. אנחנו אסירי תודה על הדיונים מתחשב עם חברי המעבדה Ju Zhong מעבדה, ואת התמיכה הכלכלית מטעם אוניברסיטת מצב רייט.

הערה: פרוטוקול המתוארים כאן מיועדת לסינון פלסמידים ספריית הכלול 10 צלחות 96-ובכן אבל וניתן לשנותם למעלה או למטה בהתאם. הפרוטוקול צריך לחזור כדי להשלים את ההקרנה כל ספריה. בדרך כלל, הקרנה נגד 10 צלחות של ספריית גנים בכל פעם ניתן לטפל בנוחות על ידי אדם אחד.
1. הכנה 96-ובכן שמרים טרנספורמציה
הערה: שלב זה מתבצע כמו בעבר תיאר7,10.
<ol><li>Aliquot 5 µL (בערך 50 – 100 ng) של פלסמיד DNA מספריה פלסמיד ערוכים כל טוב של צלחת 96-ובכן סיבוב המדרגה. הערה: דוגמה כזו ספרייה יהיה ספריית10ביטוי גנים שמרים.</li>
	<li>לחסן 150 מ ל מדיה דקסטרוז (YPD) peptone שמרים בבקבוקון 500 מ"ל עם מושבה (2 – 3 מ מ קוטר) של המתח הפלואידי שמרים W303α. דגירה אותם בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות (200 סל ד).</li>
	<li>למחרת בבוקר, למדוד את יתר600 של התרבות לילה ו לדלל את תרבות שמרים OD600 = 0.1 ב (עד) 2 ל' של YPD. תקופת דגירה זה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות (200 סל ד) של ~ 5 h עד התרבות מגיע OD600 = 0.4-0.6.</li>
</ol>2. שמרים טרנספורמציה
<ol><li>קציר התרבות שמרים על ידי מילוי שמיניית צנטריפוגה סטרילי 250 מ ל ו צריך שתוציאו אותם בטמפרטורת החדר x 3000 g עבור 10 דקות יוצקים את תגובת שיקוע מבלי לשבש את פעולת בגדר. הערה: לבצע את כל השלבים צנטריפוגה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את השמרים עם סטרילי מזוקק H2O. בשביל זה, להוסיף 100 מ של סטרילי H2O כל בקבוק צנטריפוגה, מערבולת זה ל resuspend בגדר תא. לשלב את התאים שטף 2 בקבוקים ו צנטריפוגה אותם ב x 3000 g עבור 5 דק יוצקים את תגובת שיקוע.</li>
	<li>רוחצים את התאים כל בקבוק ב- 100 מ של 0.1 M LiOAc/1XTE (100 מ מ LiOAc; 10 מ מ. טריס, pH 8.0; 1 מ מ EDTA) את centrifuge אותם ב x 3000 g עבור 5 דק לשפוך את תגובת שיקוע.</li>
	<li>בזמן, צריך שתוציאו להרתיח 5 מ של זרע סלמון DNA (10 מ"ג/מ"ל) ב- 100 ° C באמצעות תנור בלוק במשך 3 דקות, ואז צנני את זה על קרח.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב 25 מ של 0.1 M LiOAc/1XTE ב כל בקבוק, לשלב את התאים resuspended ולהעביר אותם אל בקבוק 150 מ. הוסף 5 מ של טרום מקורר הזרע סלמון DNA, דגירה זה ב 30 ° C עם טלטול (225 סל ד) למשך 30 דקות.</li>
	<li>שופכים את התערובת תא לתוך מאגר ריאגנט חד פעמי סטרילי, באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להעביר כל טוב של צלחת 96-ובכן עגול-התחתון המכיל את פלסמיד ספריית דנ א 35 µL של תערובת תא. מערבולת 96-ובכן צלחות באמצעות vortexer צלחת עבור 1 דקות ב- 1000 סל ד. דגירה הלוחות למשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד. הערה: לא מחסנית הצלחות, אז החום ניתן להעביר בצורה יעילה יותר. מצאנו כי vortexing הצלחות 96-ובכן-1,000 סל ד אינו גורם נוזלי לשפוך החוצה הבארות, אך מהירות מערבולת בטוח צריך להיבדק לפני ביצוע השלב.</li>
	<li>בבקבוקון, להכין 200 מ של המאגר טרנספורמציה המכילה ריכוז סופי של 40% PEG3350, דימתיל סולפוקסיד 10% ו- 0.1 M LiOAc. הכנת המאגר טרנספורמציה מיד לפני השימוש ומערבבים אותו ביסודיות ע י ניעור.</li>
	<li>הסר 96-ובכן הצלחות מן החממה של 30 מעלות צלזיוס ומערבבים אותם ל 30 s ב 1,000 סל ד באמצעות vortexer על צלחת. להוסיף µL 125 המאגר טרנספורמציה כל טוב ולאחר מכן מערבולת הלוחות עבור 1 דקות בכל 1,000 סל ד.</li>
	<li>דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות וחום ואז הלם השמרים על-ידי הצבת הלוחות חממה 42 º C למשך 15 דקות. הערה: לא מחסנית את הצלחות.</li>
	<li>Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 3000 g. הסר המאגר טרנספורמציה מן הבארות על ידי היפוך הלוחות על פח אשפה ולזרוק בכוח המאגר של הלוחות. כתם במהירות את הצלחות הפוכה על מגבת נייר נקי כדי להסיר את כל נוזל על הצלחות.</li>
