この方法は、電解発作の発症と終了に責任を持つ神経亜集団などの発作メカニズムの研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、それが臨床観察されたものを連想させる、オンデマンド、およびインビボおよびインビトロモデルの電図発作事象を再現できることである。この技術は、異なる抗けいれん薬候補の適用中に電解発作事象を引き起こそうとすることによって、潜在的な抗発作療法を探索するためにも使用することができる。
皮質スライスを準備するには、インスタント接着接着剤を使用して、ビブラートメステージに前臨床脳組織を接着します。静かに、スペシミンホルダーをバッファートレイに入れます。脳の後ろ部分がビブラートメのブレードに面していることを確認します。
脳を450マイクロメートルの厚い部分にスライスし、腹側方向に裏側に入れます。嗅球を取り除くために前臨床動物の脳の最初のカットを行います。次いで、体性感覚運動領域が観察されるまで、その後の切削を行う。
広いボアピペットを使用してください。ターゲットとなるコロナスライスを、冷解解液を含むペトリー皿に移します。コロナスライスの場合は、新皮質のコミュニケーションのすぐ下に横断的なカットを行い、正中線で切断して半球を分離します。
その後、新しいカミソリの刃を使用して、スライスから余分な組織を切断します。脳スライス手順を効率的に実行することが重要です。.脳組織がACSFに沈んでいないすべての瞬間は、その品質に有害である。
損傷を受け、質の悪い脳組織は、電図発作イベントを発生させる可能性が低い。新皮質を含むコロナスライスの後部を、摂氏35度のACSFで満たされた2番目のペトリー皿に一瞬移します。次いで、速やかに35°Cのカルボゲン化ACSFを含むインキュベーションチャンバーにスライスを移す。
脳スライスを35°Cのインキュベーションチャンバーにわずかに水没させて30分間放置します。その後、水浴からインキュベーションチャンバーを取り出し、室温に戻す。電気生理学的記録を行う前に、脳のスライスが回復するまで1時間待ちます。
この手順では、脳スライスよりもわずかに大きいレンズペーパーを切り取ります。広孔ピペットまたはディテールブラシを使用して、歯科用トゥイザーを使用して所定の位置に保持されている切り取られたレンズ紙に脳スライスを移します。次に、脳スライスを含むレンズペーパーを記録チャンバーに移し、ハープスクリーンで位置に固定します。
その後、1分間に3ミリリットルの速度で35°Cでカルボゲン化ACSFを記録チャンバーで脳スライスを使い過ごします。デジタル温度計を使用して、記録チャンバーが摂氏33~36度であることを確認します。次に、ハミルトンシリンジを使用して、ACSFの10マイクロリットルでガラス電極をバックフィルします。
20倍の実体顕微鏡の下で、手動マニピュレータを使用して、記録ガラス電極を表面皮質層(2、3)に導きます。標準的なソフトウェアで脳スライスの電気的活動を表示します。電気的な発作のような活動を誘発するために、100マイクロモルで4-APを含むACSFで脳スライスを多量に使用する。
標準的なソフトウェアで脳スライスの電気的活動を表示します。電気的発作のような事象を生成するには、光遺伝学的マウスの脳スライスに光遺伝学的戦略を用いて、手動マニピュレータを使用して、記録領域の真上に1,000ミクロンのコード直径光ファイバーを配置します。青い光の短いパルスを適用して、イクタルイベントを開始します。
ユーザーフレンドリーなMATLABベースのプログラムは、インビトロおよびインビボ4-AP発作モデルで発生する様々なタイプのてんかん事象を検出し、分類するために特別に開発されました。この検出プログラムは、ヴァリアンテ研究所の GitHub リポジトリから入手できます。100マイクロモル4-APを若年性VGATチャネルロドプシンマウスから良質の450ミクロンサイズの皮質脳スライスに適用し、15分以内に再発性イクタル様事象を確実に誘導した。
100マイクロモル4-APを低品質のスライスに適用すると、イベントが破裂したり、アクティビティがスパイクしたりしました。平均して、各解剖前脳からのスライスの40%が、正常にイクタル状のイベントを生成した。さらに、解剖されたマウスの83%は、少なくとも1つの脳スライスをもたらし、イクタルのような事象を正常に生成した。
自発的に起こるictal様事象を有する脳スライスでは、脳スライスに短い30ミリ秒光パルスを適用し、形態において同一のictal様事象を確実に引き起こした。同じ発見は、あなたの1つのチャネルロドプシン2匹のマウスからの脳スライスで行われました。したがって、どのニューロン亜集団が活性化されたかに関係なく、孤立した皮質ニューラルネットワークにおける短い同期イベントは、ictal様事象の発症につながった。
これらの氷のような事象は、センチネルスパイク、強壮剤のような発射、クロニックのような発射、および終わりに向かってバーストのような活動で構成されていました。彼らは本質的に臨床発作に関連する電解署名と類似していた。この手順に従って、脳状態遷移の基礎となる神経生物学的メカニズムは何であるかのような質問に対処するために、他のタイプの脳状態遷移を行うことができます。
そして、様々な病理学的脳状態への侵入を防ぐために、これらの移行をどのように調節できるでしょうか?
