이 작품은 국가 주요 연구 및 개발 프로그램의 중국 (2017YFA0104604), 국가 자연 과학 재단의 중국 (NSFC, 81772093)의 일반 프로그램에 의해 지원 되었다 과학 및 기술 개발 프로그램의 소 주 (ZXL2015128) 자연 과학 재단의 장쑤 성 (BK20161241), 고 산동 태 산 학술 상 (tshw201502065).

이 프로토콜에서 사용 하는 인간의 조직 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침에 따라 처리 된 (NO.2015120401, 날짜: 2015 년 5 월 12 일).
1입니다. 준비
<ol><li>얼음 처럼 차가운 Dulbecco의 10 mL 50 mL 튜브에 병원에서 성형 수술에서 삭제 수집 신선한 성인 복 부 피부 조직이 글 중간 (DMEM)으로. 표본은 세포 생존 능력에 크게 영향을 주지 않고 최대 72 h 4 ° C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>아래에 설명 된 시 약 및 문화 매체를 준비 합니다.<ol>
<li>인산 염 버퍼 솔루션 (PBS) 세척 솔루션 준비의 50 mL에 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 mg/L) 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>두 효소 소화 솔루션의 준비: (1) dispase (2.5 mg/mL에서 DMEM) 50 mL를 준비 하 고 50 mL의 유형 I 콜라 (2.5 mg/mL에서 DMEM) 별도로 기존의 방법; (2) 50 mL dispase의 혼합물을 준비 하 고 나에 게 콜라를 입력 (디졸브 125 mg dispase 가루와 125 밀리 그램의 유형 I 콜라 분말 DMEM의 50 ml에서) 새로운 방법에 대 한. 참고: 모든 효소 솔루션 해야 0.22 μ m 스 트레이너와 필터링 하 고 유지 at4 ° c.</li>
		<li>소화 솔루션을 준비 하는 두 가지 방법에 대 한: 0.05 %trypsin 및 0.25 %trypsin 상업적으로 구입 했다. 10 mg/mL DNase 준비 나 DNase PBS의 5 mL에 분말의 50 밀리 그램을 용 해 하 여 솔루션 0.22 μ m 스 트레이너와 필터링 하 고-20 ° c.에 그것을 저장</li>
		<li>효소 소화를 무력화 하는 매체의 500 mL를 준비: DMEM 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보완.</li>
		<li>500 mL 접종 매체 (성장 요소가 포함 된 매체, G-매체 라는)의 준비: DMEM/F12 (3:1) 매체 1% 페니실린/스, 40 µ g/mL fungizone, 40 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 2 (FGF2) 20 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF)를 포함 하 고 2 %B27 보충입니다.</li>
		<li>100 m m 세포 배양을 pretreat 나 실 온에서 30 분 동안 콜라겐의 형식을 포함 하는 코팅 매트릭스 2 mL와 함께 요리.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 종래의 방법
<ol><li>
피부 조직 전처리
	<ol>
<li>피부 조직의 1.5 c m2 를가 고 그것을 씻어 10 mL의 PBS; 1 x 다음, 30 대 70% 에탄올 10 mL로 씻어 s 그것을 품 어 및 세척 솔루션 (PBS 2% 페니실린과 스 포함), 5 분의 10 mL와 함께 2 배. 참고: 모든 세척 100 mm 셀 문화 요리 층 흐름 후드 내부에서 수행 됩니다.</li>
		<li>조직 100 mm 셀 문화 접시에 있는 피하 지방 층을 제거 하 고, 다음, 피부 조직 (무게는이 프로토콜에 1 g)를 무게를 멸 균가 위로 잘라. 참고: 충분 한 트리밍은 진 피에서 표 피의 효율적인 분리에 대 한 매우 중요 합니다. 노란 지방 층 구분할 수 있습니다 쉽게 시각적으로.</li>
		<li>아래 진 피 쪽으로 또 다른 100 m m 메 마른 요리 조직을 전송 하 고, 다음, 피부 조직을 메스 블레이드를 사용 하 여 3-4 m m-와이드 스트립으로 잘라. 참고: 지방 층과 진 피 쪽 쉽게 시각적으로 인식 된다.</li>
		<li>100 m m 문화 접시에 피부 조직에 2.5 mg/mL dispase 솔루션의 10 mL를 추가 하 고, 다음, 4 ° C (더 이상 20 h)에서 하룻밤 접시를 품 어. 참고: dispase 솔루션의 금액의 조직의 각 그램의 소화에 대 한 dispase 솔루션의 10 mL를 사용 하 여 계산할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