	<li>יש לשטוף את התאים על-ידי הוספת µL 200 הצלחות של הנשירה מינימלי בינונית המתאים דה מרקר לבחירה על פלסמיד הספרייה. הערה: השתמשנו ההחלטיים סינתטי-בינוני.</li>
	<li>Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 3000 g ולהסיר את תגובת שיקוע על סל פסולת כמו שלב 2.10.</li>
	<li>הוסף µL 160 של מינימלי עורה-בינוני המכיל 2% גלוקוז. מערבולת הלוחות עבור 1 דקות ב- 1,000 סל ד דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות מבלי לרעוד. לאחר 48 שעות, שימו לב כי גלולה של שמרים טרנספורמציה גלוי בחלק התחתון של כל טוב.</li>
	<li>בעזרת מתקן נוזלי, להוסיף 100 µL של עורה-מדיה המכילה גלוקוז לבאר כל סדרה חדשה של 96-ובכן צלחות.</li>
	<li>מערבולת הלוחות המכילים שמרים טרנספורמציה (מתוך שלב 2.13) ב- 1,000 סל ד ל 30 ס' באמצעות משכפל 96 פינים פלסטיק סטרילית, למקם את הסיכות הבארות המכילים שמרים טרנספורמציה, ואז לחסן אותם לתוך הבארות המקביל של הלוחות החדשים מלא מדיה. דגירה הלוחות חדש ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה. הערה: אם עובד עם 10 צלחות, המדיום יכול גם ובשמפו באופן ידני באמצעות פיפטות רב ערוצית.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, גלולה של שמרים צריך להיות גלוי כל הבאר המכילים שמרים בהצלחה טרנספורמציה. לשמירת זנים אלו שמרים גליצרול מניות, להוסיף 50 µL של גליצרול 50% מכל קידוח, מערבולת הלוחות ל 30 s ב 1,000 סל ד, לאטום את הצלחות עם דבק סלוטייפ לסתימה ולהקפיא אותן ב- 80 ° C הערה: השלבים לעיל רק צריך להתבצע פעם אחת. הקרנות עתידיים של מודלים שמרים שונים נגד המאגר ריאגנט חד פעמיים באותה ספריה ניתן להתחיל המניות גליצרול, פנה/י מיד מן השלבים שלהלן.</li>
</ol>3. הזדווגות בין תאים המכילים גנים ספריית ושמרים שאילתה
<ol><li>כדי להחיות את זני ספריית המלאי גליצרול, לקחת את הצלחות 96-ובכן מהמקפיא-80 ° C, הסר איטום הקלטת, ולתת השמרים להפשיר בטמפרטורת החדר במשך כ 30 דקות.</li>
	<li>ברגע השמרים יש הקרת, השתמש משכפל 96 פינים פלסטיק סטרילית כדי לחסן את מניות גליצרול µL 160 של טרי עורה-מדיה המכיל 2% גלוקוז ב 96-ובכן צלחות דגירה אותם ב 30 ° C עבור ה 24. מיד לאחר זנים ספריית משמשים , חותם את הצלחות עם דבק סלוטייפ לסתימה, ולהחזיר אותם במקפיא-80 ° C.</li>
	<li>באותו יום ספריה זנים (W303α) הם הקרת, לחסן את המתח שמרים שאילתה (כאן, FUS ב W303a) 50 מ של YPD לגדל אותו בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.</li>
	<li>למחרת בבוקר, שופכים את המתח שמרים שאילתה מאגר ריאגנט חד פעמי סטרילי, ולאחר aliquot µL 160 של המתח שאילתה כדי כל טוב של צלחת 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי.</li>
	<li>באמצעות מנפק נוזלי, לוותר על 160 µL של YPD מדיה לתוך כל טוב של עשר לוחות 96-ובכן. השתמש הצלחות האלה מאוחר יותר להזדווגות המתח שמרים שאילתה עם שמרים הספרייה.</li>
	<li>בקצרה מערבולת הצלחת 96-ובכן המכיל את המתח שאילתה ולאחר מכן להשתמש משכפל 96 פינים סטרילי כדי להעביר את השאילתה זן אל צלחות YPD.</li>
	<li>בקצרה מערבולת הספרייה זן צלחות ולהשתמש, עבור כל אחד מהלוחות זן בספריה, משכפל 96-pin חדש סטרילי כדי להעביר זנים ספריית הפלטות YPD שיש, כמובן עם המתח שאילתה. הערה: תאים גליצרול לאבד את הכדאיות שלהם לאחר מספר מחזורים ההפשרה-להקפיא. מבוקש זנים ספריית אחסון לטווח ארוך (מקפיא-80 ° C) בהקדם האפשרי לשמור על הספריה באיכות טובה, ומוכנים לשימוש עתידי. מתוחזק כראוי, המניה גליצרול ניתן להיות קפוא, הקרת לפחות 10 פעמים. אנו גם ממליצים לשמור עותק לעבודה של עותקי גיבוי של המניה גליצרול. כאשר המניה עבודה לא עובד, מיד לעשות חדש עובד עותק מעותק הגיבוי.</li>
	<li>דגירה הלוחות YPD ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה ה הערה כי גלולה של שמרים יהיה גלוי בחלק התחתון של כל טוב לאחר 24 שעות.</li>
	<li>מילוי 96-ובכן צלחות עם מדיום הנשירה מינימלי המכיל 2% raffinose, התואם את סמני לבחירה על פלסמיד בנימה זו שאילתה כמו גם על ספריית פלסמיד (למשל, כאן עורה - שלו-).</li>
