Name: informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens
Uploaded: 2018-06-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health unterstützt: NIH R21 EB021870-01A1 und durch NSF Research Project Grant: 1517110.

1. Fastq Zuordnungsdateien
Hinweis: DEEPN Software sowie viele Bioinformatik-Programme verwenden DNA-Sequenzdaten, wobei jede Sequenz lesen zugeordnet wurde, für seine Position in der Referenz DNA. Eine Vielzahl von Mapping-Programme kann verwendet werden, für diese einschließlich der MAPster Schnittstelle hier, die das HISTAT2-Programm verwendet, um .sam Dateien, die in den nachfolgenden Schritten verwendet zu produzieren.
<ol><li>Die richtige Version des Genoms der Sequenzdaten zuordnen. Für Y2H Bibliotheken Maus Ursprungs verwenden der UCSC mm10 Genom; für die Verwendung von menschlichen Genen verwenden der UCSC hg38 Bezug genom für Saccharomyces Cerevisiae Gene, verwenden der UCSC SacCer3 Bezug Genom.</li>
	<li>
MAPster zu installieren.
	<ol>
<li>MAPster Software herunterladen und installieren. Die Software finden Sie in einem Web Browser unter folgender: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 läuft auf Unix-basierten Systemen wie z. B. Apple Macintosh. Aus diesem Grund läuft das Programm MAPster nur auf kompatiblen Systemen wie z. B. Apple Macintosh und Linux. Hinweis: Die Systemanforderungen für einen Apple Mac sind: OSX 10.10 + > 4 Gb RAM, > 500 Gb Speicherplatz und Internet-Zugang für das Herunterladen von Referenz-Genome. Benutzer müssen möglicherweise mit einer institutionellen es Person beraten, wenn ihr Unternehmen Sicherheitsprotokolle Administratorrechte und Berechtigungen zu beschränken hat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Geben Sie die erforderlichen Dateien und Parameter über die Registerkarte "Main" (Abbildung 1). Wählen Sie den entsprechenden "Pairwise"-Button, geben Dateien entweder als Paare oder ungepaarte mit FASTQ als Standard-Dateiformat.
	<ol>
<li>DEEPN Analyse biegen Sie in die "Pairwise" Option auf "Off" im einzelnen lesen Format ausgeführt.</li>
		<li>Laden Sie Dateien in MAPster, einfach per Drag and Drop in das entsprechende Fenster.</li>
		<li>Wählen Sie eine Referenz-DNA/Genom-Quelle, die die Quelle der Y2H Beute Bibliothek Einsätze entspricht. Indizierte Genomen von verschiedenen Modellorganismen sind im Feld "Genom" aufgeführt und automatisch heruntergeladen werden von der Johns Hopkins University Center for Computational Biology. Referenz-Genome werden lokal zur späteren Verwendung gespeichert werden.</li>
		<li>Geben Sie die Anzahl der Computer verarbeitet seit HISAT2 unterstützt Multithreading die Mapping-Programm unter dem Feld "Threads" gewidmet sein. MAPster wird suchen Sie den Computer und die maximale Anzahl von Prozessoren verfügbar als Standard vorschlagen.</li>
		<li>Der Name einer Ausgabedatei angeben. Dieser Dateiname wird während des Prozesses DEEPN verwendet werden, so wird ein kurzer, aber aussagekräftiger Namen ohne Leerzeichen oder Sonderzeichen empfohlen. Geben Sie einen Ordner, um die zugeordneten Dateien über den Button "Open Output Directory" ausgegeben.</li>
