Bu eser ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı Çin (2017YFA0104604), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı, Çin'in (NSFC, 81772093), Genel Program tarafından desteklenmiştir bilim ve Suzhou teknoloji geliştirme programı (ZXL2015128), Jiangsu Eyaleti doğal Bilim Vakfı (BK20161241) ve Shandong Taishan Scholar Ödülü (tshw201502065).

Bu protokol için kullanılan insan doku kurumun insan Araştırma Etik Komitesi kurallarına göre ele (NO.2015120401, tarihi: 12 Mayıs 2015).
1. hazırlıkları
<ol><li>Plastik cerrahi ile buz gibi Dulbecco 10 mL 50 mL tüp Hastanesi'nde üzerinden atılan toplamak taze yetişkin karın cilt dokularının kartal Orta (DMEM) değiştiren. Örnek, hücre canlılığı önemli ölçüde etkilemeden en fazla 72 saat için 4 ° C'de tutulabilir.</li>
	<li>Reaktifler ve kültür orta aşağıda açıklandığı şekilde hazırlayın.<ol>
<li>1 mL penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 mg/L) 50 mL fosfat tamponlu çözeltisi (PBS) yıkama çözüm hazırlamak için ekleyin.</li>
		<li>İki enzim sindirim çözümler kümesi hazırlamak: (1) dispase (DMEM içinde 2.5 mg/mL) 50 mL hazırlamak ve 50 mL tip ı collagenase (2.5 mg/mL DMEM) ayrı ayrı geleneksel yöntemi; ve (2) 50 mL dispase karışımı hazırlamak ve tip ı collagenase (erime 125 mg dispase tozu ve 125 mg tip ı collagenase toz DMEM 50 mL) yeni yöntem için. Not: Tüm enzim çözümler olmalı bir 0,22-µm süzgeç ile filtre ve sürekli at4 ° C.</li>
		<li>Her iki yöntem için sindirim çözümleri hazırlamak: % 0.05 tripsin ve % 0.25 tripsin ticari olarak satın. Bir 10 mg/mL DNaz hazırlamak ben 50 mg 5 mL PBS, toz DNaz eriterek tarafından çözüm 0,22-µm süzgeç ile filtre ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>Orta enzimatik sindirim nötralize etmek için 500 mL hazırlamak: DMEM orta % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiştir.</li>
		<li>Aşı Orta (G-Orta olarak adlandırılan büyüme faktörü içeren orta,) 500 mL hazırlamak: içeren % 1 penisilin/streptomisin, 40 µg/mL fungizone, 40 ng/mL fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2), 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), DMEM/F12 (3:1) orta ve %2 B27 ek.</li>
		<li>100-mm hücre kültürü pretreat yemekleri kaplama matris türünü içeren 2 mL ile ben kollajen, oda sıcaklığında 30 dakika.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. geleneksel Yöntem
<ol><li>
Cilt doku Önarıtma
	<ol>
<li>1,5 cm2 cilt dokusunun almak ve yıkayın 1 x 10 mL PBS; o zaman, 10 mL % 70 etanol için 30 ile durulayın s ve o kuluçkaya 2 x 10 mL, 5 min çözüm (PBS) % 2 penisilin ve streptomisin içeren, yıkama ile. Not: Tüm yıkama 100-mm hücre kültür yemekleri bir laminar akış başlık içinde gerçekleştirilir.</li>
		<li>Deri altı yağ tabakası bir 100-mm hücre kültür çanağı kaldırmak ve sonra (Bu iletişim kuralı 1 g ağırlığıdır) deri dokusu tartmak için steril makasla doku kırpın. Not: Yeterli düzeltme dermis çok epidermis verimli ayrılması için çok önemlidir. Sarımsı yağ katman kolayca görsel olarak ayırt edilebilir.</li>
		<li>Ve aşağı başka bir 100-mm Steril çanak DermIS tarafı ile doku transfer, o zaman, cilt dokusu bir neşter bıçak kullanarak 3 - için 4-mm-geniş şeritler halinde kesin. Not: DermIS yan yağ tabaka ile kolayca görsel olarak kabul edilmektedir.</li>
		<li>100-mm kültür tabağına cilt dokularının 10 mL 2.5 mg/mL dispase çözeltisi ekleyin ve sonra bir gecede 4 ° C'de (en fazla 20 h) çanak kuluçkaya. Not: Dispase çözüm miktarı her gram doku sindirim için 10 mL dispase çözeltisi kullanılarak hesaplanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Epidermis ayrılması deri dokusu
	<ol>
<li>İkinci gün, iyi Cımbız kullanarak dermis epidermis akasındaki. Not: epidermis soyma zorsa, dispase sindirim hangi genellikle yetersiz doku düzeltme nedeniyle olduğunu yeterli değildi. Bu durumda, doku daha uzun bir kuluçka süresi gerekir.</li>
		<li>Hücre kültür ortamının 500 µL ile soyulmuş epidermis neşter bıçakları kullanarak bir doku Bulamaç kıyma; daha sonra 10 mL % 0.25 tripsin bir 50 mL tüp ile resuspend ve 37 ° C'de sallayarak ile bir su banyosu içinde 20 dk kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Toplama ve primer hücre kültürü çalışmalarının
	<ol>
<li>Tripsin etkinlik nötralize çözüm (bu Protokolü 10 mL) eşit bir hacmi ekleyerek etkisiz hale getirin.</li>