피부 조직에서 표 피의 분리
	<ol>
<li>둘째 날에는 정밀한 족집게를 사용 하 여 진 피에서 표 피를 벗기십시오. 참고: 표 피를 벗기다 어려운 경우 dispase 소화 충분 하지 않았다, 일반적으로 조직의 부족 한 잘라내기 때문입니다. 이 경우에 조직 이상 보육 시간이 필요합니다.</li>
		<li>메스;를 사용 하 여 조직 슬러리에 세포 배양 매체의 500 µ L로 벗 겨 표 피를 말하다 그런 다음, 50 mL 튜브에 0.25 %trypsin 10 mL와 함께 그것을 resuspend 하 고 그것에 알 떨고와 37 ° C에서 물 욕조에 20 분을 품고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수집 및 기본 세포의 배양
	<ol>
<li>중화 솔루션 (10 mL이 프로토콜에서)의 동일한 볼륨을 추가 하 여 트립 신 활동을 무력화.</li>
		<li>10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 20 x 위아래로 솔루션 pipetting으로 표 피 세포를 해리 하 고 어떤 잔여 조직 파편을 제거 하는 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀 솔루션을 전달 합니다.</li>
		<li>여과; 후 5 분 동안 200 x g 에서 셀 솔루션을 원심 세척에 대 한 중립화 매체에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고, 다음, 셀 펠 렛을 얻기 위해 200 x g 에 다시 원심.</li>
		<li>낮은 칼슘, 혈 청 무료 keratinocyte 매체 (SFM) 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 총 셀 수를 계산 하 고, 약 2 x 106 셀 100 mm 셀 문화 요리 코팅 매트릭스와 청소용된으로 SFM의 10 mL 다음, 접시에이 솔루션의 10 µ L를가지고 (포함 하는 유형 I 교원 질). 참고: 코팅은 종래의 방법에 대 한 필요한 단계 이다.</li>
		<li>문화 매체 마다 2 d를 변경 합니다. 참고: 전과 문화 매체를 변경한 후 현미경으로 세포 접착을 확인 하십시오.</li>
		<li>그들은 약 80%에 도달할 때 셀 통로 합류. 참고: 모든 문화 요리는 청소용 코팅 매트릭스와 함께.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 새로운 방법
<ol><li>
피부 조직 전처리
	<ol>
<li>조직 설명 대로 위의 (2.1 단계) 종래의 방법에 대 한 수집 합니다.</li>
		<li>씻어 피부 조직 1 x 10 mL PBS의 그리고, 다음, (무게는이 프로토콜에 약 1 g) 전자 규모에 의해 살 균 플라스틱 용기에 무게. 참고: 조직의이 프로토콜에 필요한 최소 무게는 0.1 g, 때문에 사용 하는 조직 표본은 너무 작은 경우 셀의 충분 한 수를 얻기 어렵다. 궁극적으로 연산자의 처리 용량에 따라 달라 집니다이 프로토콜에 대 한 조직의 최대 무게가 있다.</li>
		<li>겸 자 30 대 70% 에탄올 10 mL와 피부 조직 린스를 사용 하 여 s.</li>
		<li>조직 2 품 어 세척 솔루션 (2.1.1 단계에서 준비), 5 분 동안 각 시간 10 mL x. 참고: 위에서 언급 된 모든 세척 단계 100 mm 셀 문화 요리 층 류 두건 (조직 문화 후드) 내부에서 수행 됩니다.</li>
		<li>다른 100 mm 셀 문화 살 균 접시 전송 조직.</li>
		<li>메스를 사용 하 여 말하다 조직을 철저 하 게 조직 슬러리에.</li>
		<li>젖은 조직 유지를 200 µ L의 PBS 마다 5 분을 추가 합니다. 참고: 단계 3.1.5-3.1.7 약 15 분 소요. 위의 단계를 모두 상 온에서 수행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
피부 조직의 소화
	<ol>
<li>무 균된 조직 솔루션 50 mL 튜브로 전송 합니다. 피부 조직의 모든 1g에 대 한 효소 혼합물의 10 mL를 추가 합니다. 무 균 조직 효소를 철저 하 게 혼합.</li>
		<li>1 시간 동안 37 ° C에 물 목욕에 떨고와 혼합물을 품 어.</li>
		<li>37 ° c.에 물 목욕에서 또 다른 30 분 소화 혼합물에 0.25 %trypsin (2.5 mL이 프로토콜에서)의 1/5 볼륨 추가</li>
		<li>DNase를 추가 나 1: 100 (v/v) 비율로 (이 프로토콜에 250 µ L) 효소 혼합물에 솔루션 및 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수집 및 기본 세포의 배양
