Siamo grati per la premurose discussioni con i membri del laboratorio Ju e laboratorio di Zhong e il sostegno finanziario da Wright State University.

Nota: Il protocollo descritto qui è stato progettato per lo screening di plasmidi libreria contenute in dieci piastre da 96 pozzetti ma può essere scalato verso l'alto o verso il basso di conseguenza. Il protocollo deve essere ripetuta per completare lo screening di tutta la libreria. Di solito, lo screening contro 10 piastre di geni libreria ogni volta che può essere gestito comodamente da 1 persona.
1. preparazione per la trasformazione del lievito di 96 pozzetti
Nota: Questo passaggio viene eseguito come in precedenza descritto7,10.
<ol><li>Aliquotare e 5 µ l (circa 50 – 100 ng) del plasmide del DNA da una libreria di plasmide disposti in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fondo tondo. Nota: Un esempio di una libreria di questo tipo sarebbe un lievito gene sovraespressione biblioteca10.</li>
	<li>Inoculare 150 mL di media del lievito peptone destrosio (YPD) in un pallone da 500 mL con una Colonia (2 – 3 mm di diametro) del ceppo di lievito aploidi W303α. Incubare per loro una notte a 30 ° C con agitazione (200 giri).</li>
	<li>La mattina seguente, misurare il OD600 della cultura durante la notte e diluire la coltura di lievito a OD600 = 0.1 a (fino a) 2 L di YPD. Incubare a 30 ° C con agitazione (200 giri) per ~ 5 h fino a quando raggiunge la cultura OD600 = 0,4 – 0,6.</li>
</ol>2. lievito trasformazione
<ol><li>Raccolta la cultura lievito di riempimento 8 bottiglie di centrifuga sterile da 250 mL e li centrifugazione a temperatura ambiente a 3.000 x g per 10 min. Pour il sovranatante senza interrompere il pellet. Nota: Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare il lievito con acqua distillata sterile H2O. Per questo, aggiungere 100 mL di sterile H2O per ogni bottiglia di centrifuga e vortexare per risospendere il pellet cellulare. Combinare le cellule lavate in 2 bottiglie e centrifuga li a 3.000 x g per 5 minuti versare il sovranatante.</li>
	<li>Lavare le cellule in ogni bottiglia in 100 mL di 0.1 M LiOAc/1XTE (100mm LiOAc; 10 mM Tris, pH 8.0; 1 mM EDTA) e li Centrifugare a 3.000 x g per 5 minuti versare il sovranatante.</li>
	<li>Durante la centrifugazione, bollire 5 mL di sperma di salmone DNA (10 mg/mL) a 100 ° C utilizzando un riscaldatore di blocco per 3 min e poi raffreddarlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 25 mL di 0.1 M LiOAc/1XTE in ogni bottiglia, combinare le celle sedimento e trasferirli in un matraccio da 150 mL. Aggiungere 5 mL di DNA dello sperma salmone pre-raffreddato e incubare a 30 ° C con agitazione (225 giri/min) per 30 min.</li>
	<li>Versare il composto di cellule in un serbatoio di reagente monouso sterile e, usando una pipetta multicanale, trasferire 35 µ l della miscela delle cellule in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti turno-inferiore contenente il DNA del plasmide di biblioteca. Piastre di vortice il 96 pozzetti utilizzando un Vortex piastra per 1 min a 1.000 giri/min. Incubare le piastre a 30 ° C per 30 minuti senza agitazione. Nota: Non mettere le piastre, quindi il calore può trasferire in modo più efficiente. Abbiamo trovato che nel Vortex le piastre da 96 pozzetti a 1.000 giri/min non causa liquido fuoriesca i pozzi, ma una velocità sicura vortice dovrebbe essere testata prima di eseguire il passaggio.</li>
	<li>In un pallone, preparare 200 mL di buffer di trasformazione contenente una concentrazione finale di 40% PEG3350, 10% DMSO e 0,1 M LiOAc. Preparare il tampone di trasformazione immediatamente prima dell'uso e mescolare agitando.</li>
	<li>Rimuovere 96 piatti dall'incubatrice 30 ° C e mescolare per 30 s a 1.000 giri/min utilizzando la piastra Vortex. Aggiungere 125 µ l di buffer di trasformazione in ciascun pozzetto e poi vortice le piastre per 1 min a 1.000 giri/min.</li>
	<li>Incubare le piastre a 30 ° C per 30 min e quindi il calore shock il lievito inserendo le piastre in un'incubatrice di 42 ° C per 15 min. Nota: Non mettere le piastre.</li>