		<li>Çözüm yukarı ve aşağı 20 x 10 mL serolojik pipet ile pipetting tarafından epidermal hücrelerin ayırmak ve hücre çözümü herhangi bir kalıntı doku enkaz kaldırmak için 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.</li>
		<li>Hücre çözümü 200 x g 5 min için de filtrasyon sonra santrifüj kapasitesi; hücre Pelet nötralizasyon orta yıkama resuspend ve sonra tekrar hücre Pelet elde etmek için 200 x g santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Hücre Pelet düşük kalsiyum, serum-Alerjik keratinosit Orta (SFM) 10 mL resuspend. Bu çözümün Toplam hücresini saymak ve sonra SFM 10 mL içine kaplama matris ile ön işleme 100-mm hücre kültür yemekler ile yaklaşık 2 x 106 hücre plakası için 10 µL al (içeren tip ı kollajen). Not: Kaplama geleneksel yöntem için gerekli bir adımdır.</li>
		<li>Kültür orta her 2 d değiştirin. Not: bir mikroskop altında hücre adezyon önce ve kültür orta değiştirdikten sonra kontrol edin.</li>
		<li>Yaklaşık % 80 ulaştığında hücreleri geçiş izdiham. Not: Tüm kültür yemekleri ile kaplama matris ön işleme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. yeni yöntemi
<ol><li>
Cilt doku Önarıtma
	<ol>
<li>Doku açıklandığı gibi yukarıdaki (adım 2.1) geleneksel yöntem için toplamak.</li>
		<li>Deri dokusu 1 yıkama x 10 mL PBS ile ve daha sonra tartmak bir steril plastik kap içinde elektronik bir ölçek (ağırlığı ise yaklaşık 1 g bu protokolü) tarafından. Not: kullanılan doku örnek çok küçük ise hücreler yeterli sayıda elde etmek zor olduğundan 0.1 g, doku bu iletişim kuralı için gerekli minimum ağırlık olur. Sonuçta operatör işleme kapasitesine bağlıdır bu iletişim kuralı için doku yok maksimum ağırlık vardır.</li>
		<li>10 mL % 70 etanol için 30 ile deri dokusu durulama için forseps kullanın s.</li>
		<li>Doku 2 kuluçkaya x 10 mL, 5 min için (adım 2.1.1 hazır) çözüm her zaman yıkama ile. Not: yukarıda belirtilen tüm çamaşır adımlar 100-mm hücre kültür yemekleri laminar akış hood (doku kültürü hood) içinde gerçekleştirilir.</li>
		<li>Doku başka bir 100-mm hücre kültür steril yemek için transfer.</li>
		<li>Neşter bıçakları kullanarak, doku iyice bir doku Bulamaç kıyma.</li>
		<li>200 µL her 5 dk PBS, ıslak mendil tutmak için ekleyin. : Dikkat adımları 3.1.5 - 3.1.7 yaklaşık 15 dakikadır. Yukarıdaki tüm adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sindirim cilt dokusunun
	<ol>
<li>Homojenize doku çözüm 50 mL tüp içine aktarın. 10 mL cilt dokusunun her 1 g için enzim karışımı ekleyin. Enzimler homojenize kurcalayarak iyice karıştırın.</li>
		<li>1s için 37 ° C'de bir su banyosunda sallayarak ile karışımı kuluçkaya.</li>
		<li>Başka bir 30 dk 37 ° C'de bir su banyosu içinde sindirim karışımı için % 0.25 tripsin (Bu iletişim kuralı 2.5 mL) 1/5 hacmi ekleyin</li>
		<li>DNaz ekleyin ben çözüm 1: 100 (v/v) oranında (Bu protokolündeki 250 µL) enzim karışımı ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Toplama ve primer hücre kültürü çalışmalarının
	<ol>
<li>1:1 oran içinde 12,5 mL nötralizasyon orta ekleyerek sindirim işlemini durdurun. Çözüm yukarı ve aşağı yaklaşık 20 x 10 mL serolojik pipet hücreleri ayırmak için kullanma için pipette.</li>
		<li>Disosiye hücreleri doku enkaz kaldırmak için 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre. Süpernatant 200 x g 5 dk. gözlemlemek Pelet tüpün dibinde de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant atmak ve nötralizasyon orta ve santrifüj 10 mL ile hücre Pelet tekrar 200 x g hücreleri toplamak 5 min için de yıka.</li>
		<li>Hücre Pelet aşılama Orta (adım 1.2.5 G-Orta) 10 ml Y-27632 10 µM ile resuspend.</li>
		<li>Toplam hücre sayar ve ardından, G-Orta 10 mL 100-mm hücre kültür çanak içine ile yaklaşık 2 x 106 hücre plakası için çözüm 10 µL al. Not: Precoating adım yeni yöntemi için gerekli değildir ve hiçbir kaldırma dermal tabakanın da gereklidir.</li>
		<li>3 d sonra aşı orta düşük kalsiyum SFM orta ile değiştirin. Kültür orta her 2 d değiştirin. Not: hücre adezyon önce ve orta değiştirdikten sonra kontrol edin.</li>
		<li>Yaklaşık % 80 ulaştığında hücreleri geçiş izdiham. Not: gerekirse, % 0.05 tripsin 2 min için hücrelerle pretreat ve deri hücreleri epidermal hücrelerin trypsinizing önce kirletici kaldırmak için PBS hücrelerle yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. hücre Passaging
