우리는 주 실험실 및 종 실험실, 라이트 주립 대학에서 재정 지원의 구성원과 사려깊은 토론에 대 한 감사.

참고: 여기에 설명 된 프로토콜 10 96 잘 접시에 포함 된 라이브러리 플라스 미드를 상영을 위해 설계 되었습니다 하지만 확장 될 수 있습니다 또는 그에 따라 아래로. 프로토콜은 라이브러리 전체 심사를 완료 하는 데 반복 될 필요가 있다. 일반적으로, 라이브러리 유전자의 10 판에 대 한 심사 때마다 1 사람이 편안 하 게 처리할 수 있습니다.
1. 96 잘 누 룩 변환에 대 한 준비
참고:이 단계는 수행 이전 설명된7,10.
<ol><li>Aliquot 5 µ L (약 50-100 ng)의 플라스 미드 DNA 라운드 아래 96 잘 접시의 각 음에 기준점과 플라스 미드 도서관에서. 참고: 이러한 라이브러리의 예로 효 모 유전자 overexpression 라이브러리10것입니다.</li>
	<li>단일 효 모 스트레인 W303α의 식민지 (2-3 m m 직경)와 500 mL 플라스 크에 효 모 펩 포도 당 (YPD) 미디어의 150 mL 접종 떨고 (200 rpm)와 30 ° C에서 그들을 밤새 품 어.</li>
	<li>다음 아침, 하룻밤 문화의 OD600 을 측정 하 고 OD600 효 모 문화를 희석 = 0.1 YPD 2 L (을)에서. 품 어 그것 동요 (200 rpm)와 30 ° c ~ 5 h에 대 한 문화 OD600 에 도달할 때까지 = 0.4-0.6.</li>
</ol>2. 누 룩 변환
<ol><li>8 살 균 250 mL 원심 병 작성 및 10 분에 대 한 3000 x g 에서 실내 온도에 그들을 centrifuging 효 모 문화는 펠 렛을 방해 하지 않고 부는 상쾌한 어 추수. 참고: 상 온에서 원심 분리 단계를 모두 수행 합니다.</li>
	<li>워시 살 균 증류수 H2o.와 누 룩 이 위해 살 균 H2O의 100 mL에 추가 각 원심 병 및 소용돌이 그것 셀 펠 릿 resuspend. 2 병 및 원심 분리기 3000 x g 5 분에서 부는 상쾌한 어로 씻어 세포를 결합 합니다.</li>
	<li>각 병 100 mL에 0.1 M LiOAc/1XTE (100mm LiOAc; 10 mM Tris, pH 8.0; 1 mM EDTA)의 세포를 세척 하 고 5 분 부는 상쾌한 오프에 대 한 3000 x g 에서 원심.</li>
	<li>Centrifuging, 하는 동안 3 분에 대 한 블록 히터를 사용 하 여 100 ° C에서 연어 정자 DNA (10mg/mL)의 5 mL을 삶아 고 얼음에 그것을 냉각.</li>
	<li>각 병에 0.1 M LiOAc/1XTE의 25 mL에 셀 펠 릿을 resuspend, resuspended 셀을 결합 하 고 150 mL 플라스 크에 그들을 전송. 사전 냉각된 연어 정자 DNA의 5 mL을 추가 하 고 30 분 (225 rpm)을 떨고와 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>멸 균 일회용 시 저수지로 셀 혼합물을 부 어 하 고, 세포 혼합물의 35 µ L을 라운드-96-잘 바닥판 포함 하는 라이브러리 플라스 미드 DNA의 각 영역 전송 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여. 소용돌이 96 잘 접시 1000 rpm에서 1 분 동안 접시 vortexer를 사용 하 여. 동요 하지 않고 30 ° C에서 30 분 동안 접시를 품 어. 참고: 열 보다 효율적으로 전송할 수 있도록, 접시를 스택을 하지 않습니다. 우리는 vortexing 1000 rpm에서 96 잘 접시는 우물 밖으로 유출에 액체를 발생 하지 않습니다 하지만 안전 소용돌이 속도 단계를 수행 하기 전에 테스트 해야 합니다 발견.</li>