	<li>Centrifugare le piastre per 5 min a 3.000 x g. Rimuovere il buffer di trasformazione dai pozzetti invertendo le piastre sopra un bidone dei rifiuti e con forza il buffer dalle piastre di dumping. Asciugare rapidamente le piastre invertite su un tovagliolo di carta pulito per rimuovere qualsiasi liquido sulla parte superiore delle piastre.</li>
	<li>Sciacquare le cellule aggiungendo le piastre 200 µ l di dropout minimo medio corrispondente al marcatore selezionabile sul plasmide di biblioteca. Nota: Abbiamo usato un Ura-mezzo sintetico.</li>
	<li>Centrifugare le piastre per 5 min a 3.000 x g e rimuovere il surnatante sopra un bidone dei rifiuti come descritto al punto 2.10.</li>
	<li>Aggiungere 160 µ l di minimo medio-Ura contenente 2% di glucosio. Vortice le piastre per 1 min a 1.000 giri/min e li Incubare a 30 ° C per 48 h senza agitazione. Dopo 48 h, notare che un pellet di lievito trasformato è visibile nella parte inferiore di ciascun pozzetto.</li>
	<li>Usando un erogatore liquido, aggiungere 100 µ l di glucosio contenente Ura-media in tutti i pozzetti di un nuovo set di piastre da 96 pozzetti.</li>
	<li>Vortice le piastre contenenti il lievito trasformato (dal punto 2.13) a 1.000 giri/min per 30 s. utilizzando un replicatore di 96-pin plastica sterile, inserire i perni nei pozzetti contenenti il lievito trasformato e quindi li inoculare nei rispettivi pozzetti delle piastre nuove riempiti di media. Incubare le piastre nuove a 30 ° C per 24 h. Nota: Se lavora con 10 tavole, il mezzo può anche essere distribuito manualmente utilizzando pipette multicanale.</li>
	<li>Dopo 24 h, un pellet di lievito dovrebbe essere visibile nella parte inferiore di ciascun pozzetto contenente lievito trasformato con successo. Per salvare questi ceppi di lievito come scorte di glicerolo, aggiungere 50 µ l di glicerolo al 50% ad ogni pozzetto, vortice le piastre per 30 s a 1.000 giri/min, sigillare le piastre con nastro di sigillamento e congelarli a-80 ° C. Nota: La procedura descritta in precedenza solo bisogno di essere eseguito una volta. Future proiezioni dei modelli differenti di lievito contro lo stessa libreria USA e getta il serbatoio del reagente possono iniziare dalle scorte di glicerolo e procedere immediatamente dalla procedura riportata di seguito.</li>
</ol>3. accoppiamento tra celle contenenti geni biblioteca e Query lievito
<ol><li>Per rivivere i ceppi Biblioteca dello stock di glicerolo, prendere le piastre da 96 pozzetti fuori dal congelatore-80 ° C, togliere il nastro di tenuta e lasciare che il lievito scongelare a temperatura ambiente per circa 30 min.</li>
	<li>Una volta che il lievito si è sciolto, utilizzare un replicatore di 96-pin plastica sterile per inoculare le scorte di glicerolo a 160 µ l di fresco Ura-media contenente 2% di glucosio in piastre da 96 pozzetti e li Incubare a 30 ° C per 24 h. immediatamente dopo gli sforzi di libreria sono utilizzati , sigillare le piastre con nastro di tenuta e restituirli al congelatore-80 ° C.</li>
	<li>Lo stesso giorno i ceppi di biblioteca (W303α) vengono scongelati, inoculare il ceppo di lievito query (qui, FUS in W303a) a 50 mL di YPD e crescere in una notte a 30 ° C con agitazione a 250 giri/min.</li>
	<li>La mattina dopo, versare il ceppo di lievito di query per un serbatoio di reagente monouso sterile e aliquota 160 µ l del ceppo query in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti usando una pipetta multicanale.</li>
	<li>Utilizzando il liquido dispenser, erogare 160 µ l di media YPD in ciascun pozzetto di dieci piastre da 96 pozzetti. Utilizzare queste tavole più tardi per l'accoppiamento del ceppo di lievito di query con il lievito di biblioteca.</li>
	<li>Brevemente vortice la piastra a 96 pozzetti contenenti il ceppo di query e quindi utilizzare un replicatore 96-pin sterile per trasferire la query ceppo alle piastre YPD.</li>