		<li>Nachdem Sie die entsprechenden Dateien und Parameter ausgewählt haben, fügen Sie die Mapping-Arbeit zur Arbeitsplätze Warteschlange über den Button "Add to Queue hinzu". Die Dateinamen im Hauptfenster können gelöscht und ersetzt mit einer neuen Probe entsprechend Dateien und können nach der Bereitstellung eines entsprechenden Ausgang Dateiname zur Warteschlange hinzugefügt werden.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Warteschlange starten", sobald alle Aufträge in der Auftragswarteschlange eingegeben werden. Hinweis: Sobald ein Zuordnung Auftrag in der Warteschlange platziert wurde, führt auswählen, dass Jobs die Parameter-Einstellungen im Fenster "Parameter" und die Befehlszeile Anweisung mit allen Argumenten in der "Job-Befehl" Fenster angezeigt werden sollen angezeigt werden. Die Ausgabeoptionen umfassen Regie ob zu halten liest, die nicht zum Ausrichten und Festlegen der Anzahl der primären Ausrichtungen zugelassen für jeden zu lesen. Die Standard-Ausgabe-Datei von MAPster ist im SAM-Format (z.B. eine Datei ".sam"). Es enthält alle der Reihenfolge liest aus den Fastq-Dateien für diese Probe, einschließlich derer, die waren (zugeordnet) angegeben und waren nicht (unzugeordnet) angegebenen Geome erfolgreich zugeordnet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Bioinformatic Verarbeitung mit DEEPN Software
Anmerkung: DEEPN Software ist derzeit für den Einsatz mit Beute Bibliotheken mit Maus cDNA Sequenzen, menschliche DNA-Sequenzen oder S. Cerevisiae genomische DNA-Sequenzen enthalten. DEEPN akzeptiert die standard .sam-Datei-Format und kann SAM (.sam) Datei mit zugeordneter und nicht zugeordneter liest oder separate Dateien für jeden der nicht zugeordneten und zugeordneten lautet akzeptieren.
<ol><li>DEEPN Software herunterladen und installieren. Die Software finden Sie in einem Web Browser unter folgender: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. Wählen Sie, welche Version der computing-Plattform und Download übereinstimmt. Um zu installieren, öffnen Sie das heruntergeladene Installationspaket. Hinweis: Versionen von DEEPN sind verfügbar für PC, Mac und Linux Sysrems. Mac und PC Systeme müssen > 500 Gb Festplattenspeicher und > 4 Gb RAM.</li>
	<li>
Öffnen Sie die DEEPN Software. Wählen Sie aus dem Hauptfenster (Abbildung 2) die entsprechende Beute Bibliothek Information aus der Top-Auswahl-Box. Wählen Sie einen Ordner, wo die verarbeiteten Dateien gehen kann durch Anklicken des Buttons "Arbeitsverzeichnis" und navigieren zu dem Ordner/Verzeichnis. Man kann ein neues Verzeichnis/Ordner erstellen, bei Bedarf. Sobald ein "Arbeitsverzeichnis" ausgewählt ist, wird DEEPN drei Unterordner unter dem Titel Unmapped_sam_files, Mapped_sam_files und Sam_files erstellen.
	<ol>
<li>Wenn mittels .sam Dateien mit zugeordneter und nicht zugeordneter liest wie Sie mit den Standardeinstellungen des Programms MAPster erzeugt, legen Sie sie in den Ordner "Sam_files". Ansonsten setzen Sie entsprechend .sam Dateien in die Unmapped_sam_files und Mapped_sam_files.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verarbeitung durch Anklicken des Buttons "Gen Count + Junction macht" zu initiieren. Hinweis: Verarbeitung beginnt mit dem Gene Graf-Modul, die Zuordnung Positionen verwendet werden, um zu zählen, wieviele liest jedes Gen entsprechen. Kreuzung machen extrahiert dann Kreuzung Sequenzen (die Sequenzen verschmolzen direkt unterhalb von Gal4-Aktivierungsdomäne) aus der liest und identifizieren sie mit Hilfe des Blast-Algorithmus. Dadurch entsteht eine ganze Reihe von Ordnern, die in Abbildung 3dargestellt. Bearbeitungszeit hängt von der Größe und Anzahl der Sequenz Datendateien und Verarbeitungsgeschwindigkeit des Computers verwendet. Typische Zeiten reichen von 12 bis 30 h für eine experimentelle Dataset von 250 Millionen liest. Die Anzahl der Gene und Junction_Make Verfahren können individuell durch Klicken auf die Schaltfläche "Gene" oder die "Kreuzung machen"-Taste gestartet werden.</li>