<ol><li>Orta kaldırmak, PBS hücrelerle yıkayın ve ardından, 2 mL % 0.05 tripsin (başına her 100-mm çanak) ekleyin.</li>
	<li>5 min için bir kuluçka (37 ° C % 5 CO2) hücrelerde kuluçkaya.</li>
	<li>Tüm hücreler kültür çanak ayırdıktan emin olmak için bir mikroskop kullanarak hücreleri denetleyin.</li>
	<li>DMEM 8 mL % 10 ile ekleyin FBS enzimatik reaksiyon etkisiz hale getirmek ve daha sonra bir 15 mL tüp hücreleri toplamak için.</li>
	<li>200 x g hücre Pelet elde etmek 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Yavaş yavaş süpernatant kaldırmak ve, sonra hücre Pelet SFM orta 10 mL ile resuspend ve hücreleri saymak.</li>
	<li>1 x 106 hücre SFM 10 mL her 100-mm hücre çanak içine ile plaka.</li>
	<li>Her 2 d orta değiştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Skin+Regeneration%2C+Wound+Healing%2C+and+Their+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+homeostasis+of+the+skin+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+BIology%22%5BJournal%5D)">Development and homeostasis of the skin epidermis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383(2012).</li>
<li>Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+-+role+in+normal%2C+wounded+and+pathological+psoriatic+and+cancer+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells of the skin.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+microphysiological+skin+model+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2(2013).</li>
<li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li>
<li>Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-derived+precursors+possess+the+ability+of+differentiation+into+the+epidermal+progeny+and+accelerate+burn+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing.</a> Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).</li>
<li>Hirsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+entire+human+epidermis+using+transgenic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells.</a> Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).</li>
<li>Hentzer, B., Kobayasi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+human+epidermal+cells+from+fibroblasts+in+primary+skin+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+dermatologische+Forschung%22%5BJournal%5D)">Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture.</a> Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).</li>
<li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Rho-associated+protein+kinase+%28ROCK%29+inhibitor+to+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/306307941_A_new_method_to_isolate_human_epidermal_keratinocytes">A new method to isolate human epidermal keratinocytes.</a> Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).</li>
<li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfollicular+epidermal+stem+cells%3A+boosting+and+rescuing+from+adult+skin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin).</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li>
<li>Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cornified+envelope%3A+a+model+of+cell+death+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cornified envelope: a model of cell death in the skin.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).</li>
<li>Breyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Rho+kinases+increases+directional+motility+of+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells.</a> Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).</li>
<li>Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+regulation+of+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion regulation of cell behavior.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kültürlü birincil HKCs yaygın olarak fazla üç yıl için klinikler yaraları tedavi etmek için kullanılan ve o zamandan beri her zaman verimli bir şekilde zamanında yeterli sayıda klinik uygulamaları için hücre elde etmek önemli olmuştur. Bu nedenle, uygulamada, dermis epidermis ayrılması gerektirir, geleneksel yalıtım yöntemini hücrelerin ve yetişkin hücreleri geçiş yeteneği düşük düşük verim nedeniyle bu talepleri karşılamak zor olur. Burada, verimli bir şekilde HKCs için laboratuar ve klinik uygulamalar için daha uygun önceki raporları13,14, temel yetişkin dokusundan elde etmek için geliştirdiğimiz yeni bir basit yöntem açıklanmaktadır.