	<li>השתמש משכפל 96 פינים סטרילי כדי להעביר שמרים YPD הזדווגות תרבויות בתקשורת סלקטיבי. דגירה הלוחות 96-ובכן ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות; רק תאים שיש הזדווגו שמרים דיפלואידי בנוי תאים, לכן, להכיל פלסמיד השאילתה את שני ו פלסמיד הספריה יוכלו לגדול מדיה זו. לאחר יומיים, להתבונן גלולה מוצגת בתחתית הבארות.</li>
</ol>4. הבחינה Assay
<ol><li>
לאחר 48 שעות של צמיחה בתקשורת סלקטיבי המכילים raffinose, במקום השמרים על פלטות אגר.
	<ol>
<li>להכין 2 סטים של צלחות עורה-שלו-נשירת המכיל 2% אגר באמצעות לוחות פוליסטירן ברור, אחד המכיל 2% גלקטוז והמכיל גלוקוזה 2% אחרים.</li>
		<li>מערבולת 96-ובכן לוחות עבור 1 דקות ב- 1,000 סל ד, ואז במקום השמרים את הצלחות עורה-שלו-נשירת המכיל 2% גלקטוז ו 2% אגר (גנים FUS וספריית הם המושרה) וכדי הלוחות עורה-שלו-נשירת המכיל 2% גלוקוז ו- 2% אגר (FUS וספריית גנים מודחק) באמצעות מכונת spotting רובוטית, לפיו התרבות בכל הוא מקום טוב על גבי הלוחות אגר ב ארבע פעמים (קרי, התרבות 1 הוא מקום טוב למקומות 4 בצלחת אגר).</li>
		<li>לאחר הבחינה, תן את הצלחות אגר יבש, ולאחר מכן למקם אותם במהופך בתוך חממה 30 מעלות צלזיוס. לצלם את הצלחות אגר כל 24 שעות לרשום צמיחה מהירה יותר או יותר שמרים שבו הוא חולץ רעילות לאמץ השאילתה או לרשום צמיחה איטית יותר/פחות שבו רעילות לאמץ השאילתה היא מתעצמת. תקופת דגירה לוחיות הרישוי של 4 ימים. הערה: התרבות בכל טוב ניתן הבחין על פלטות אגר 1 ל-1, כפי שמוצג של שיטה המבוססת על השינוי הקודם10. עם זאת, את 1-4 אכון כאן (אשר ניתן להגדיר בנוחות לשימוש במכונה spotting רובוטית) מגביר באופן משמעותי את היציבות של וזמינותו על-ידי הפחתת מספר תוצאות חיוביות שגויות. כניסות חיוביות נחשבים רק כאשר כל המושבות 4 מאותו מראים הפנוטיפ דומה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+(Saccharomycotina).">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genes+that+enhance+the+toxicity+of+a+mutant+huntingtin+fragment+or+alpha-synuclein.">Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein.</a> Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology.">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li><li>Treusch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+links+between+Abeta+toxicity,+endocytic+trafficking,+and+Alzheimer's+disease+risk+factors+in+yeast.">Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast.</a> Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).</li><li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+model+of+FUS/TLS-dependent+cytotoxicity.">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+and+genetic+modifiers+of+aggregation+and+toxicity+for+the+ALS+disease+protein+FUS/TLS.">Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).</li><li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li><li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+yeast+plasmid+overexpression+screen.">High-throughput yeast plasmid overexpression screen.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).</li><li>Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).</li><li>Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast-based+functional+genomics+and+proteomics+technologies:+the+first+15+years+and+beyond.">Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond.</a> Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li><li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לבצע מסך ביטוי פלסמיד באמצעות הזדווגות כדי להציג את ספריית פלסמיד לתוך המודל שמרים שמרים. באמצעות גישה זו, מספר מודלים שמרים רעילות חלבון מחלות ניווניות יכולים להיות מוקרן באמצעות אוסף אותם שמרים טרנספורמציה עם ספרייה פלסמיד. תהליך מפרך של שינוי רק צריך להתבצע ...