	<ol>
<li>1:1 비율로 중립화 매체의 12.5 mL을 추가 하 여 소화 프로세스를 중지 합니다. 약 20 배, 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 세포 분열을 위한 솔루션을 위쪽 및 아래쪽 플라스틱.</li>
		<li>조직 파편을 제거 하는 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 해리 셀을 필터링 합니다. 200 x g 5 분 관찰 튜브의 하단에 펠 릿에서 상쾌한 원심</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 200 x g 세포를 수집 5 분에 다시 중화 매체, 그리고 원심 분리기의 10 mL와 함께 셀 펠 릿을 세척.</li>
		<li>Y-27632의 10 µ M와 접종 매체 (G-중간 단계의 1.2.5) 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>총 셀 수를 계산 하 고, 다음, 대략 2 x 106 셀 100 mm 셀 문화 접시에 G 매체의 10 mL 접시 솔루션의 10 µ L를 가져가 라. 참고: precoating 단계는 새로운 방법에 대 한 필요 하 고 피부 층의 아무 제거도 필수.</li>
		<li>3 d, 후 접종 매체를 낮은 칼슘 SFM 매체 바꿉니다. 문화 매체 마다 2 d를 변경 합니다. 참고: 매체 변경 전후 세포 접착을 확인 하십시오.</li>
		<li>그들은 약 80%에 도달할 때 셀 통로 합류. 참고: 필요한 경우 0.05% trypsin 2 분에 대 한 셀을 pretreat 고 표 피 세포를 trypsinizing 전에 피부 세포를 오염 제거에 PBS 가진 세포를 씻어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 셀 뿌리고
<ol><li>제거 매체, PBS, 셀을 세척 하 고, 다음, (각 100 m m 접시) 당 0.05 %trypsin 2 개 mL를 추가.</li>
	<li>5 분 동안 인큐베이터 (5% CO2와 37 ° C)에서 세포를 품 어.</li>
	<li>모든 세포는 문화 접시에서 분리 된 ㄴ 다는 것을 확인 하는 현미경을 사용 하 여 셀을 확인 합니다.</li>
	<li>추가 10 %DMEM 8 mL FBS 효소 반응 중화 하 고, 다음, 15 mL 튜브에 세포를 수집을.</li>
	<li>셀 펠 렛을 얻기 위해 5 분 동안 200 x g 에서 원심.</li>
	<li>상쾌한을 천천히 제거, SFM 매체의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 그리고 셀의 수를 계산 합니다.</li>
	<li>각 100 mm 셀 접시에 SFM의 10 mL로 플레이트 1 x 106 셀.</li>
	<li>매체 마다 2 d를 변경 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+in+Skin+Regeneration,+Wound+Healing,+and+Their+Clinical+Applications.">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+the+skin+epidermis.">Development and homeostasis of the skin epidermis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).</li><li>Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li><li>Bayati, V., Abbaspour, M. 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A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+regulation+of+cell+behavior.">Focal adhesion regulation of cell behavior.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).</li></ol>

저자는 공개 없다.

상처를 치료 클리닉에서 3 년 이상에 대 한 교양된 기본 HKCs 널리 이용 되었습니다 그리고, 그때 이후로, 그것은 항상 중요 했다 효율적으로 적시에 임상 응용 프로그램에 대 한 셀의 충분 한 번호를 얻을. 따라서, 실제로 기존의 절연 메서드와, 진 피에서 표 피 분리, 어렵게 셀과 낮은 수 성인 셀 통로의 낮은 수율으로 인해 이러한 요구 사항을 충족 합니다. 여기, 우리는 우리가 효율적으로 연구소 및 임상 응용 프로그램에 더 적당 한 이전 보고서13,14에 따라 성인 조직에서 HKCs를 개발 하는 새로운 간단한 방법을 설명 합니다.