Dikkat yeni yöntem için en iyi sonuçları elde etmek için aşağıdaki kritik adımlar için ödenmesi gerekmektedir. İlk olarak, homojenizasyon işlemi çok önemli bir adımdır; yetersiz homojenizasyon açıkça enzimatik sindirim ve sonuç düşük verim Disosiye hücrelerin verimliliğini etkiler. İkinci olarak, tripsin sindirim adım daha--dan 30 dk almamalıdır; Aksi takdirde, Disosiye hücre canlılığı azalacak. Üçüncü olarak, verimli bir şekilde Disosiye hücreleri toplamak için filtrasyon sonrasi için kullanilir hücre süzgeç gözenek boyutu 100 µm olmalıdır ve tek bir süzgeç hücre çözümü en fazla 20 mL filtre uygulamak için kullanılmalıdır. Dördüncü olarak, ilk kaplama yoğunluğu kirlenme dermal hücrelerle en aza indirmek için önemli bir faktör çünkü yüksek hücre yoğunluğu Y-27632 deri hücreleri üzerinde inhibitör etkisi önemli ölçüde azaltacaktır. Bu nedenle, doğru bir şekilde önce kaplama yalıtım yordamının sonunda Disosiye hücreleri toplam sayısını saymak çok önemlidir.
İlk olarak, yeni yöntem yalıtım yordamı basitleştirir: iki adım geleneksel yalıtım yordam genellikle gerçekleştirmek için 2 gün sürer ve kesme yordamı tamamen deri, özellikle yetişkin dokuları ( için yağ dokusu kaldırmak çok önemlidir Şekil 1); Aksi takdirde, bir verimsiz ayrılması epidermis dermis gecede sindirim dispase ile sonra olacak. Aşı13sonra deri hücrelerinin büyümesini engeller, Y-27632 yararlanarak yeni yöntem dermis epidermis ayırmak gerekli değildir ve bu nedenle, yağ dokusu kaldırmak için kırpma yordam yeni için gerekli değildir yöntemi, yalnızca yarım gün gerçekleştirilmesi gerekir. Geleneksel yöntemle Disosiye hücreleri genellikle % 10 içeren ortamda radyasyonlu fare fibroblastlar besleyici tabakası üzerinde kültürlü beri ikinci olarak, yeni yöntemi ayrıca kültür yordamı basitleştirir FBS veya kollajen precoated bir tabak içinde. Hayvan kaynaklı her zaman risk faktörleri, klinik uygulamalar için kaçınılması gereken bileşenlerdir. Precoating bir adım kültür yemekleri için gerekli değildir ve G-Orta Y-27632 ile kombine ve eki teşvik çünkü da birincil Lenfositi13 verimini artırır bir şartına aşılama serum-Alerjik Orta (G-Orta), geliştirdiğimiz epidermal hücre kültürüne13,17,18çanağı. Bu nedenle, yeni yöntemi kültür yordamı kolaylaştırır ve ayrıca hayvan kaynaklı bileşenler olmadan klinik uygulamalar için nispeten güvenli bir işlemdir. Üçüncü olarak, yeni yöntem birincil epidermal hücrelerin verimini artırır ve izdiham ulaşmak için gereken ilk kültür süresini kısaltır. Geleneksel yöntem ile karşılaştırıldığında, yeni yöntemle üretilen hücre verimidir yaklaşık 3 kat daha yüksek ve epidermal hücre ilk geçiş izdiham en az 3 gün önce (Şekil 2) ulaştı. Son olarak, yeni yöntemi tüm türlerinden kıllı kafa derisi deri ve bir önceki rapor13' te test kalın bir yağ tabakası ile yetişkin cilt doku gibi cilt örneklerin epidermal hücrelerin izolasyonu için yararlı olabilir.
Laboratuvar araştırma ve klinik uygulamalar için yüksek potansiyel birincil HKCs yaygın olarak kullanılmıştır. Bu yeni yöntem kültürlü hücre potansiyeli epidermal kök hücre13özellikleri ile geliştirir. Y-27632 α6-integrin ifade HKCs ve üç pasajlar, %90 kültürlü epidermal hücrelerin Bazal Hücre işaretçisi keratin 5 ifade ve hücrelerin % 10'dan az farklılaşma işaretçisi olduğunu belirten Loricrin, ifade daha sonra artırır Bu hücreler cilt bazal hücre özellikleri sonra çeşitli pasajlar tutmak. Kültür-genişletilmiş epidermal hücrelerin cilt vivo içinde 13kültür genişleme sonra yenilenme potansiyel sahip düşündüren, aşılama sonra yeniden oluşturmak. Özellikle, yeni yöntem yukarıda da belirtildiği gibi yetişkin dokular, hücrelerden yalıtmak idealdir. Bu nedenle, epidermal hücrelerin bu yöntem tarafından hazırlanan vitro için kullanılabilir ve in vivo cilt hastalıkları çalışma modelleri ve otolog hücre tabanlı ürünlerde cilt yaraları tedavi gibi klinik uygulamalar için geliştirilmiştir.
Özetle, yeni protokol yalıtmak ve yetişkin cilt dokusundan birincil epidermal hücre genişletmek için basit ve etkili bir yordam sağlar. Bu yöntem gelişmiş yüksek potansiyel epidermal hücre için laboratuar ve klinik uygulamalar için çok sayıda üretmek için daha uygundur.