שמרים ניצני האפייה כבר בשימוש נרחב כדי להבין תהליכים תאיים הקשורים ישירות מחלות אנושיות מחקר מדעי בסיסי1 . יתר על כן, הוא שימש כאורגניזם מודל עבור לומד האדם הקשורים למחלה חלבונים, כגון אלה קשורה מחלות ניווניות הנפוצים ביותר, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, מחלת ניוון שרירים טרשת נפוצה לרוחב (ALS)2. יתרון של המודל שמרים היא הקלות שבה ניתן לבצע מסך הגנום כולו כדי לזהות הסלולר מסלולים הקשורים הרעילות של חלבונים הקשורים למחלות, ובכך נותן תובנה מנגנון הרעילות שלהם. מסך אחד כזה נקרא מסך ספריה של ביטוי, שבו כל אחד הגנים שמרים 5,500 בספריה ערוכים הופכת מודל שמרים לזהות אילו גנים יכולים לשנות רעילות כאשר overexpressed. שיטה זו הקרנה יושם בהצלחה במודלים שמרים מרובות ניווניות הקשורות למחלות חלבונים, כולל huntingtin של מחלת הנטינגטון3, α-synuclein עבור מחלת פרקינסון4,5 , Aβ עבור מחלת אלצהיימר6, ואת FUS TDP-43 ALS-7,-8,-9. בזמן זה נעשה בדרך כלל באופן תפוקה גבוהה10, השלב הכי מהגידולים של המסך בנפרד משתנה 5,500 גנים שמרים מספריה ערוכים. שלב זה חייב להתבצע בכל פעם שחוזר על עצמו ההקרנה, בכל פעם דוגמנית שהוקם שמרים צריך להילמד. חשוב למצוא דרך יעילה יותר כדי לבצע משימה זו.
תאי שמרים יכולה להתקיים stably בצורות הפלואידי והן דיפלואידי. ישנם שני מול ההזדווגות סוגים של תאים הפלואידי, הזדווגות סוג α. תאים הפלואידי של כל הזדווגות הקלד התוצרת, מפרישות פרומון ההזדווגות משלהם ספציפי, אשר מגיבים רק מול ההזדווגות סוג התאים. דבר זה מאפשר הזדווגות בין α תאים כדי לייצר תאים דיפלואידי יציב, / α. תהליך זה הוא ספונטני ויעיל מאוד11. אנחנו יכולים לנצל את מחזור החיים הייחודי של cerevisiae ס כדי להציג את ספריית פלסמיד. ליתר דיוק, כל הגן בספריה פלסמיד ערוכים תעבור טרנספורמציה לתוך תאים הפלואידי של סוג ההזדווגות אחד, דהיינו, α התא. אלה תאים המכילים את הגנים ספריית ואז יאוחסנו במלאי גליצרול בתבנית 96-ובכן ערוכים. עבור כל דגם שמרים צריך להיות מוקרן, תאי שמרים המכיל את הגנים ספריה יכולה להיות הקרת מן המלאי גליצרול ולאחר ההקרנה יכול להיעשות באמצעות הזדווגות עם המודל שמרים עניין בסוג השני ההזדווגות, כלומר, סוג ההזדווגות. הרעיון של שימוש ההזדווגות כדי להפגיש את שני גנים לתוך שמרים אינו חדש. זה יושם בהצלחה בשמרים תפוקה גבוהה ההקרנה שני-היברידית, שבו פיתיון לבנות (קרי, Gal4-הדי-איגוד תחום fusions) בסוג אחד ההזדווגות הוא הביא יחד באמצעות הזדווגות עם מבנה טרף מספריה ערוכים 12. אולם, אסטרטגיה זו מעולם לא הוחל ב ביטוי בספריה הקרנות, אשר תמיד השתמשו בשיטות מסורתיות טרנספורמציה.