주의 새로운 방법에 대 한 최상의 결과 달성 하기 위해 다음 중요 한 단계에 지불 한다. 첫째, 균질 절차는 중요 한 단계; 부족 한 균질 효소 소화와 해리 셀의 낮은 수율에서 결과의 효율성 영향을 명확 하 게 것입니다. 둘째, 트립 신 소화 단계; 30 분 이상 걸리지 않을 겁니다. 그렇지 않으면, 해리 세포의 생존 능력은 줄일 것 이다. 셋째, 천연된 세포를 효율적으로 수집 하 여과 사용 되는 셀 스 트레이너의 기 공 크기 100 µ m, 고 셀 솔루션의 더 이상 20 mL를 필터링 하는 단일 스 트레이너를 사용 해야 합니다. 넷째, 초기 도금의 밀도 높은 세포 밀도 피부 세포에 Y-27632의 억제 효과 줄일 것입니다 때문에 피부 세포와 오염을 최소화 하는 중요 한 요소입니다. 따라서, 그것은 도금 전에 격리 절차의 끝에 해리 셀의 총 수를 계산 하는 정확 하 게 중요 합니다.
첫째, 새로운 방법은 격리 절차 간소화: 2 단계 기존 격리 절차 일반적으로 수행 하 고, 2 일 걸리고 트리밍 절차는 완전히 성인 조직 ( , 특히 피부에서 지방 조직을 제거 하는 중요 한 그림 1); 그렇지 않으면,는 비효율적인의 분리는 표 피 진 피에서 dispase와 하룻밤 소화 후 있을 것입니다. 접종13후 피부 세포의 성장을 억제, Y-27632를 이용 하 여 새로운 방법 진 피에서 표 피를 분리 하는 필요 하지 않습니다.. 그리고 따라서, 지방 조직을 제거 하는 트리밍 절차는 새로운 필요 하지 않습니다. 메서드 수행 반나절만 필요 합니다. 둘째, 새로운 메서드 또한 간소화 문화 절차 때문에, 전통적인 방법으로 천연된 셀 일반적으로 교양의 10%를 포함 하는 매체에 비친된 마우스 fibroblasts 급지대 레이어에 FBS 또는 콜라겐 도장된 접시에. 동물 파생 된 구성 요소는 항상 위험 요소를 임상 응용 프로그램에 대 한 피해 야 한다. 우리는 바른된 접종 혈 청 무료 매체 (g 조-중), 문화 요리 precoating 단계를 필요 하지 않습니다 그리고 G-매체 Y-27632와 결합 촉진의 첨부 파일 또한 기본 keratinocytes13 의 수익률 향상을 개발 표 피 세포 문화에13,,1718접시. 따라서, 새로운 메서드 문화 절차를 용이 하 게 하 고 또한 동물 파생 된 구성 요소를 추가 하지 않고 임상 응용 프로그램에 대 한 상대적으로 안전한 절차 이다. 셋째, 새로운 메서드 기본 표 피 세포의 수율 향상과 합류를 도달 하는 데 필요한 초기 문화 시간 단축. 전통적인 방법에 비해, 새로운 방법에 의해 생산 하는 세포의 수율은 약 3 배 이상, 그리고 표 피 세포의 초기 통과 도달 합류 최소 3 일 이전 (그림 2). 마지막으로, 모든 종류의 털이 많은 두 피 피부 등 이전 보고서13에서 테스트 된 두꺼운 지방 층으로 성인 피부 조직 피부 표본에서 상피 세포의 분리에 대 한 새 메서드를 활용할 수 있습니다.
높은 잠재력 기본 HKCs 실험실 연구와 임상 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 이 새로운 방법은13상피 줄기 세포 특성을 가진 경작된 한 세포의 잠재력을 향상 시킵니다. Y-27632는 HKCs, 및 3 개의 통로, 90% 배양된 상피 세포의 기저 세포 마커 각 질 5, 표현과 세포의 10% 미만 분화 마커 Loricrin, 나타내는 표현 보다 더 후 α6 integrin 식 강화 이 세포는 여러 구절 후 피부 기저 세포의 특성 유지. 문화 확장 표 피 세포 수13, 그들은 문화에 확장 후 재생 잠재적인 소유 제안 접목 후 피부에 vivo에서 다시 구성. 특히, 위에서 언급 한 대로 새로운 방법 성인 조직에서 세포를 분리 이상적입니다. 따라서,이 방법으로 준비 하는 표 피 세포 체 외에 사용할 수 있습니다 고 vivo에서 피부 질환을 공부 하 고 피부 상처 치료 등 임상 응용 프로그램에 대 한 헌 셀 기반 제품으로 개발 될 수 있다.