	<li>
Downloaden Sie und installieren Sie Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). Dies ist eine statistische Analyse-Paket für DEEPN Datasets, die funktioniert derzeit nur auf Unix Mac-Systemen entwickelt.
	<ol>
<li>Öffnen Sie Stat_Maker und klicken Sie auf die Schaltfläche "Überprüfen Installation" (Abbildung 4). Wenn zum ersten Mal ausgeführt, installiert Stat_Maker R, Zacken und Bioconductor automatisch durch diese Ressourcen aus dem Internet ziehen. Sobald R, Zacken und Bioconductor erkannt werden, werden Stat_Maker aktiv und ermöglichen weitere Benutzereingabe.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Ordner auswählen", um in den Arbeitsordner zu navigieren, die DEEPN verarbeitet. Stat_Maker automatisch finden und Liste der Dateien für die statistische Analyse im Fenster.</li>
		<li>Per Drag & drop die entsprechenden Dateien aus dem Datei-Liste-Fenster oben in der Datei Windows unten für jeden Vektor und Köder Dataset und für jede Wachstumsbedingungen: nicht ausgewählt (seine + Medien) und ausgewählt (seine - Media). Wichtig ist, erfordert Stat_Maker doppelte Datensätze für leere Vektor allein, zwei Proben von nicht ausgewählten Populationen und zwei Proben von ausgewählt. Dies gibt eine Schätzung der Variabilität innerhalb des Experiments.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen". Abhängig von der Geschwindigkeit des Computers dauert die Berechnung zwischen 5 – 15 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überprüfen Sie die Ergebnisse aus der Stat_Maker Ausgabe, die in einen neuen Unterordner in dem Hauptwerk-Ordner mit der Bezeichnung "Stat_Maker Ergebnisse" platziert werden. Hinweis: Die Ergebnisse werden in eine CSV-Datei (durch Kommas getrennte Werte) gefunden, die gemeinsam Tabellenkalkulationsprogrammen geöffnet werden können. Stat_Maker wird gen Hits gehören, die voraussichtlich differentiell bei der Auswahl mit dem Köder von Interesse über die leeren pTEF-GBD (Abbildung 5) angereichert werden. Auch tabellarisch liegt der Prozentsatz der Lesevorgänge für jedes Dataset gen einfügen vorgelagerten, flussabwärts, oder in den offenen Leserahmen und ob das Gen auch innerhalb der richtigen translationale Leseraster gefunden wird. Oft wird DEEPN robuste Y2H-Interaktionen der Köder mit Teile einer bestimmten cDNA erfassen, die aus den richtigen Leseraster des entsprechenden Proteins oder auf einen Teil der cDNA, die seine entsprechenden offenen Leserahmen nachgeschaltet ist. Scannen die kombinierte Ausgabe von Stat_Maker rationalisiert die Erkennung und Beseitigung von diese irrelevanten Treffer.</li>
	<li>
Um die Daten zu jedem potentiellen Bewerber zu überprüfen, öffnen Sie die DEEPN Software, wählen Sie die entsprechende Beute Bibliothek Information und dann den richtigen Arbeitsordner mithilfe des Ordners"Arbeit".
	<ol>
<li>Klicken Sie auf "Blast Query". Dadurch wird ein neues Fenster (Abbildung 6) geladen. Geben Sie in das obere Textfeld Gen Namen oder Nummern der GenBank NM das Kandidaten-gen des Interesses auswählen. Diese Gen-Namen entsprechen den in der StatMaker Ausgabe-Datei aufgelisteten Namen. Typ geben Sie oder zurückkehren, die initiiert Abruf des Gens von Interesse.</li>