המעבדה שלנו הקימה בעבר מודל שמרים של חלבונים הקשורים ALS FUS7. דרך ביטוי בספריה ההקרנה בשיטת טרנספורמציה גילינו חמש שמרים הגנים (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, ו VHR1) להציל את רעילות FUS כאשר overexpressed. ממצאים אלה שאושרו באופן עצמאי עם מחקר דומה על-ידי קבוצה אחרת8. hUPF1, homolog האנושית של ECM32, הוצגה מאוחר יותר לדכא את רעילות ראשי תאים עצביים13 , במודל חיה של ALS14 גם כן. באמצעות גנים חמש אלה כהוכחה עקרון, נדגים כי כל הגנים 5 בדומה להציל FUS רעילות כאשר הם יוכנסו המודל שמרים FUS על ידי הזדווגות. כיוון שמרים תאים המכילים את הגנים הספרייה יכולים להיות מאוחסנים לצמיתות במלאי גליצרול לתחייה בכל פעם שיש צורך, שיטה זו מבוססת על הזדווגות יסיר את הצעד גוזלת זמן של שינוי בכל פעם שהספרייה צריך להיות מוקרן נגד. מאז ההזדווגות היא יעילה במיוחד עם שינוי פלסמיד לא מעורב, אסטרטגיה זו פוחתת משמעותי גם את העלות המשויכת לטיהור ושינוי של ספרייה פלסמיד גדול. אנחנו יחולו בהצלחה בשיטה זו לספריית הקרנה נגד שמרים מודל של FUS.
התהליך להקרנה ההזדווגות מבוסס בקצרה מתואר באיור1. בתחילה, הספרייה פלסמיד ערוכים הופכת זן שמרים הפלואידי של הזדווגות מסוג α באמצעות פרוטוקול השינוי בתפוקה גבוהה שמרים שבו כל טוב של צלחת 96-ובכן מכיל שמרים טרנספורמציה עם פלסמיד ספריה ספציפית. זה אוסף של שמרים טרנספורמציה נשמרת מניה גליצרול כי ניתן הקרת לתחייה לשימוש מאוחר יותר. הדגם שמרים של עניין, רעילות FUS במקרה הזה, להפיקם בזן הפלואידי שמרים עם סוג ההזדווגות הנגדי (ההזדווגות סוג). באופן תפוקה גבוהה באמצעות המשכפלים 96 פינים סטרילי, הלחץ FUS ואת זני שמרים המכיל ספריית פלסמיד הועבר צלחות 96-ובכן המכיל מדיה עשירים, רשאי חבר. לאחר ההזדווגות, נפח קטן מכל טוב של התרבות ההזדווגות מועבר המכיל התקשורת הנשירה סינתטי אשר שמרים בלבד דיפלואידי המכיל שני FUS את הצלחות 96-ובכן, ספריית גנים יכולים לגדול. מכונת spotting רובוטית משמש לאחר מכן להעביר שמרים תרבות מכל קידוח על פלטות אגר שבו הביטוי FUS ואת הגנים ספריית מושרה.  בנוסף, תרבות שמרים הוא הבחין לשלוט פלטות אגר איפה FUS ואת הגנים הספרייה אינם מבוטאים. בעקבות גידול על פלטות אגר, הגנים או להחריף FUS רעילות יזוהו.