요약 하자면, 새로운 프로토콜 격리 하 고 성인 피부 조직에서 기본 표 피 세포 확장 단순 하 고 효과적인 절차를 제공 합니다. 이 방법은 고급 다 수 실험실 및 임상 응용 프로그램에 대 한 높은 잠재력 상피 세포의 생산을 위한 더 적당 하다.

목표 임상 응용 성인 조직에서 기본 인간의 keratinocytes (HKCs)을 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발 했다. 피부의 기저 층에 피부 표 피 줄기 세포 증식 및 분화 keratinocytes 피부1,2,3, 의 기능을 유지 하기 위해 제공 하는 높은 잠재력을가지고 4. HKCs 피부 조직 목적을 위해 피부 조직 공학 및 재생, 특히 손상 된 피부의 복구와 임상 응용 프로그램5,6에 대 한 유전자 치료에 널리 이용 된다에서 격리. HKC-기반 응용 프로그램에 대 한 중요 한 문제는 파악 하 고 확장 하는 높은 잠재적인 생체 외에서7,8HKCs의 큰 숫자입니다. 다양 한 연구 그룹 줄기 같은 HKCs의 문화를 생산 하는 방법을 개발 했습니다, 하지만 이러한 방법을 수행 하 고 낮은 셀 수율 등 피부 견본 형식에 의해 제한 되 고 다른 제한이 복잡 하 고 시간이 많이 소요 되기도 9를 사용합니다. 예를 들어, 피부 조직에서 HKCs을 전통적인 방법은 진 피6에서 표 피의 분리 2 단계 효소 소화를 포함 한다. 그 방법은 일반적으로 신생아 조직을 위해 잘 작동 하지만 성인 조직에서 세포를 분리 하는 데 사용 하는 경우 그것은 매우 어려워집니다.
Y-27632, 억제제로 관련 단백질 키 니 아 제 (바위)의 표 피 줄기 세포 격리와 식민지 성장10,,1112의 효율성을 크게 향상을 보고 되었습니다. 이전 연구에서 우리는 Y-27632 상피 세포의 클론 성장을 촉진 하지만 차동 접착 분자13의 식을 조절 하 여 피부 세포의 수확량 감소를 발견 했다. 우리는 또한 성장과 기본 표 피 세포의 수익률을 지 원하는 G-매체 라는 새로운 조건된 접종 매체 설립. G-매체 Y-27632와 결합 하 여이 새로운 메서드는 표 피-진 피 분리13,14단계 제거 효소 소화 후 저절로 피 및 피부 세포를 분리할 수 있습니다. 이전 보고서를 바탕으로, 우리는 지금 성인 피부 조직에서 HKCs을이 새로운 방법의 상세한 절차를 설명 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1344px;" width="1342">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:263px;">Countess automated cell counter</td>
			<td style="width:291px;">Invitrogen Inc.&#160;</td>
			<td style="width:264px;">C10227</td>
			<td style="width:527px;">Automatic cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026333</td>
			<td>For cell incubating</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>Cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Constant Temperature Shaker</td>
			<td>Shanghai Boxun</td>
			<td>150036</td>
			<td>For water bath</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Electronic Scale</td>
			<td>Harbin Zhonghui</td>
			<td>1171193</td>
			<td>For tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Cell Culture Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">50ml Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Cell Strainer</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>431792</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Phosphate buffered solution</td>
			<td>Solarbio Life Science&#160;</td>
			<td>P1020-500</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">DMEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C11995500</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Defined K-SFM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10785-012</td>
			<td>Epidermal cells culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1AC5</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">0.05% Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>For HKC dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">0.25% Trypsin&#160;</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology</td>
			<td>T1350-100</td>
			<td>For HKC dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Coating Matrix Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R-011-K</td>
			<td>For coating matrix</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>For HKC isolation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td>For HKC isolation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-98-9</td>