Amaç birincil insan keratinositler (HKCs)--dan yetişkin dokular, özellikle klinik uygulamalar için yalıtmak için basit ve etkili bir iletişim kuralı geliştirmekti. Cilt epidermal kök hücreleri, deri, bazal tabaka içinde lokalize çoğalırlar ve ayırt etmek ve cilt1,2,3, fonksiyonlarını korumak için Lenfositi sağlamak için yüksek bir potansiyele sahip 4. deri dokuları yaygın cilt doku mühendisliği ve yenilenme amacıyla kullanılan, özellikle hasarlı cilt onarım ve gen tedavisi için klinik uygulamaları5,6izole HKCs. Önemli HKC tabanlı uygulamalar için etkili bir şekilde izole ve HKCs çok sayıda yüksek potansiyel vitro7,8ile genişletin konudur. Çeşitli araştırma grupları kök benzeri HKCs kültürleri üretmek için yöntemler geliştirdik, bu yöntemler bazen düşük hücre verimleri ve cilt numune türü tarafından sınırlı olmak gibi diğer kısıtlamalar bulunmaktadır ve gerçekleştirmek karmaşık ve zaman alıcı olmakla birlikte 9kullanılır. Örneğin, HKCs cilt dokularının yalıtmak için geleneksel yöntem iki aşamalı enzimatik sindirim epidermis bir ayırma DermIS6ile karıştırmak. Bu yöntem genellikle de yenidoğan dokular için çalışıyor, ama yetişkin doku hücreleri izole etmek için kullanıldığında çok zor olur.
Y-27632, Rho ilişkili protein kinaz (kaya), bir inhibitörü bildirilmiştir önemli ölçüde epidermal kök hücre izolasyon ve koloni büyüme10,11,12verimliliği artırmak için. Bir önceki çalışmada, keşfettiğimiz Y-27632 epidermal hücrelerin klonal büyümesini kolaylaştıran ama differentially adezyon molekülleri13ifade kontrol ederek deri hücreleri verimini azaltır. Ayrıca büyüme ve verim birincil epidermal hücre destekler G-Orta adı verilen yeni bir şartına aşılama orta kurduk. G-Orta Y-27632 ile birleştirerek, bu roman yöntemi kendiliğinden böylece epidermis-DermIS ayrılık13,14adım kaldırma enzim sindirim sonra epidermal ve dermal hücreleri ayırabilirsiniz. Önceki raporlara dayanarak, biz şimdi detaylı HKCs yetişkin cilt dokusundan ayırmak için bu yeni yöntemin açıklayınız.

