이 방법은 전극 발작 발병 및 종료에 어떤 신경 하위 집단이 담당하는지와 같은 발작 메커니즘의 연구에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은, 전극 발작 이벤트를 재현 할 수 있다는 것입니다, 수요에, 그리고 생체 내 및 생체 내 모델은 임상적으로 관찰되는 것을 연상시킨다. 이 기술은 또한 다른 항 발작 약물 후보의 적용 하는 동안 전기 발작 이벤트를 트리거 하려고 하 여 잠재적인 항 발작 치료를 검색 하는 데 사용할 수 있습니다.
피질 조각을 준비하려면 즉시 접착 접착제를 사용하여 전임상 뇌 조직을 진동 단계에 붙입니다. 스펙미닌 홀더를 버퍼 트레이에 부드럽게 넣습니다. 뇌의 등대 부분이 진동의 블레이드를 향하고 있음을 보장하십시오.
뇌를 450 마이크로미터 두께의 섹션으로 슬라이스하고 등쪽에서 복부 방향으로 만듭니다. 후각 전구를 제거하기 위해 전임상 동물 뇌에서 첫 번째 절단을 합니다. 그런 다음, 색소 감각 모터 영역이 관찰 될 때까지 후속 컷을합니다.
넓은 보어 파이펫을 사용하십시오. 대상 코로나 슬라이스를 차가운 해부 용액이 들어 있는 페트리 접시에 옮춥시다. 관상 슬라이스의 경우, 네오 피질 쉼표 바로 아래에 횡선을 잘라낸 다음 중간선에서 잘라 반구를 분리합니다.
그런 다음 새 면도날을 사용하여 슬라이스에서 과도한 조직을 차단합니다. 뇌 슬라이스 절차를 효율적으로 수행하는 것이 중요합니다. 뇌 조직이 ACSF에 침수되지 않는 매 순간, 그 품질에 해롭습니다.
손상, 가난한 품질의 뇌 조직은 전기 발작 이벤트를 생성 할 가능성이 적습니다. 네오 피질을 함유한 관상 슬라이스의 등쪽 부분을 35도 ACSF로 채워진 두 번째 페트리 접시로 잠시 옮킨다. 그런 다음, 즉시 35섭씨 환원 ACSF를 포함하는 인큐베이션 챔버로 슬라이스를 전송한다.
30 분 동안 35섭씨35도에서 인큐베이션 챔버에 약간 잠긴 뇌 조각을 둡니다. 그런 다음 수조에서 인큐베이션 챔버를 제거하고 실온으로 돌아갈 수 있습니다. 뇌 슬라이스가 회복될 때까지 1시간을 기다린 후 전기생리학적 기록을 수행하십시오.
이 절차에서 뇌 슬라이스보다 약간 큰 렌즈 용지를 잘라냅니다. 넓은 보어 파이펫 또는 디테일 브러쉬를 사용하여 치과 용 트위저를 사용하여 제자리에 보관되는 잘라낸 렌즈 용지에 뇌 슬라이스를 전달합니다. 그런 다음 뇌 슬라이스로 렌즈 용지를 녹음실로 옮기고 하프 스크린으로 제자리에 고정합니다.
그 후, 분당 3밀리리터의 속도로 35도에서 CARbogenated ACSF와 기록 챔버에서 뇌 조각을 교묘. 디지털 온도계를 사용하여 녹음 챔버가 섭씨 33~36도인지 확인합니다. 그런 다음 해밀턴 주사기를 사용하여 ACSF의 10 마이크로 리터로 유리 전극을 백필하십시오.
20배의 스테레오현미경하에서, 수동 조작기사용으로 기록 유리 전극을 피상 적 피질 층, 2, 3개로 안내한다. 표준 소프트웨어로 뇌 슬라이스의 전기 적 활동을 봅니다. 전극 발작과 같은 활동을 유도하려면 100 마이크로 몰러에서 4-AP를 포함하는 ACSF로 뇌 슬라이스를 교감하십시오.
표준 소프트웨어로 뇌 슬라이스의 전기 적 활동을 봅니다. 전자성 발작과 같은 이벤트를 생성하려면, 광유전학 마우스에서 뇌 조각에 대한 광유전학 적 전략을 사용하여, 수동 조작기를 사용하여 기록 영역 바로 위에 1, 000 미크론 코드 직경 광섬유를 배치합니다. 간단한 청색 광펄스를 적용하여 ictal 이벤트를 시작합니다.
사용자 친화적인 MATLAB 기반 프로그램은 시험관 내 및 생체 내 4-AP 발작 모델에서 발생하는 다양한 유형의 간질 이벤트를 감지하고 분류하기 위해 특별히 개발되었습니다. 이 검출 프로그램은 발리안테 연구소 GitHub 리포지토리에서 사용할 수 있습니다. 100 마이크로몰러 4-AP의 응용 프로그램은 좋은 품질450 미크론 크기의 피질 뇌 슬라이스 청소년 VGAT 채널로도프신 마우스에서, 안정적으로 15 분 이내에 재발 ictal 같은 이벤트를 유도.
100 마이크로 몰러 4-AP의 응용 프로그램은 가난한 품질의 조각에, 파열 이벤트 또는 스파이크 활동 결과. 평균적으로 해부된 전임상 뇌의 슬라이스 중 40%가 Ictal과 같은 이벤트를 성공적으로 생성했습니다. 더욱이, 해부된 마우스의 83%는 Ictal와 같은 사건을 성공적으로 생성한 적어도 하나의 뇌 슬라이스를 초래했습니다.
자발적으로 발생하는 ictal 과 같은 이벤트가있는 뇌 슬라이스에서 뇌 슬라이스에 짧은 30 밀리 초 광 펄스를 적용하여 형태학에서 동일한 ictal 과 같은 이벤트를 안정적으로 트리거했습니다. 같은 사실 인정은 네 하나의 Channelrhodopsin 두 마우스에서 뇌 조각에서 만들어졌다. 따라서, 어떤 신경 하위 인구가 활성화되었든, 격리된 피질 신경망에서의 임의의 간략한 동기화 이벤트는 ictal 과 같은 이벤트의 발병으로 이어졌다.
이 ict같은 사건은 센티넬 스파이크, 토닉 같은 발사, 클로닉 같은 발사, 끝까지 버스트와 같은 활동으로 구성되었다. 그(것)들은 임상 포착과 관련되었던 전기 서명과 본질적으로 유사했습니다. 이 절차에 따라, 뇌 상태 전환의 다른 유형은 같은 질문을 해결하기 위해 수행 할 수 있습니다, 뇌 상태 전환의 기본 신경 생물학적 메커니즘은 무엇입니까?
그리고 우리는 어떻게 다양한 병리학적 뇌 상태에 들어가는 것을 방지하기 위해 이러한 전환을 조절 할 수 있습니까?