			<td>For HKC isolation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">F12 Nutrient Mix, Hams</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31765035</td>
			<td>Component of G-medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">B27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Growth factor in G-medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">FGF-2 Millipore</td>
			<td>Merck Biosciences</td>
			<td>341595</td>
			<td>Growth factor in G-medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Fungizone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290026</td>
			<td>Preparation for G-medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>Growth factor in G-medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NC9864731</td>
			<td>cell proliferation and cytotoxicity assays</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Mouse Anti-Human Cytokeratin5</td>
			<td>Hewlett-Packard Development Company</td>
			<td>MA-20142</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Rabbit Anti-Human Loricrin</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-145p</td>
			<td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Mouse anti-human Vimentin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3390</td>
			<td>For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Integrin &#945;6(GOH3)</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>SC-19622</td>
			<td>flow cytometry analysis of HKCs</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:263px;">Rat IgG2a FITC</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>SC-2831</td>
			<td>negative control antibody of &#945;6-integrin&#160; in flow cytometry analysis&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue

기본 인간 keratinocytes 신선한 피부 조직 및 그들의 확장에서 에 체 외에서 고립 된 실험실 연구와 임상 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 인간의 keratinocytes의 기존의 격리 방법은 포함 한다 낮은 세포 회복 율 및 감소 셀 성인 조직에서 1 차 셀을 생성 효율적으로 입증 된 2 단계 순차 효소 소화 절차를 생존 능력입니다. 우리는 최근 매체에 노 키 니 아 제 억제 물 Y-27632를 활용 하 여 피부 조직에서 인간의 기본 상피 조상 세포 분리 고급 방법 보고. 전통적인 프로토콜에 비해,이 새로운 방법 간단 하 게, 쉽게, 그리고 보다 적게 시간이 걸리는, 그리고 상피 줄기 세포 수확량 증가 이며 그들의 줄기 세포 특성을 향상 시킵니다. 또한, 새로운 방법론, 진 피에서 표 피의 분리는 필요 하지 않습니다 이며, 따라서 여러 유형의 성인 조직에서 세포를 분리 하는 데 적합 한. 이 새로운 격리 방법 기존 방법의 주요 단점을 극복 하 고 높은 힘 실험실 및 임상 응용 프로그램에 대 한 많은 수 표 피 세포의 생산에 대 한 더 적합 합니다. 여기, 우리가 새로운 방법을 자세히 설명합니다.

새 메서드 (그림 1A)와 기존의 방법 (그림 1B)의 도식 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 기존의 방법은 2 일 절차는 2 단계 소화 합니다. 대조적으로, 새로운 방법은 작업에 약 3 시간 소요 단계 소화 합니다. 중요 한 것은, 한 단계 새로운 방법 접종 매체에 Y-27632의 존재에 달려 있는 동시에 두 개의 인구 (표 피 및 피부 세포)를 얻을 수 있습니다. 또한, 초기 문화 시간 같은 수의 셀 분리 후 주사 하는 경우 합류 약 80%에 도달 하는 표 피 세포의 최소 3 일 종래의 방법 보다는 더 적은 일반적으로 걸립니다.
새로운 방법 식민지 형태학에 성장 더 기본 표 피 세포를 생성 합니다. G-매체와 조직 주사 했다 인간 피부에서 분리 된 HKCs Y-27632를 포함 하. 동일한 수의 셀 컨트롤로 기존 메서드 다음 도금 했다. 초기 접종 후 일 3과 5에서 상피 세포의 대표 이미지는 그림 2A에 표시 됩니다. 식민지 형태학으로 성장 하는 경향이 새로운 방법에서 얻은 세포. 성장 곡선 접종 키트-8 (CCK-8) (그림 2B), 접종 후 다른 시간 지점에서 계산 셀을 사용 하 여 평가 했다 그리고 배로 시간 새로운 방법으로 준비 하는 셀에 대 한 약 3-4 일만에 약 6-8 일 후에 전통적인 방법입니다. 7 일에는 세포의 수율 계산 했다. 결과 그림 2C, 보여주는 새로운 방법 나왔고 종래의 방법 보다 3 배 더 많은 셀 도달 합류 초기 접종 후 최소 3 일 적은 (그림 2D) 하는 데 필요한 시간에에서 표시 됩니다. 하루 7, 표 피 세포 새로운 메서드를 사용 하지만 기존의 방법 (그림 2D)으로 하지 합류에 도달.