		<li>Wählen Sie aus, welche Datensätze für die Analyse über die Menüs "Dataset auswählen" verwendet wird. In der Regel dazu gehören den Vektor nur und Köder Proben nicht-selektiven Bedingungen angebaut und der Köder-Probe unter Selektionsbedingungen angebaut. Zunächst die Datasets dauert ein paar Augenblicke zu laden, jedoch nachfolgende Abfrage der gleichen Datasets mit verschiedenen Genen wird schnell gehen. Blast_Query zeigt die Fusion Sehenswürdigkeiten entlang der Sequenz und wie reichlich jedes Schmelzpunkt ist. Dies kann sowohl in einem Tabellenformat mithilfe der Registerkarte "Ergebnisse" oder ein grafisches Format mithilfe der Registerkarte "Plot" angezeigt werden. Diese Ergebnisse können in eine CSV-Datei exportiert werden, indem Sie auf die Schaltfläche "Speichern .csv" in der oberen rechten Ecke.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Prüfung der Kandidaten durch DEEPN identifiziert
Hinweis: Die DEEPN und Stat_Maker soll Kandidaten-Gene zu identifizieren, die eine positive Y2H Interaktion geben. Überprüfung solcher Y2H-Interaktionen kann sein erfolgt mit einem traditionellen Y2H Binärformat mit dem Köder-Plasmid von Interesse gepaart mit dem leeren Gal4-Aktivierung Domäne "Beute" Plasmid sowie gepaart mit der Beute Plasmid trägt das Gen/cDNA Fragment von Interesse. Es ist nicht möglich, die tatsächliche Plasmid von Interesse in der Mischung von DNA isoliert von der Hefe Bevölkerung ausgesetzt Y2H Auswahl isolieren. Jedoch kann eine rechnerisch rekonstruieren, was das Gen/cDNA Fragment ist, dass das Y2H Zusammenspiel produziert, Primer für 5' und 3' Ende dieses Fragment entwerfen und diesem Fragment aus der DNA isoliert von der Hefe Bevölkerung zu verstärken. Dieser Abschnitt beschreibt, wie das 5' und 3' Ende des Fragments Kandidat Beute zu finden.
<ol><li>Öffnen Sie die DEEPN-Software und wählen Sie die Parameter "Ausgewählte Parameter" und die Arbeitsordner "wählen Sie arbeiten", das Projekt entspricht. Starten Sie das Blast_Query-Modul, durch Klicken auf die Schaltfläche "Blast-Abfrage".</li>
	<li>
Geben Sie den Namen der das Gen des Interesses oder der GenBank "NM" Nummer in das obere Textfeld ein. Wählen Sie aus dem Pulldown Menü das Dataset, das die ausgewählte Hefe Bevölkerung für den Köder von Interesse zum Abrufen der Tabelle der Kreuzung Positionen auf der Registerkarte "Ergebnisse" entspricht. Standardmäßig werden Blast_Query die verschiedenen Positionen, die nach ihrer Fülle im Dataset, quantifiziert durch die ppm an der Gesamtzahl der Kreuzungen in der Datenbank gefunden bestellen.
	<ol>
<li>Finden Sie die am häufigsten vorkommende positionieren, ist "im ORF" und "In Frame". Der Wert für Position entspricht der Nukleotid-Position des Gens mit der NCBI Referenzsequenz ("NM" Anzahl) gefunden in das obere Textfeld ein. Diese Sequenz kann aus GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) abgerufen werden oder aus dem unteren Textfeld im Fenster "Blast_Query" kopiert werden. Hinweis: Ein Beispiel finden Sie in Abbildung 6, mittleren Bereich. Im Zentrum Dataset, die "Ergebnisse" zeigen als der am häufigsten vorkommende Kreuzung: "Position": 867; '#Junctions': 20033.821; "Abfrage starten", 1; CDS: Im ORF; und "Frame": im Rahmen. Nukleotid 867 der GenBank NCBI referenzsequenz NM_019648 ist der Anfang des Fragments Beute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn die Abfrage zu starten 1 ist, entwerfen Sie 5'-Ende des Primers einzuschließende die Nukleotide, die Positionsnummer entspricht und reichen Sie 25 Nukleotide stromabwärts von dieser Position (Abbildung 7). Wenn Abfrage starten mehr als 1 ist, bedeutet dies, dass gibt es zusätzliche Nukleotide zwischen der Gal4-Aktivierung-Domäne und die Beute-Reihenfolge des Interesses und der Primer stromabwärts nach Abfrage Startwert weitere beginnen sollte.</li>
