שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר מנגנוני ההתקף, כגון אילו תת-תפוקות עצביות אחראיות להתקפיים אלקטרוגרפיים ולסיום. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא יכולה לשחזר אירועי התקף אלקטרוגרפי, על פי דרישה, ובמודלים vivo ו- in vitro המזכירים את אלה שנצפו קלינית. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לחפש טיפולים פוטנציאליים נגד התקפים, על ידי ניסיון לעורר אירועי התקף אלקטרוגרפי במהלך היישום של מועמדים שונים נגד התקפים סמים.
כדי להכין את פרוסות קליפת המוח, הדבק את רקמת המוח preclinical על הבמה Vibratome, באמצעות דבק דבק מיידי. מניחים בעדינות את מחזיק הדגימין במגש החיץ. תבטח שהחלק הגבי של המוח פונה ללהב של הויברטום.
פורסים את המוח לחלקים בעובי 450 מיקרומטר, בכיוון הגב עד הגחון. בצע את החתך הראשון במוח החיה preclinical כדי להסיר את נורת הריח. לאחר מכן, בצע את החתכים הבאים עד שהאזור המוטורי somatosensory הוא ציין.
השתמש פיפטה משעמם רחב. מעבירים את פרוסות הקרונטל הממוקדות לצלחת פטרי המכילה תסכולת ניתוח קרה. לפרוסות הקורונאליות, בצעו חתך רוחבי ממש מתחת לקומיסר הניאו-קליפתי, ולאחר מכן, חותכים בקו האמצע כדי להפריד בין ההמיספרות.
לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח חדש כדי לחתוך כל רקמה עודפת מהפרוסות. זה קריטי לבצע את הליך חיתוך המוח ביעילות. כל רגע רקמת המוח אינה שקועה ב- ACSF, מזיקה לאיכותה.
רקמת מוח פגומה ואיכותית פחות נוטה פחות ליצור אירועי התקף אלקטרוגרפי. מעבירים לרגע את החלק הגבי של פרוסות הקורונל, המכילות את קליפת המוח הניאו, לצלחת פטרי שנייה במילוי 35 מעלות צלזיוס ACSF. לאחר מכן, מיד להעביר את הפרוסות לתא הדגירה, המכיל 35 מעלות צלזיוס פחמימות ACSF.
השאירו את פרוסות המוח שקועות מעט בתא הדגירה ב 35 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, להסיר את תא הדגירה מן אמבט המים ולאפשר לו לחזור לטמפרטורת החדר. המתן שעה עד שפרוסות המוח יתאוששו, לפני ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
בהליך זה, לגזור נייר עדשה כי הוא קצת יותר גדול מאשר פרוסת המוח. השתמש פיפטה רחב נשא או מברשת פירוט כדי להעביר פרוסת מוח על נייר עדשה לגזור כי הוא החזיק במקום באמצעות פינצטה שיניים. לאחר מכן, להעביר את נייר העדשה עם פרוסת מוח לתא ההקלטה, ולאבטח אותו למקומו עם מסך נבל.
לאחר מכן, שפע את פרוסת המוח בתא ההקלטה עם ACSF פחמימות ב 35 מעלות צלזיוס בקצב של שלושה מיליליטר לדקה. השתמש במדחום דיגיטלי כדי להבטיח שתא ההקלטה יהיה 33 עד 36 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, למילוי לאחור אלקטרודות זכוכית עם 10 microliters של ACSF, באמצעות מזרק המילטון.
מתחת לסטריאומיקרוסקופ פי 20, הנחה את אלקטרודה הזכוכית ההקלטה לשכבה הקורטיקלית השטחית, שתיים, שלוש, באמצעות מניפולטורים ידניים. הצג את הפעילות החשמלית של פרוסת המוח עם תוכנה סטנדרטית. כדי לגרום לפעילות דמוית התקף אלקטרוגרפי, יש לפזר את פרוסת המוח ב-ACSF המכילה 4-AP ב-100 מיקרו-מולאר.
הצג את הפעילות החשמלית של פרוסת המוח עם תוכנה סטנדרטית. כדי ליצור אירועים דמויי התקף אלקטרוגרפי, באמצעות אסטרטגיה אופטוגנטית על פרוסות המוח מעכברים אופטוגנטיים, השתמש מניפולטור ידני כדי למקם סיב אופטי בקוטר 1,000 מיקרון ישירות מעל אזור ההקלטה. החל פולס קצר של אור כחול כדי ליזום אירוע ictal.
תוכנית מבוססת MATLAB ידידותית למשתמש פותחה במיוחד כדי לזהות ולסווג את הסוגים השונים של אירועי אפילפטיפורם המתרחשים במבחנה ובמודלים התקפים 4-AP. תוכנית זיהוי זו זמינה ממחזר GitHub של מעבדות ואליאנטה. היישום של 100 micromolar 4-AP באיכות טובה 450 מיקרון בגודל פרוסות המוח קליפת המוח מעכבר VGAT channelrhodopsin לנוער, אמין המושרה אירועים דמויי ictal חוזרים בתוך 15 דקות.
היישום של 100 micromolar 4-AP לפרוסות באיכות ירודה, הביא אירועים מתפרצים או פעילות spiking. בממוצע, 40% מהפרוסות מכל מוח פרה-קליני נותח, יצרו בהצלחה אירועים דמויי ictal. יתר על כן, 83% מהעכברים שנותרו גרמו לפחות לפרוסת מוח אחת שיצרה בהצלחה אירועים דמויי ictal.
בפרוסות מוח עם אירועים דמויי ictal המתרחשים באופן ספונטני, היישום של פעימת אור קצרה של 30 אלפיות שנייה על פרוסת המוח, עורר באופן אמין אירוע דמוי ictal שהיה זהה במורפולוגיה. אותם ממצאים נעשו בפרוסות מוח מתעלה אחת שלך שני עכברים. לכן, ללא קשר לאיזה תת-תפוקה עצבית הופעלה, כל אירוע סנכרון קצר ברשת העצבית הקורטית המבודדת, הוביל להתפרצות של אירוע דמוי ictal.
אירועים דמויי ictal אלה הורכבה מספייק סנטינל, ירי דמוי טוניק, ירי דמוי קלוני ופעילות דמוית פרץ לקראת הסוף. הם היו דומים בטבע לחתימות האלקטרוגרפיות הקשורות להתקפים קליניים. בעקבות הליך זה, סוגים אחרים של מעברים מצב המוח יכול להתבצע כדי לענות על שאלות כמו, מה הם מנגנונים ביולוגיים נוירו שבבסיס מעברי מצב המוח?
וכיצד אנו יכולים לווסת את המעברים האלה כדי למנוע כניסה למצבי מוח פתולוגיים שונים?