새로운 방법은 1 차 셀 α6 integrin의 식을 향상. Α6 integrin 매우 표 피 줄기 세포15에 의해 표현 될 표시 되었습니다. 새로운 방법으로 고립 된 셀 몇 구절 후 피부 기저 세포의 특성 유지. 식민지 성장, 피부의 기저 층에서 파생 하는 상피 줄기 세포의 특성 중 하나 이며 α6 integrin 식의 높은 수준이 상피 줄기 세포의 또 다른 기능입니다. 우리는 발견 Y-27632의 또한 크게 증가 통로 3 (그림 3A-B)에 표 피 세포에서 α6 integrin의 식 통로 3에 새로운 메서드를 사용 하 여 격리 하는 표 피 세포 피부 세포 에 의해 오염이 없음 표시 13. 생체 외에서 확장 하는 동안 여러 구절 후 기저 세포 기능을 유지 하기 위해 매우 중요 하다. 면역 형광 검사 (IF) 및 분석을 기저 세포 마커 각 질 5 터미널 분화 마커 loricrin16 세 구절 후 그 셀 수행 되었다. 우리는 모든 세포의 90 %K5 긍정 했지만 그들의 10% 미만 loricrin (그림 3C - 3D) 표현 발견. 이러한 결과 기본 HKCs 절연 표 피 줄기 세포 인구를 포함 하 고 기저 세포의 특징적인 기능을 유지할 수 있는 새로운 메서드를 사용 하 여 나타냅니다. 하지만 더 이상 HKCs passaged는, 더 많은 그들은 시작을 차별화 하는. 새로운 방법으로 우리는 그 표 피 세포 배양 체 외에서 유지할 수 있었다 그들의 확산 능력 통로 8까지 다는 것을 발견. 마지막으로, 우리는 절연 피 및 피부 세포의 혼합물은 격리 후 바로 접종 이후 새로운 메서드를 사용 하 여 표 피 세포의 순수성 테스트. 초기 문화를 오염 하는 몇 가지 피부 세포를 제거 하는 트립 신으로 짧은 시간 (2-3 분) 치료, 표 피 세포의 비교적 순수한 인구 한 통로 (그림 4) 후 얻은 것입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57784/57784fig1.jpg"> 그림 1 : 새로운 및 기존의 격리 절차의 비교. (A)이이 패널 새로운 격리 방법의 도식 적인 표현을 보여줍니다. 하루 1, 천연된 피부 세포 또는 Y-27632 없이 G 중에 주사 됩니다. 2 일 동안 Y-27632의 표 피 세포는 선택적으로 확장합니다. 하루 6, 세포에 도달 밀도 뿌리고에 대 한 충분. (B)이이 패널 기존의 격리 방법의 도식 적인 표현을 보여줍니다. 표 피 진 피에서 분리 하 고 표 피 세포는 하루에 2, 고립 된 셀 뿌리고 약 10 일에 대 한 충분 한 밀도 도달 하는 일반적으로. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57784/57784fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57784/57784fig2.jpg"> 그림 2 : 기본 표 피 세포의 수익률을 증가 하는 새로운 격리 방법. 초기 접종 후 3-5 일에 새로운 방법 (맨 위 행)으로 하 고 기존의 방법 (아래쪽 행)으로 준비 하는 표 피 세포의 (A)이 패널 쇼 대표 이미지. 스케일 바 = 200 µ m. (B) 기본 HKCs 새와 전통적인 준비 방법 키트-8 (CCK-8) 계산 셀을 사용 하 여 실행 가능한 세포의 분석에 대 한 표시 시간 지점에서 수집 된. (C) 셀의 총 수는 새로운 방법으로 준비 하 고 기존의 방법으로 접종 후 7 일에서 계산 했다. (D) 기본 표 피 세포 (통로 0)의 합류에 도달 하는 평균 시간 새로운 절연 방법 및 기존의 방법에 대 한 표시 됩니다. 패널 B - D: 학생의 t-테스트 사용 되었다; 오차 막대 표시 표준 편차; n = 4; p < 0.01, * p < 0.05 기존의 방법으로 새로운 방법을 비교할 때. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57784/57784fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57784/57784fig3.jpg"> 그림 3 : 새로운 방법으로 얻은 기본 표 피 세포 중 기저 세포 기능을 유지할 수 있습니다 생체 외에서 확장. (A)이이 패널 표시 Y-27632 (Y-27632, 빨간색)으로 치료 통로 3에서 표 피 세포의 α6 integrin 표현의 FACS 분석 또는 Y-27632 (제어, 회색) 48 h. (B) 없이이 패널 높은 셀의 정량화 분석 패널 A;에서 α6 integrin의 식 레벨 높은 α6 integrin 식 신호 > 103로 정의 됩니다 * * p < 0.01. (C)이이 패널 표시 면역 형광 K5 (빨간색)와 loricrin (빨강); 얼룩의 대표 이미지 DAPI (파란색)는 핵 얼룩에 사용 되었다. 스케일 바 = 100 µ m. (D)이이 패널 K5 및 loricrin 양성 세포의 정량화 분석을 보여줍니다. 400 셀의 총 각 그룹을 척도를 계산 했다 그리고 K5와 loricrin 양성 세포의 평균 숫자 표시 됩니다. 실험은 독립적으로 하지 4 번 반복 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57784/57784fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57784/57784fig4.jpg"> 그림 4 : 초기 통행 후에 상대적으로 순수 표 피 세포 새로운 메서드를 사용 하 여 얻은 했다. 면역 형광 염색 vimentin의 (빨간색) 0 (P0) 및 3 (P3); 구절에서 표 피 세포에 대 한의 (A)이이 패널 쇼 대표 이미지 DAPI (파란색)는 핵 얼룩에 사용 되었다. 스케일 바 = 50 µ m. (B)이이 패널 0 (P0)과 1 (P1) 구절에서 vimentin 양성 세포의 정량화 분석을 보여줍니다. 400 셀의 총 각 그룹을 척도를 계산 했다 고 vimentin 긍정적인 세포의 평균 수 표시 됩니다. 실험은 독립적으로 하지 4 번 반복 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57784/57784fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

a-simplified-efficient-method-to-isolate-primary-human-keratinocytes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K 조회수.  Shandong University. 여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