	<li>Klicken Sie aus dem DEEPN Fenster auf "Lesen Sie Tiefe" unter"analysieren". Sobald das Lesen Tiefe Fenster geöffnet ist, geben Sie die NCBI-Referenz-Sequenz (NM) oder gen Name in das obere Textfeld ein. Verwenden Sie Pull-Down-Menü den entsprechenden Datensatz auswählen, der das angereicherte gen von Interesse enthält. Anhand der Tabelle auf der linken Seite und das Grafikdisplay auf der rechten Seite, um festzustellen, wie viele Lesevorgänge in den Daten gefunden wurden, die das Gen des Interesses (Abb. 7B) entsprechen.</li>
	<li>Entwerfen Sie eine 3' Ende Grundierung, die die Sequenz des Gens Fragments berechnet durch Lesen Tiefe erfassen wird. Wenn der ORF die Fülle der Lesevorgänge hinausgeht und Codon zu stoppen, die Grundierung zu entwerfen, so dass es das Stopp-Codon und der Region gerade stromaufwärts von der Stopp-Codon enthält. Wenn die Sequenzen für das Gen nicht, über das Stopp-Codon hinaus, verwenden die Ergebnistabelle, die am weitesten entfernten 3' Region finden, die erkannt und nutzen Sie diese Position als die am weitesten 3' Stellung, die Grundierung zu platzieren. Hinweis: Das Lesen Sie Tiefe Programm scannt in Abständen Sequenzen zu finden, die die angegebenen gen/cDNA von Interesse zu entsprechen. Dies hilft vorherzusagen, wo die häufigste Beute Fragment 5' und 3' Ende für dieses Gen in der Probe. Lesen Sie ausführlich über die Länge der Sequenz Schwankungen sind normal, wie in Abbildung 7ersichtlich. Wenn die erfahren Sie Tiefe eindeutig vorbei das Stopp-Codon ist, bedeutet dies, dass die Beute Fragment erstreckt sich über das Stopp-Codon und somit der 3'-Primer kann einfach die Region rund um das Stopp-Codon entsprechen.</li>
	<li>
Durchführen einer PCR-Reaktion 50 µL pro gen. Jede Reaktion enthält 25 Pmol jedes vorwärts und rückwärts Grundierung passend die Beute-Bibliothek-Plasmid (siehe Tabelle der Materialien). Reaktionen enthalten auch 25 µL der High-Fidelity-2 X PCR Master Mix, 5 µg DNA-Probe und Wasser bis zu 50 µL.
	<ol>
<li>Verstärken Sie Reaktionen für 25 Zyklen mit Verlängerung von 3 min bei 72 ° C, annealing Temperatur von 55 ° C für 30 s und Denaturierung bei 98 ° C für 10 s. vorauszugehen, Radfahren durch eine 30 s Denaturierung bei 98 ° C und folgen mit einer 5 min Inkubation bei 72 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens.">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li><li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome.">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li><li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics.">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).</li><li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrY2H-seq:+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping.">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li><li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions.">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+Next-Generation+Sequencing+Reads.">Alignment of Next-Generation Sequencing Reads.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17, 13 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Die hier beschriebenen Software-Suite erlaubt es, vollständig verarbeiten und analysieren Hochdurchsatz DNA-Sequenzierungsdaten aus einem DEEPN Experiment. Das erste Programm ist MAPster, die die DNA-Sequenz lautet in standard Fastq-Dateien und ordnet ihre Position auf eine Referenz-DNA für downstream-Processing durch eine ganze Reihe von Informatik-Programme einschließlich der DEEPN Software. Das Dienstprogramm der MAPster Schnittstelle und seiner Fähigkeit, mehrere Jobs, Mähdrescher Eingabedateien, die Warteschlan...