	<li>Brevemente vortice la libreria colare piastre e, per ogni piatto di ceppo di libreria, utilizzare un nuovo replicatore 96-pin sterile per trasferire i ceppi di biblioteca per i piatti YPD che sono stati inoculati con il ceppo di query. Nota: Cellule in glicerolo perdono la loro vitalità dopo diversi cicli di gelo-disgelo. Restituendo i ceppi di libreria per l'archiviazione a lungo termine (congelatore a-80 ° C) più presto manterrà la libreria in buona qualità e pronto per un utilizzo futuro. Adeguatamente mantenuto, lo stock di glicerolo può essere congelato e scongelato almeno 10 volte. Inoltre è consigliabile mantenere una copia di lavoro e copie di backup dello stock di glicerolo. Quando lo stock di lavoro non funziona, immediatamente fare una nuova copia dalla copia di backup di lavoro.</li>
	<li>Incubare le piastre YPD a 30 ° C per 24 h. nota che un pellet di lievito sarà visibile nella parte inferiore di ciascun pozzetto dopo 24 h.</li>
	<li>Riempimento a 96 pozzetti con un mezzo di filtraggio minimo contenente 2% raffinosio, corrispondente ai marcatori selezionabili sul plasmide nel ceppo di query e il plasmide di libreria (ad es., qui Ura - suo-).</li>
	<li>Utilizzare un replicatore 96-pin sterile per trasferire il lievito da YPD accoppiamento culture per i terreni selettivi. Incubare le piastre a 96 pozzetti a 30 ° C per 48 h; solo cellule che accoppiato di lievito e diploide formato celle e, pertanto, contengono entrambi il plasmide di query e il plasmide biblioteca sarà in grado di crescere in questa media. Dopo 2 giorni, osservare che una pallina è visibile sul fondo dei pozzetti.</li>
</ol>4. analisi di spotting
<ol><li>
Dopo 48 h di crescita nei mezzi selettivi contenenti raffinosio, spot il lievito su piastre di agar.
	<ol>
<li>Preparare 2 set di piastre di Ura-His-dropout contenenti 2% agar utilizzando lastre di polistirene chiaro, uno contenente 2% galattosio e altri contenenti glucosio 2%.</li>
		<li>Piastre di vortice il 96 pozzetti per 1 minuto a 1.000 giri/min, quindi individuare il lievito per le piastre di Ura-His-dropout contenenti galattosio 2% e 2% agar (FUS e Biblioteca geni sono indotti) e le piastre di Ura-His-dropout contenente glucosio 2% e 2% agar (geni FUS e biblioteca represso) utilizzando una macchina robotica spotting, mediante il quale la cultura in ogni bene è macchiata sulle piastre di agar in quadruplice copia (vale a dire, la cultura in 1 bene è notata a 4 punti sulla piastra di agar).</li>
		<li>Dopo spotting, lasciate le piastre di agar asciugare e poi posizionarli capovolti in un'incubatrice di 30 ° C. Fotografare le piastre di agar ogni 24 h per registrare una crescita più veloce/più lievito in cui è salvata la tossicità per il ceppo di query o per registrare una crescita più lenta e meno in cui la tossicità per il ceppo di query è esacerbata. Incubare le piastre per 4 giorni. Nota: La cultura in ogni bene può essere individuata su piastre di agar 1-a-1, come mostrato in un metodo basato sulla trasformazione precedente10. Tuttavia, la 1-a-4 spotting qui (che può comodamente essere impostato utilizzando la macchina robotica spotting) aumentando la robustezza del test riducendo il numero di falsi positivi. Risultati positivi vengono considerate solo quando tutte le 4 colonie dallo stesso ben mostrano un fenotipo simile.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+(Saccharomycotina).">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li><li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, descriviamo un protocollo per eseguire una schermata di sovraespressione di plasmide in lievito mediante accoppiamento per introdurre la libreria di plasmide nel modello del lievito. Utilizzando questo approccio, più modelli di lievito della tossicità delle proteine malattia neurodegenerative possono essere selezionate utilizzando la stessa raccolta di lievito trasformata con una libreria di plasmide. Solo il laborioso processo di trasformazione deve essere eseguita una volta, dopo quale lievito altamente efficien...