<table><tbody><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Invitrogen Inc.&amp;nbsp;</td><td>C10227</td><td>Automatic cell counting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td><td>For cell incubating</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>Cell centrifuge</td></tr><tr><td>Constant Temperature Shaker</td><td>Shanghai Boxun</td><td>150036</td><td>For water bath</td></tr><tr><td>Electronic Scale</td><td>Harbin Zhonghui</td><td>1171193</td><td>For tissue weighing</td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>50ml Centrifuge Tube</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>For cell centrifuge</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Corning incorporated</td><td>431792</td><td>Cell filtration</td></tr><tr><td>Phosphate buffered solution</td><td>Solarbio Life Science&amp;nbsp;</td><td>P1020-500</td><td>Washing solution</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>Component of neutralization medium</td></tr><tr><td>Defined K-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>10785-012</td><td>Epidermal cells culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1AC5</td><td>Component of neutralization medium</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td>For HKC dissociation</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Beijing Solarbio Science &amp;amp; Technology</td><td>T1350-100</td><td>For HKC dissociation</td></tr><tr><td>Coating Matrix Kit</td><td>Life Technologies</td><td>R-011-K</td><td>For coating matrix</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>For HKC isolation</td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td>For HKC isolation</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>9003-98-9</td><td>For HKC isolation</td></tr><tr><td>F12 Nutrient Mix, Hams</td><td>Life Technologies</td><td>31765035</td><td>Component of G-medium</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Growth factor in G-medium</td></tr><tr><td>FGF-2 Millipore</td><td>Merck Biosciences</td><td>341595</td><td>Growth factor in G-medium</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>Preparation for G-medium</td></tr><tr><td>EGF Recombinant Human Protein</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>Growth factor in G-medium</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>Thermo Scientific</td><td>NC9864731</td><td>cell proliferation and cytotoxicity assays</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human Cytokeratin5</td><td>Hewlett-Packard Development Company</td><td>MA-20142</td><td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Human Loricrin</td><td>Covance</td><td>PRB-145p</td><td>For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs</td></tr><tr><td>Mouse anti-human Vimentin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3390</td><td>For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6(GOH3)</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>SC-19622</td><td>flow cytometry analysis of HKCs</td></tr><tr><td>Rat IgG2a FITC</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>SC-2831</td><td>negative control antibody of &amp;alpha;6-integrin&amp;nbsp; in flow cytometry analysis&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue

Taze cilt dokularının ve kendi genişleme vitro izole birincil insan Lenfositi yaygın olarak laboratuvar araştırma ve klinik uygulamaları için kullanılmaktadır. İnsan Lenfositi geleneksel yalıtım yöntemi nedeniyle düşük hücre kurtarma hızı ve düşük hücre yetişkin dokulara gelen primer hücre oluşturmak için verimsiz olduğu kanıtlanmış bir iki adım sıralı enzimatik sindirim yordamı içerir canlılığı. Biz son zamanlarda Orta Rho kinaz inhibitörü Y-27632 kullanan insan birincil epidermal progenitör hücrelerin cilt dokularının yalıtmak için gelişmiş bir yöntem bildirdi. Geleneksel iletişim kuralı ile karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem daha basit, daha kolay ve daha az zaman alıcı ve epitel kök hücre verim artar ve kök hücre özellikleri geliştirir. Ayrıca, yeni metodoloji dermis epidermis ayrılması does değil istemek ve, bu nedenle, farklı türdeki yetişkin doku hücreleri yalıtmak için uygundur. Bu yeni yalıtım yöntemi geleneksel yöntemlerle önemli eksiklikleri üstesinden gelir ve daha yüksek güç için laboratuar ve klinik uygulamalar için ile çok sayıda epidermal hücre üretmek için uygundur. Burada, yeni yöntem ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Şematik diyagramları yeni yöntemi (resim 1A) ve geleneksel Yöntem (Şekil 1B) Şekil 1' de sunulmaktadır. 2 günlük yordamı gerektirir bir iki adım sindirim geleneksel yöntemdir. Buna karşılık, en yeni yöntemdir gerçekleştirmek için yaklaşık 3 saat sürer bir tek adımlı sindirim. Önemlisi, tek adımlı Yöntem Y-27632 varlığı aşılama orta bağlıdır aynı anda iki popülasyonun (epidermal ve dermal hücreleri) edinebilirsiniz. Ayrıca, ilk kültür zaman aynı sayıda hücre izolasyon sonra aşı epidermal hücrelerin % 80 civarında ulaşmak için izdiham genellikle en az 3 gün geleneksel yöntem daha az alır.
Yeni yöntem bir koloni morfolojisi büyümek tüm birincil epidermal hücre üretir. G-orta ile insan deri dokuları aşısını HKCs izole Y-27632 içeren. Aynı sayıda hücre tabi denetim olarak geleneksel yöntem kaplama. 3 ve 5 gün sonra ilk aşı, epidermal hücrelerin temsilcisi görüntüleri Şekil 2Agösterilir. Bir koloni morfolojisi büyümek eğilimi yeni yöntemi elde edilen hücreleri. Aşılama değerlendirildi kit-8 (CCK-8) aşı (Şekil 2B) sonra farklı zaman noktalarda sayma bir hücre kullanarak ve katlama süresi yaklaşık 3-4 gün yeni yöntemi tarafından hazırlanan hücreler için ama yaklaşık 6-8 gün sonra büyüme eğrisi geleneksel yöntem. Gün 7, hücrelerin sayıları hesaplanır. Sonuçları yeni yöntem geleneksel yöntem ve o daha üç kat daha fazla hücre ilk aşılama en az 3 gün sonra izdiham daha az (Şekil 2B) ulaşmak için gereken süreyi verdiğini gösteren Şekil 2Ciçinde gösterilmiştir. Gün 7, epidermal hücrelerin izdiham yeni yöntemi, ancak değil geleneksel Yöntem (Şekil 2B) ulaştı.
Yeni Yöntem α6-integrin ifade primer hücre tarafından geliştirilmiş. Α6-integrin son derece epidermal kök hücre15tarafından ifade edilebilir olduğu gösterilmiştir. Yeni yöntemle izole hücreler cilt bazal hücre özellikleri sonra çeşitli pasajlar yapılmaktadır. Koloni büyüme epidermal kök hücreleri cilt bazal katmandan türetilmiş özelliklerinden biri, ve α6-integrin ifade yüksek düzeyde epidermal bu kök hücrelerin bir başka özelliğidir. Y-27632 ek α6-integrin passage 3 (Şekil 3A-B), epidermal hücrelerin ifade anlamlı bir artış ve geçiş 3 epidermal hücrelerin yeni yöntemle izole hiç bulaşma deri hücreleri tarafından göstermek bulduk 13. bazal hücre özellikleri sonra çeşitli pasajlar vitro genişleme sırasında korumak çok önemlidir. Bazal Hücre işaretçisi keratin 5 ve terminal farklılaşma işaret loricrin16 ayirt (Eğer) analizi içeren hücreleri sonra üç pasajlar gerçekleştirildi. Bulduğumuz tüm hücrelerin % 90'ı K5-pozitif olduğunu ancak bunların daha az % 10 loricrin (Şekil 3 c - 3D) ifade. Bu sonuçları birincil HKCs izole bir epidermal kök hücre popülasyonu içeren yeni yöntemini kullanarak ve bazal hücre karakteristik özelliklerini koruyabilirsiniz gösterir. Ama artık HKCs pasajlı ki, daha onlar ayırt etmeye başlar. Yeni yöntemle bulduk o epidermal hücrelerin kültürlü vitro nükleer silahların yayılmasına karşı yeteneklerini geçiş 8 kadar korumak olabilir. Son olarak, epidermal hücrelerin epidermal ve dermal hücreleri karışımı şu yalıtım sonra aşı bu yana yeni yöntemi kullanılarak izole saflığı test ettik. Bazı deri hücreleri ilk kültür kirletici kaldırmak için tripsin ile kısa süreli (2-3 dk) tedavi ile nispeten saf Vaha'da epidermal hücrelerin bir geçiş (Şekil 4) sonra elde edildi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57784/57784fig1.jpg"> Resim 1 : Yeni ve geleneksel yalıtım yordamlar karşılaştırılması. (A) Bu panel gösterir yeni yalıtım yönteminin şematik gösterimi. Gün 1, Disosiye cilt hücrelerini G-Orta veya Y-27632 olmadan aşı. 2 gün Y-27632 huzurunda epidermal hücrelerin seçici olarak genişletin. 6, hücreleri bir yoğunluk passaging için yeterli ulaşmak. (B) Bu panel geleneksel yalıtım yönteminin şematik gösterimi gösterir. Dermis epidermis ayrılır ve epidermal hücre 2 gün izole ve genellikle, yaklaşık 10 gün passaging için yeterli bir yoğunluk hücreleri ulaşmak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57784/57784fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57784/57784fig2.jpg"> Resim 2 : Yeni yalıtım yöntemini birincil epidermal hücrelerin verimini artırır. (A) Bu paneli gösterir temsilcisi görüntüleri epidermal hücre yeni yöntemi (üst satır) ve geleneksel Yöntem (alt satır) tarafından 3 ve 5 gün sonra ilk aşı hazır. Ölçek çubukları 200 µm. (B) birincil yeni ve geleneksel tarafından hazırlanan HKCs = yöntemleri kit-8 (CCK-8) sayma bir hücre kullanarak hücrelerin analizi için belirtilen zaman puan toplanan. (C) yeni yöntemi tarafından hazırlanan ve 7 gün sonra aşılama, geleneksel yöntemle sayıldı hücre toplam sayısı. (D) yeni yalıtım yöntemini ve geleneksel yöntem için izdiham birincil epidermal hücre (geçit 0) ulaşmak için geçen ortalama süre gösterilir. Panelleri B - D: öğrenci t-testi kullanılmıştır; hata çubukları standart varyasyon gösterir; n = 4; p < 0,01, * p < 0,05 ne zaman yeni yöntemi geleneksel yöntemi ile karşılaştırma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57784/57784fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57784/57784fig3.jpg"> Şekil 3 : Yeni yöntemle elde edilen birincil epidermal hücrelerin Bazal Hücre Özellikleri sırasında korumak mümkün vitro genişleme. (A)Bu panel gösterir Y-27632 (Y-27632, kırmızı) ile tedavi FACS analizini α6-integrin ifade geçiş 3, epidermal hücrelerin veya Y-27632 (kontrol, gri) 48 h. (B) için olmadan bu panel hücreleri yüksek bir miktar analizini gösterir α6-integrin panelinden Adüzeyde ifade; yüksek α6-integrin ifade bir sinyal > 103olarak tanımlanan ** p < 0,01. (C) Bu panel ayirt K5 (kırmızı) ve loricrin (kırmızı); boyama temsilcisi görüntüleri gösterir. DAPI (mavi) çekirdeği leke için kullanıldı. Ölçek çubukları = 100 µm. (D) Bu panel gösterir bir miktar analiz K5 ve loricrin pozitif hücre. Toplam 400 hücre sayılır her grup ölçmek için ve K5 ve loricrin pozitif hücrelerinin ortalama numaraları gösterilir. Deneme bağımsız olarak 4 kez tekrarlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57784/57784fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57784/57784fig4.jpg"> Şekil 4 : İlk geçiş sonra nispeten saf epidermal hücrelerin yeni yöntemi kullanarak elde edildi. (A) Bu panel gösterir temsili resimleri boyama ayirt (kırmızı) vimentin epidermal hücrelerin, pasajlar 0 (P0) ve 3 (P3); DAPI (mavi) çekirdeği leke için kullanıldı. Ölçek çubukları = 50 µm. (B) Bu panel gösterir vimentin pozitif hücre pasajlar 0 (P0) ve 1 (P1) adlı bir miktar analiz. Toplam 400 hücre sayılır her grup ölçmek için ve vimentin pozitif hücre ortalama sayısı gösterilir. Deneme bağımsız olarak 4 kez tekrarlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57784/57784fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue at JoVE.com