Ein Ansatz zur Protein-Interaktionen zu entdecken ist die Hefe 2-Hybrid (Y2H) Assay, welche Heldentaten Hefe-Zellen entwickelt, die wachsen nur, wenn ein Protein des Interesses zu einem Fragment eines interagierenden Partner1bindet. Erkennung von mehreren Y2H Interaktionen kann nun mit Hilfe von massiven parallelen Hochdurchsatz-Sequenzierung erfolgen. Mehrere Formate wurden2,3,4,5 darunter eine, die wir entwickelt, wo die Populationen in Batch unter Bedingungen angebaut werden, die für die Hefe enthalten Plasmide, die produzieren auswählen beschrieben eine positive Y2H Interaktion6. Der Workflow entwickelt, bezeichnet DEEPN (dynamische Bereicherung für Evaluation of Protein Networks), identifiziert differentielle Interactomes aus der gleichen Beute-Bibliotheken, um Proteine zu identifizieren, die mit einem Protein (oder Domäne) Vsinteragieren. ein weiteres Protein oder einer conformationally unterschiedliche mutierten Domäne. Eines der wichtigsten Schritte in diesem Workflow ist ordnungsgemäße Verarbeitung und Analyse der DNA-Sequenzierungsdaten. Einige Erkenntnisse können durch einfach zählen die Anzahl der Lesevorgänge für jedes Gen sowohl vor als auch nach der Auswahl von Y2H-Interaktionen in einer Art und Weise analog zu einem RNA-Seq-Experiment. Jedoch kann viel tiefer gehende Informationen aus dieser Datensätze, einschließlich Informationen über die Subdomain eines bestimmten Proteins, das in der Lage, eine Y2H-Interaktion ist extrahiert werden. Darüber hinaus während der DEEPN Ansatz wertvoll ist, kann viele Wiederholungen der Probe zu analysieren umständlich und teuer werden. Dieses Problem wird mithilfe eines statistischen Modells, das entwickelt wurde speziell für DEEPN Datasets wo ist die Anzahl der Wiederholungen begrenzt6gemildert. Verarbeitung und Analyse der DNA-Sequenzierung Datasets zuverlässige, vollständige, robuste und zugänglich für Ermittler ohne Bioinformatik-Kompetenz machen, entwickelten wir eine Suite von Software-Programmen, die alle Schritte der Analyse zu decken.
Diese Suite von Stand-alone-Software-Programme, die auf Desktopcomputern ausgeführt umfasst MAPster, DEEPN und Stat_Maker. MAPster ist eine grafische Benutzeroberfläche, die ermöglicht, dass jede Fastq-Datei in der Warteschlange für das Mapping, das Genom, die mit dem HISAT2 Programm7, Herstellung einer standard .sam-Datei zur Verwendung in downstream-Anwendungen. DEEPN besteht aus mehreren Modulen. Es ordnet und zählt liest, ähnlich wie eine RNA-Seq Typ Quantifizierung mit Hilfe des Moduls 'Gene Count' gen entspricht. Auch die Sequenzen entsprechend der Kreuzung zwischen der Gal4 transkriptionelle Domäne und die Beute Sequenz extrahiert und sammelt die Position dieser Kreuzungen zu deren Prüfung durch vergleichende Tabellen und Grafiken (mit Hilfe des Moduls "Junction_Make") Das Modul "Blast_Query" ermöglicht einfache Inspektion, Quantifizierung und Vergleich der Kreuzung Gal4 Kreuzung Sequenzen. Stat_Maker wertet die Lesevorgänge pro gen angereicherte Daten statistisch als eine Möglichkeit der Priorisierung wahrscheinlich Y2H-Hits. Hier beschreiben wir, wie diese Software-Programme verwenden und vollständig analysieren die DNA-Sequenz, mit denen Daten aus einem DEEPN Y2H experimentieren. Versionen von DEEPN sind auf PC, Mac und Linux Systeme ausgeführt. Andere Programme, wie das Mapping-Programm MAPster und DEEPN-Statistik-Modul Stat_Maker Vertrauen auf Unterroutinen, die unter Unix laufen und sind nur auf Mac und Linux-Systeme verfügbar.

