL מביצועם התאים.</li>
		<li>לסנן את התאים dissociated דרך מסננת תא 100-מיקרומטר לפנות את הפסולת רקמות. Centrifuge את תגובת שיקוע ב x 200 גרם במשך 5 דק להתבונן בגדר בתחתית הצינורית.</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר תא עם 10 מ"ל של ניטרול בינוני, צנטריפוגה שוב ב x 200 גרם במשך 5 דקות כדי לאסוף את התאים.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של חיסון בינוני (G-בינוני מהשלב 1.2.5) עם 10 מיקרומטר של Y-27632.</li>
		<li>קח 10 µL של הפתרון כדי לספור את המספר בתא סכום, צלחת עם 2 x 106 תאים עם 10 מ"ל של G-בינוני לתוך תבשיל תרבות תא 100-מ מ. הערה: השלב precoating אינו הכרחי עבור השיטה החדשה, ללא הסרה של שכבת הדרמיס נדרש גם.</li>
		<li>לאחר בתלת-ממד, החלף המדיום חיסון סידן נמוך SFM בינוני. לשנות את המדיום תרבות כל d 2. הערה: בדוק את הידבקות תאים לפני ואחרי שינוי המדיום.</li>
		<li>המעבר את התאים כאשר הם מגיעים כ- 80% הנהרות. הערה: אם יש צורך, pretreat את התאים עם 0.05% טריפסין למשך 2 דקות ולשטוף את התאים עם PBS להסרת זיהום עורי תאים לפני trypsinizing את התאים באפידרמיס.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. תא Passaging
<ol><li>להסיר את המדיום, לשטוף את התאים עם PBS, ולהוסיף, ואז, 2 מ של טריפסין 0.05% (לפי כל מנה 100 מ מ).</li>
	<li>דגירה התאים בתוך אינקובטור (37 ° C עם 5% CO2) במשך 5 דקות.</li>
	<li>בדוק את התאים באמצעות מיקרוסקופ כדי לוודא כי כל התאים יש מנותקת המנה תרבות.</li>
	<li>הוסף 8 מ של DMEM עם 10% FBS כדי לנטרל את התגובה אנזימטי, ואז, לאסוף את התאים בשפופרת 15-mL.</li>
	<li>צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות כדי להשיג בגדר התא.</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע לאט, לאחר מכן, resuspend בגדר תא עם 10 מ"ל של SFM בינוני, לספור את מספר התאים.</li>
	<li>צלחת עונה 1 פרק 10 תאים6 עם 10 מ"ל של SFM לתוך כל מנה תא 100-מ מ.</li>
	<li>לשנות את המדיום כל d 2.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+in+Skin+Regeneration,+Wound+Healing,+and+Their+Clinical+Applications.">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+the+skin+epidermis.">Development and homeostasis of the skin epidermis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).</li><li>Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells+-+role+in+normal,+wounded+and+pathological+psoriatic+and+cancer+skin.">Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells+of+the+skin.">Epidermal stem cells of the skin.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).</li><li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+microphysiological+skin+model+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (S1), S2 (2013).</li><li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-derived+precursors+possess+the+ability+of+differentiation+into+the+epidermal+progeny+and+accelerate+burn+wound+healing.">Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing.</a> Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).</li><li>Hirsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+entire+human+epidermis+using+transgenic+stem+cells.">Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells.</a> Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).</li><li>Hentzer, B., Kobayasi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+human+epidermal+cells+from+fibroblasts+in+primary+skin+culture.">Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture.</a> Archiv f&#252;r dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).</li><li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632.">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem/progenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity.">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li><li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Rho-associated+protein+kinase+(ROCK)+inhibitor+to+human+pluripotent+stem+cells.">Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li><li>Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+isolate+human+epidermal+keratinocytes.">A new method to isolate human epidermal keratinocytes.</a> Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).</li><li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfollicular+epidermal+stem+cells:+boosting+and+rescuing+from+adult+skin).">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin).</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li><li>Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cornified+envelope:+a+model+of+cell+death+in+the+skin.">The cornified envelope: a model of cell death in the skin.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).</li><li>Breyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Rho+kinases+increases+directional+motility+of+microvascular+endothelial+cells.">Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells.</a> Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).</li><li>Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+regulation+of+cell+behavior.">Focal adhesion regulation of cell behavior.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בתרבית HKCs העיקרי היה להיות מנוצל באופן נרחב לטיפול פצעי במרפאות במשך יותר משלושה עשורים, מאז, זה היה תמיד חשוב ביעילות להשיג מספר מספיק של תאים עבור יישומים קליניים מבעוד. לפיכך, בפועל, השיטה המקובלת בידוד, הדורש את פרידתה של האפידרמיס הדרמיס, מקשה לעמוד בדרישות אלה, בשל התשואה נמוכה של התא?...