<table><tbody><tr><td>salmon Sperm DNA (SS-DNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD broth</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Granulated Agar</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Ura- drop out medium</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Lithium acetate, anhydrous</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350)</td><td>Spectrum Chemical&amp;nbsp;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96 Pin Replicator&amp;nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>non-treated, sterile</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research plus Multichannel Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>30-300ul volume</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R Centrifuge</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mating-based overexpression library screening in yeast

ניצני שמרים כבר בשימוש נרחב כמודל בלימוד חלבונים הקשורים עם מחלות אנושיות. בדיקה גנטית הגנום כולו הוא כלי רב עוצמה נפוץ במחקרים שמרים. הביטוי של מספר חלבונים הקשורים למחלות ניווניות של שמרים גורם cytotoxicity ויצירת צבירה, recapitulating ממצאים לראות בחולים עם הפרעות אלה. כאן, אנו מתארים שיטה לסינון מודל שמרים של הקשורים נוירודגנרטיביות החלבון FUS מודיפיקטורי שלה רעילות. במקום להשתמש טרנספורמציה, הפלטפורמה ההקרנה הזאת מסתמכת על הזדווגות של שמרים להציג ספריה ערוכים של פלסמידים לתוך המודל שמרים. שיטת החיזור יש שני יתרונות ברורים: ראשית, זה יעיל ביותר; שנית, הספרייה ערוכים מראש טרנספורמציה של פלסמידים ניתן לאחסן לטווח ארוך כמו מניה גליצרול, ויישם במהירות למסכי אחרים ללא השלב מהגידולים של טרנספורמציה לתוך המודל שמרים בכל פעם. נדגים כיצד שיטה זו בהצלחה ניתן להשתמש עבור גנים המשנים הרעילות של FUS מסך.

החלבון ALS-הקשורים FUS, RNA/DNA מחייב חלבון, נחקרה בעבר שמרים הפלואידי7,8. השיטה מבוססת על שינוי גנטי. הסינון באמצעות גילו מספר גנים שמרים לדיכוי FUS רעילות. Homolog האנושית של אחד הגנים שמרים הודגם מאוחר יותר כדי להיות אפקטיבית שיתוק רעילות תאים עצביי?...

Watch this Scientific Journal Video about Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast at JoVE.com

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

mating-based-overexpression-library-screening-in-yeast

Research

JoVE Journal

Genetics

7.6K Views.  Wright State University. מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.

Video: Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Biochemistry

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Immunology and Infection

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Biology

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>אופטימיזציה של תפקודי חלבונים באמצעות טכניקות תצוגת פני שטח של שמרים

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

Bioengineering

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

בימוי שיטת אבולוציה