<table><tbody><tr><td>Mapster</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/MAPster/releases</td></tr><tr><td>DEEPN software</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td></tr><tr><td>Statmaker</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td></tr><tr><td>Minimum computer system</td><td>Apple</td><td></td><td>Mac Intel Core i5 or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>4 Gb RAM or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>500 Gb Disk spce or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>OS 10.10 or higher</td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td></td><td>Intel i5-7400 or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>4 Gb RAM or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>500 Gb Disk spce or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>Windows 7 or higher</td></tr></tbody></table>

informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens

Wir haben die Hefe 2-Hybrid Assay um gleichzeitig entdecken Sie Dutzende von Transienten und statische Protein-Interaktionen in einem einzigen Bildschirm nutzen Hochdurchsatz-kurze lesenden DNA-Sequenzierung angepasst. Die daraus resultierende Sequenz Datasets können nicht nur verfolgen, welche Gene in einer Population, die bei Auswahl für positive Hefe 2-Hybrid Interaktionen angereichert sind, sondern auch geben detaillierte Informationen über die entsprechenden Subdomains von Proteinen ausreichend für Interaktion. Hier beschreiben wir eine vollständige Suite von Stand-Alone-Softwareprogramme, mit denen nicht-Experten, der Bioinformatik und statistische Schritte zur Verarbeitung und Analyse von DNA-Sequenz Fastq Dateien aus einem Batch Hefe 2-Hybrid Assay durchzuführen. Die Verarbeitungsschritte von dieser Software abgedeckt sind: (1) Mapping und Zählung Sequenz liest entspricht jeder Kandidat Protein kodiert in einer Hefe-2-Hybrid Beute-Bibliothek; (2) eine statistische Analyse-Programm, das die Anreicherung profile bewertet; und 3) Werkzeuge die translationale Rahmen und Position innerhalb der kodierenden Region des jedes angereicherten Plasmid, das die interagierenden interessierenden Proteine kodiert zu prüfen.

Fastq Daten zuordnen: der erste Schritt In praktisch allen NGS Anwendungen einschließlich DEEPN die erste Ausgabe eine kurze Sequenz liest-Datei ist, die durch Ausrichtung auf genomische zugeordnet werden müssen, verweisen transkriptomischen oder anderen DNA-8. Vor kurzem wurde das HISAT2 Ausrichtung Programm entwickelt, das State-of-the-Art Indexierung Algorithmen verwendet, um die Zuordnung Geschwindigkeit7,</sup...

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Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Tiefe Sequenzierung der Hefe Bevölkerung ausgewählt für positive Hefe 2-Hybrid Interaktionen potenziell liefert eine Fülle von Informationen über interagierenden Partner Proteine. Hier beschreiben wir den Betrieb von bestimmten Bioinformatik und aktualisierte Individualsoftware Sequenzdaten von solchen Bildschirmen zu analysieren.

Informatischen Analyse von Sequenzdaten von Batch-Hefe-2-Hybrid-Bildschirme

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

informatic-analysis-of-sequence-data-from-batch-yeast-2-hybrid-screens

Research

JoVE Journal

Genetics

7.1K Aufrufe.  University of Iowa. Tiefe Sequenzierung der Hefe Bevölkerung ausgewählt für positive Hefe 2-Hybrid Interaktionen potenziell liefert eine Fülle von Informationen über interagierenden Partner Proteine. Hier beschreiben wir den Betrieb von bestimmten Bioinformatik und aktualisierte Individualsoftware Sequenzdaten von solchen Bildschirmen zu analysieren.

Serie: Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Forschung

Biochemie

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetik

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Genetische Kartierung von Thermotoleranzunterschieden zwischen Spezies von Saccharomyces Hefe über Genom-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Immunologie und Infektion

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Biologie

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Biomolekulare Interaktionsstudien mit der Hefe-Zwei-Hybrid-Technik 

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the role(s) and function(s) of a specific protein-protein interaction is to compare the phenotype of the wild-type (with the relevant protein-protein interaction) and those of mutants that lack the relevant interaction. Therefore, if such mutants can be isolated, they will help to elucidate the related biological processes. The yeast two-hybrid (Y2H) procedure is a powerful approach not only to detect protein-protein interactions but also to isolate interaction-null/impaired mutants. In this article, a protocol is presented to isolate interaction-null/impaired mutants using Y2H technology. First, a mutation library is constructed by combining the polymerase chain reaction and efficient seamless cloning technology, which efficiently excludes the empty vector from the library. Second, interaction-null/impaired mutants are screened by the Y2H assay. Because of a trick in the Y2H vector, undesired mutants, such as those with frameshift and nonsense mutations, are efficiently eliminated from the screening process. This strategy is simple and can, therefore, be applied to any combination of proteins whose interaction can be detected by the two-hybrid system.

Autor im Rampenlicht: Verbesserte Isolierung von Interaktions-Null-Mutanten in Hefe

The interactions of biomolecules, such as protein-protein interactions, are the molecular basis of biological functions. If interaction-null/impaired mutants that specifically lack the relevant interaction can be isolated, they will greatly help to understand the function(s) of this interaction. This article presents an efficient way to isolate interaction-null/impaired mutants.

Isolierung von Interaktions-Null-/beeinträchtigten Mutanten mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...