비디오: A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell replacement therapies. Terminally differentiated cell types could be used for the treatment of various degenerative diseases. In vitro differentiation of these cells towards tissues of the lung, liver and pancreas requires as a first step the generation of definitive endodermal cells. This step is rate-limiting for further differentiation towards terminally matured cell types such as insulin-producing beta cells, hepatocytes or other endoderm-derived cell types. Cells that are committed towards the endoderm lineage highly express a multitude of transcription factors such as FOXA2, SOX17, HNF1B, members of the GATA family, and the surface receptor CXCR4. However, differentiation protocols are rarely 100% efficient. Here, we describe a method for the purification of a CXCR4+ cell population after differentiation into the DE by using magnetic microbeads. This purification additionally removes cells of unwanted lineages. The gentle purification method is quick and reliable and might be used to improve downstream applications and differentiations.

Here, we describe a method for the purification of differentiated human embryonic stem cells that are committed towards the definitive endoderm for the improvement of downstream applications and further differentiations.

인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a "highly permissive" state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated "epigenetic cell conversion". It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

성인 피부 섬유 아 세포에서 인슐린 분비 세포를 얻을 수있는 안전하고 간단한 방법으로 성적인 변환

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

효율적인 방법은 탈분화 지방 세포를 얻는 방법

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or complete loss of viability at different stages of development. Our lab has developed a method to assess viability in Drosophila from embryo to fully mature adult. The method relies on quantifying the number of progeny present at different stages during development, starting with hatched embryos. After embryos have been quantified, additional stages are counted, including L1/L2, pupae, and mature adults. After all stages have been examined, a statistical analysis such as the chi-square test is used to determine if there is a significant difference between the starting number of progeny (hatched embryos) and later stages culminating in the observed number of adults, thus rejecting or accepting the null hypothesis (that the number of hatched embryos will be equal to the number of larvae, pupae, and adults recorded throughout the stages of development). The primary advantage of this assay is its simplicity and accuracy, as it does not require an embryo rinse to transfer them to the food vial, avoiding losses from technical errors. Although the protocol described here does not directly examine L2/L3 larvae, additional steps can be added to account for these. Comparing the number of hatched embryos, L1, pupae, and adults can help determine if viability was compromised during the L2/L3 stages for further studies (the use of colored food helps with visual identification of larvae). Overall, this method can help Drosophila researchers and educators determine when viability is compromised during the fly life cycle. Routine assessment of stocks using this assay can prevent accumulation of secondary mutations that may affect the phenotype of the originally isolated mutant, especially if the original mutations affect fitness. For this reason, our lab maintains multiple copies of each of our Dm ime4 alleles and routinely checks the purity of each stock with this method in addition to other molecular analyses.&#160;