המטרה הייתה לפתח פרוטוקול פשוט ויעיל כדי לבודד keratinocytes אנושי ראשוני (HKCs) של רקמות בוגרות, במיוחד עבור יישומים קליניים. תאי גזע עוריות העור, מותאם לשכבת הבסיס של העור, בעלי פוטנציאל גבוה כדי להתרבות, להבדיל ולספק keratinocytes כדי לשמור על הפונקציות של העור1,2,3, 4. HKCs מבודד מן העור רקמות נמצאים בשימוש נרחב למטרות בעור רקמות הנדסה והתחדשות, במיוחד בתיקון של עור פגוע, ריפוי גנטי עבור יישומים קליניים5,6. הנושא המרכזי עבור יישומים מבוססי-HKC הוא ביעילות לבודד ולהרחיב מספרים גדולים של HKCs עם גבוהה פוטנציאל במבחנה7,8. למרות קבוצות מחקר שונות פיתחו שיטות כדי לייצר תרבויות של גזע דמוי HKCs, שיטות אלה הם לעיתים זמן רב ומורכב לבצע ויש מגבלות אחרות, כגון תא נמוך התשואות מוגבלים לפי סוג העור הדגימה שימוש9. למשל, השיטה המסורתית כדי לבודד HKCs רקמות העור כרוך עיכול אנזימטי של שני שלבים עם הפרדה של האפידרמיס הדרמיס6. בשיטה זו בדרך כלל עובד טוב בשביל לרקמות neonatal, אבל זה הופך להיות קשה מאוד, כאשר נעשה שימוש כדי לבודד תאים של רקמות בוגרות.
Y-27632, מעכב של רו-הקשורים חלבון (רוק), דווח לשפר באופן משמעותי את היעילות של תאי אפידרמיס בידוד והמושבה הצמיחה10,11,12. במחקר הקודם, גילינו כי Y-27632 מקלה על צמיחת תאים אפידרמיס המשובטים אך מפחית את התשואה של עורי תאים על-ידי שליטה באופן שונה את הביטוי של מולקולות אדהזיה13. הקמנו גם מדיום ממוזגים חיסון חדש, בשם G-בינוני, אשר תומך את הצמיחה ואת התשואה של ראשי תאים באפידרמיס. על ידי שילוב G-בינוני עם Y-27632, שיטה חדשנית זו יכול באופן ספונטני נפרד תאים באפידרמיס עורי לאחר אנזים עיכול, ובכך להסיר את השלב של האפידרמיס-הדרמיס ההפרדה13,14. על סמך דיווחים קודמים, נתאר עכשיו ההליך מפורט של שיטה חדשה כדי לבודד HKCs של רקמת עור מבוגר.

<table><tbody><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Invitrogen Inc.&amp;nbsp;</td><td>C10227</td><td>Automatic cell counting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td><td>For cell incubating</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>Cell centrifuge</td></tr><tr><td>Constant Temperature Shaker</td><td>Shanghai Boxun</td><td>150036</td><td>For water bath</td></tr><tr><td>Electronic Scale</td><td>Harbin Zhonghui</td><td>1171193</td><td>For tissue weighing</td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>50ml Centrifuge Tube</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>For cell centrifuge</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Corning incorporated</td><td>431792</td><td>Cell filtration</td></tr><tr><td>Phosphate buffered solution</td><td>Solarbio Life Science&amp;nbsp;</td><td>P1020-500</td><td>Washing solution</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>Component of neutralization medium</td></tr><tr><td>Defined K-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>10785-012</td><td>Epidermal cells culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1AC5</td><td>Component of neutralization medium</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td>For HKC dissociation</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Beijing Solarbio Science &amp;amp; Technology</td><td>T1350-100</td><td>For HKC dissociation</td></tr><tr><td>Coating Matrix Kit</td><td>Life Technologies</td><td>R-011-K</td><td>For coating matrix</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>For HKC isolation</td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td>For HKC isolation</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>9003-98-9</td><td>For HKC isolation</td></tr><tr><td>F12 Nutrient Mix, Hams</td><td>Life Technologies</td><td>31765035</td><td>Component of G-medium</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Growth factor in G-medium</td></tr><tr><td>FGF-2 Millipore</td><td>Merck Biosciences</td><td>341595</td><td>Growth factor in G-medium</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>Preparation for G-medium</td></tr><tr><td>EGF Recombinant Human Protein</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>Growth factor in G-medium</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>Thermo Scientific</td><td>NC9864731</td><td>cell proliferation and cytotoxicity assays</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human Cytokeratin5</td><td>Hewlett-Packard Development Company</td><td>MA-20142</td><td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Human Loricrin</td><td>Covance</td><td>PRB-145p</td><td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs</td></tr><tr><td>Mouse anti-human Vimentin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3390</td><td>For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6(GOH3)</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>SC-19622</td><td>flow cytometry analysis of HKCs</td></tr><tr><td>Rat IgG2a FITC</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>SC-2831</td><td>negative control antibody of &amp;alpha;6-integrin&amp;nbsp; in flow cytometry analysis&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue

ראשי keratinocytes האנושי מבודד רקמות עור רענן, שלהם הרחבה במבחנה היה בשימוש נרחב עבור מחקר מעבדתי, יישומים קליניים. השיטה המקובלת בידוד keratinocytes האנושי כרוך הליך רציפים עיכול אנזימטי בן שני שלבים, אשר הוכח להיות יעיל ליצירת תאים העיקרי של רקמות בוגרות עקב קצב התאוששות התאים נמוך תא מופחת הכדאיות. לאחרונה דיווחנו שיטה מתקדמת כדי לבודד אנושי ראשוני עוריות ובתאים של רקמות העור אשר מנצל את מעכבי קינאז רו Y-27632 בטווח הבינוני. בהשוואה עם פרוטוקול מסורתיים, שיטה חדשה הוא יותר פשוט, קל יותר, פחות זמן רב, ו מגביר תאי אפיתל התשואה ומגבירה את המאפיינים תאי הגזע שלהם. יתר על כן, המתודולוגיה החדשה אינה דורשת את פרידתה של האפידרמיס הדרמיס, ומתאים, לכן, לבודד תאים מסוגים שונים של רקמות בוגרות. שיטה חדשה זו בידוד מתגבר את החסרונות העיקריים של שיטות קונבנציונליות, והוא מתאים יותר לייצר מספר גדול של תאים באפידרמיס עם האון גבוהה הן במעבדה והן עבור יישומים קליניים. כאן, אנו מתארים את השיטה החדשה בפירוט.

דיאגרמות סכמטית של השיטה החדשה (איור 1 א'), השיטה המקובלת (איור 1B) מוצגים באיור1. השיטה המקובלת היא עיכול בשני שלבים, המחייב הליך יומיים. לעומת זאת, השיטה החדשה היא עיכול בשלב אחד, אשר לוקח כ- 3 שעות לביצוע. חשוב, השיטה החדשה בשלב...

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue at JoVE.com

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבודד ביעילות keratinocytes האדם העיקרי של רקמות העור למבוגרים. שיטה זו מפשטת את הפרוצדורה המקובלת על-ידי שימוש Y-27632 מעכב את רוק המדיום חיסון להפריד באופן ספונטני תאים אפידרמיס מתאי עורי.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

a-simplified-efficient-method-to-isolate-primary-human-keratinocytes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Views.  Shandong University. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבודד ביעילות keratinocytes האדם העיקרי של רקמות העור למבוגרים. שיטה זו מפשטת את הפרוצדורה המקובלת על-ידי שימוש Y-27632 מעכב את רוק המדיום חיסון להפריד באופן ספונטני תאים אפידרמיס מתאי עורי.

Video: A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Cancer Research

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

הקמת מערכת תרבית אפידרמיס כדורית בעלת תפוקה גבוהה למודל פלסטיות תאי גזע קרטינוציטים

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Biology

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in vitro.&#160;Live-cell imaging has allowed for significant advances in the ability to identify differences between keratinocyte stem cells and committed progenitor behavior. Live-cell imaging is an evolving and somewhat challenging method to study keratinocyte behavior in vitro. This protocol has been developed to culture keratinocytes at low seeding density, enabling relatively long-term time-lapse photography and monitoring of individual cell behavior. Passage 0 keratinocytes are grown at clonal density, and time-lapse photography allows documentation of individual cell divisions and the time of their occurrence. For maximum biological relevance, freshly isolated human keratinocytes are placed in vitro. This approach focuses on proliferation. However, this protocol can be adapted for use in other live cell imaging applications measuring individual cell behavior, such as measuring cell migration, wound healing, and motility.

This protocol outlines the culture of freshly obtained (passage 0) keratinocytes for use in live cell imaging.

יצירת תרביות ראשוניות להדמיית תאים חיים של קרטינוציטים

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

Bioengineering

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Neuroscience

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

בידוד ותרבות של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מחך העכבר למבוגרים

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...