Il lievito Saccharomyces cerevisiae è stato ampiamente usato nella ricerca scientifica di base1 di comprendere processi cellulari direttamente correlati alle malattie umane. Inoltre, è stato utilizzato come organismo modello per lo studio di proteine umane di malattia-collegati, come quelli legati a malattie neurodegenerative più comuni, tra cui il morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, malattia di Huntington e amiotrofica Sclerosi laterale (ALS)2. Un vantaggio del modello del lievito è la facilità con cui può essere eseguita una schermata di genoma per identificare vie cellulari correlate alla tossicità delle proteine correlate a malattia, dando così la comprensione nel meccanismo della loro tossicità. Una tale schermata viene chiamata uno schermo di sovraespressione biblioteca, in cui ciascuno dei 5.500 geni lievito in una libreria di serie si trasforma in un modello di lievito per identificare quali geni possono modificare tossicità quando sovraespresso. Questo metodo di screening è stato applicato con successo nei modelli lievito di più proteine associate a malattia di neurodegenerative, tra cui huntingtina per la malattia di Huntington3, α-synuclein per la malattia del Parkinson4,5 , Aβ per morbo di Alzheimer6e FUS e TDP-43 per ALS7,8,9. Mentre di solito è fatto in un modo ad alta velocità10, il passo più laborioso dello schermo sta trasformando individualmente 5.500 geni di lievito da una libreria disposte. Questo passaggio deve essere eseguita ogni volta che lo screening viene ripetuto, e ogni volta che un modello di nuova costituzione lievito deve essere studiato. È importante trovare un modo più efficiente per eseguire questa operazione.
Cellule di lievito stabile possono esistere in forme sia aploide e diploide. Ci sono due opposti tipi di cellule aploidi, accoppiamento tipo di accoppiamento un e α. cellule aploidi di ogni accoppiamento tipo producono e secernono il proprio specifico feromone accoppiamento, a cui rispondono solo le celle di tipo accoppiamento opposto. Questo consente di accoppiamento tra un e α cellule per produrre cellule diploidi stabile, a/α. Questo processo è spontaneo e altamente efficiente11. Possiamo prendere vantaggio di questo unico ciclo di vita di S. cerevisiae per introdurre la libreria di plasmide. Più in particolare, ogni gene nella libreria allinearono plasmide si trasformerà in cellule aploidi di un tipo di accoppiamento, cioè, delle cellule α. Queste cellule contenenti i geni di libreria quindi saranno conservate in magazzino di glicerolo in un formato di 96 pozzetti disposte. Per ogni modello di lievito che deve essere proiettato, cellule di lievito contenente i geni di libreria possono essere scongelate dallo stock glicerolo, e lo screening può essere fatto attraverso l'accoppiamento con il modello di lievito di interesse per il tipo accoppiamento opposto, vale a dire, tipo accoppiamento un. Questa idea dell'utilizzo di accoppiamento per riunire due geni in lievito non è nuova. È stato applicato con successo nel lievito high throughput screening due-ibrido, in cui un esca costruiscono (cioè, fusioni di dominio Gal4-DNA-binding) in un tipo di accoppiamento è riuniti attraverso l'accoppiamento con un costrutto di preda da una libreria disposte 12. Tuttavia, questa strategia non è stato mai applicata in proiezioni biblioteca sovraespressione, che hanno sempre usato metodi di trasformazione tradizionali.
Il nostro laboratorio precedentemente stabilito un modello di lievito del ALS-collegato della proteina FUS7. Attraverso lo screening di biblioteca di sovraespressione utilizzando il metodo di trasformazione abbiamo scoperto cinque geni di lievito (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1e VHR1) che tossicità di FUS quando sovraespresso di soccorso. Questi risultati sono stati confermati in modo indipendente con uno studio simile di un altro gruppo8. hUPF1, un omologo umano di ECM32, più successivamente è stato indicato per sopprimere tossicità in cellule neuronali primarie13 e in un modello animale di ALS14 pure. Utilizzando questi cinque geni come prova di principio, dimostriamo che tutti e cinque i geni salvare tossicità FUS allo stesso modo quando vengono introdotte nel modello del lievito FUS di accoppiamento. Poiché le cellule di lievito contenente i geni di libreria possono essere memorizzate permanentemente in Stock in glicerolo e rivivere ogni volta che necessario, questo metodo basato sull'accoppiamento rimuoverà il passo che richiede tempo di trasformazione ogni volta che la libreria deve essere schermato contro. Dato che l'accoppiamento è altamente efficiente, con nessuna trasformazione di plasmide coinvolta, questa strategia diminuisce anche significativamente il costo associato di purificazione e trasformazione di una libreria di grande plasmide. Si applicherà con successo questo metodo in una libreria di screening contro il modello di lievito di FUS.
La procedura per lo screening basato sull'accoppiamento è brevemente descritta nella Figura 1. Inizialmente, la biblioteca di plasmide allinearono si trasforma in un ceppo di lievito aploidi di accoppiamento tipo α utilizza un protocollo di trasformazione del lievito di alto-rendimento in cui ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contiene lievito trasformato con un plasmide di libreria specifica. Questa raccolta di lievito trasformato viene salvata come uno stock di glicerolo che può essere scongelato e fatto rivivere per uso più tardi. Il modello di lievito di interesse, in questa cassa tossicità FUS, deve essere generato in un ceppo di lievito aploidi con il tipo di accoppiamento opposto (accoppiamento tipo un). In un modo ad alta velocità utilizzando sterile 96-pin replicatori, il ceppo FUS e ceppi di lievito che contiene la libreria di plasmide sono trasferiti per piastre da 96 pozzetti contenenti contenuti multimediali e permesso di mate. Dopo l'accoppiamento, un piccolo volume da ogni bene della cultura accoppiamento viene trasferito per piastre da 96 pozzetti contenenti media sintetico abbandono nel quale lievito solo diploide contenente entrambe le unità follicolari e geni di libreria possono crescere. Una macchina robotica spotting viene quindi utilizzata per trasferire cultura lievito da ciascun pozzetto su piastre di agar dove viene indotta l'espressione del FUS e i geni di biblioteca.  Inoltre, la coltura di lievito è macchiato per controllare le piastre di agar dove FUS e i geni della biblioteca non sono espressi. A seguito di crescita su piastre di agar, saranno identificati geni che salvare o aggravano la tossicità FUS.