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

a-simplified-efficient-method-to-isolate-primary-human-keratinocytes

Universidad Científica del Sur

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.1K Görüntüleme.  Shandong University. Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.

Video: A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

3D Organotypic Melanom küresel Cilt modeli

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Kanser Araştırmaları

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Gelişim Biyolojisi

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Biyoloji

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in vitro.&#160;Live-cell imaging has allowed for significant advances in the ability to identify differences between keratinocyte stem cells and committed progenitor behavior. Live-cell imaging is an evolving and somewhat challenging method to study keratinocyte behavior in vitro. This protocol has been developed to culture keratinocytes at low seeding density, enabling relatively long-term time-lapse photography and monitoring of individual cell behavior. Passage 0 keratinocytes are grown at clonal density, and time-lapse photography allows documentation of individual cell divisions and the time of their occurrence. For maximum biological relevance, freshly isolated human keratinocytes are placed in vitro. This approach focuses on proliferation. However, this protocol can be adapted for use in other live cell imaging applications measuring individual cell behavior, such as measuring cell migration, wound healing, and motility.

This protocol outlines the culture of freshly obtained (passage 0) keratinocytes for use in live cell imaging.

Keratinosit Canlı Hücre Görüntüleme için Primer Kültürlerin Oluşturulması

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

Biyomühendislik

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...