<table><tbody><tr><td>salmon Sperm DNA (SS-DNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD broth</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Granulated Agar</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Ura- drop out medium</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Lithium acetate, anhydrous</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350)</td><td>Spectrum Chemical&amp;nbsp;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96 Pin Replicator&amp;nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>non-treated, sterile</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research plus Multichannel Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>30-300ul volume</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R Centrifuge</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mating-based overexpression library screening in yeast

Lievito è stato ampiamente utilizzato come modello nello studio di proteine associate a malattie umane. Lo screening genetico del genoma è un potente strumento comunemente utilizzato negli studi di lievito. L'espressione di un numero di proteine associate malattia di neurodegenerative in lievito causa citotossicità e formazione aggregata, ricapitolare i risultati osservati in pazienti con questi disturbi. Qui, descriviamo un metodo per lo screening di un modello di lievito della sclerosi laterale amiotrofica-associati proteina FUS per i modificatori della sua tossicità. Invece di utilizzare la trasformazione, questa nuova piattaforma di screening si basa sull'accoppiamento di lievito per introdurre una libreria disposte dei plasmidi nel modello del lievito. Il metodo di accoppiamento ha due vantaggi: in primo luogo, è altamente efficiente; in secondo luogo, la libreria allinearono pre-trasformata dei plasmidi possa essere memorizzata per a lungo termine come uno stock di glicerolo e rapidamente applicata agli altri schermi senza il passaggio di alta intensità di lavoro di trasformazione nel modello del lievito ogni volta. Dimostriamo come questo metodo può essere utilizzato con successo per geni che modificano la tossicità del FUS.

L'ALS-collegato della proteina FUS, una proteina legante RNA/DNA, precedentemente è stata studiata in lievito aploidi7,8. Utilizzando la selezione genetica del metodo basato sulla trasformazione scoperto parecchi geni di lievito che sopprimono la tossicità FUS. L'omologo umano di uno dei geni di lievito più successivamente è stato dimostrato per essere efficace a sopprimere la tossicità in una primaria delle cellule di un neu...

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Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Questo articolo presenta un metodo basato sull'accoppiamento per facilitare la proiezione di sovraespressione nel lievito gemmante utilizzando una libreria di plasmide disposti.

Sovraespressione di accoppiamento-based Library Screening in lievito

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

7.6K Views.  Wright State University. Questo articolo presenta un metodo basato sull'accoppiamento per facilitare la proiezione di sovraespressione nel lievito gemmante utilizzando una libreria di plasmide disposti.

Video: Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Ricerca

Biochimica

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetica

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Immunologia e infezioni

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Biologia

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>Ottimizzazione delle funzioni proteiche attraverso tecniche di visualizzazione della superficie del lievito

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

Ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

Bioingegneria

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Diretto Evolution Metodo<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creazione e screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Sovraespressione di accoppiamento-based Library Screening in lievito

Riepilogo

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Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano

Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

High-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

Ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito

Ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito

Ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito

Diretto Evolution Metodo