	<li>플라스 크에 40 %PEG3350 마지막 농도, 10 %DMSO, 그리고 0.1 M LiOAc 변환 버퍼의 200ml를 준비 합니다. 즉시 사용 하기 전에 변환 버퍼를 준비 하 고 떨고에 의해 철저 하 게 혼합.</li>
	<li>30 ° C 배양 기에서 제거 96 잘 접시와 30에 대 한 그들을 섞어 접시 vortexer를 사용 하 여 1000 rpm에서 s. 추가 변환 버퍼의 125 µ L 각 잘 그리고 소용돌이를 1 분 동안 접시 1000 rpm.</li>
	<li>30 분 동안 30 ° C에서 번호판을 품 어 그리고 15 분 동안 42 ° C 인큐베이터에 접시를 배치 하 여 충격 누 룩을 열. 참고: 판 스택을 하지 않습니다.</li>
	<li>3000 x g에 5 분 동안 격판덮개 원심 폐기물 빈 위에 접시를 반전 하 고 강제로 격판덮개에서 버퍼를 덤핑 하 여 우물에서 변환 버퍼를 제거 합니다. 신속 하 게 거꾸로 번호판 번호판 위에 어떤 액체를 제거 하는 깨끗 한 종이 타월에 오 점.</li>
	<li>최소한의 강하 중간에 해당 하는 라이브러리 플라스 미드에 선택 가능한 마커의 접시 200 µ L을 추가 하 여 셀을 씻어. 참고: 우리는 합성 우 라-매체를 사용합니다.</li>
	<li>3000 x g 에 5 분 동안 접시를 원심 고 단계 2.10에서 폐기물 bin에는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>최소한의 우 라-매체 포함 2% 포도의 160 µ L를 추가 합니다. 와 동 1000 rpm에서 1 분 동안 접시 및 48 h 30 ° C에서 흔들어 없이 그들을 품 어. 48 h 후 note 변형된 효 모의 공 각의 맨 아래에 표시 됩니다.</li>
	<li>액체 디스펜서를 사용 하 여, 96 잘 접시의 새로운 세트의 각 음에 우 라-미디어 포함 포도 당 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>와 동 30 1000 rpm (단계 2.13)에서 변형 된 효 모에 포함 된 접시 살 균 플라스틱 96 핀 복제기를 사용 하 여 s., 핀 변환 된 효 모에 포함 된 우물에 놓고 새로운 접시의 해당 우물에 그들을 예방합니다 미디어를 가득합니다. 24 h 30 ° C에서 새로운 번호판을 품 어. 참고: 10 접시를 사용 하는 경우 매체 수 또한 될 적절 멀티 채널 펫을 사용 하 여 수동으로.</li>
	<li>24 h 후 효 모의 펠 릿은 성공적으로 변환 된 효 모에 포함 된 각의 맨 아래에 표시 되어야 합니다. 글리세롤 주식으로 이러한 효 모 종자 저장, 각 음에 50% 글리세롤의 50 µ L을 추가 소용돌이 30 접시 1000 rpm에서 s 바다 표범 어업 테이프와 플레이트를 밀봉 하 고-80 ° c.에서 그들을 멈추게 참고: 위의 단계를 한 번 수행 해야 합니다. 동일한 라이브러리 일회용 시 저수지에 대해 다른 효 모 모델의 미래 상영 글리세롤 주식에서 시작 하 고 단계에서 즉시 진행 수 있습니다.</li>
</ol>3. 쿼리 효 모 라이브러리 유전자를 포함 하는 셀 간의 짝짓기
<ol><li>글리세롤 주식에서 라이브러리 긴장을 회복, 96 잘 접시-80 ° C 냉동 고, 제거는 씰링 테이프, 고 누 룩 약 30 분 동안 실 온에서 녹여 밖으로 걸릴.</li>
	<li>효 모는 해 동 되 면 살 균 플라스틱 96 핀 복제기를 사용 하 여 글리세롤 주식 96 잘 접시에 신선한 우 라-미디어 포함 2% 포도의 160 µ L 접종을 라이브러리 긴장 사용 후에 즉시 24 h. 30 ° C에서 그들을 품 어 바다 표범 어업 테이프와 번호판을 봉인 하 고-80 ° C 냉장고에 반환.</li>
	<li>라이브러리 긴장 (W303α)는 해 동 하는 같은 날에 접종 쿼리 효 모 스트레인 (여기, W303a에는 FUS) YPD 50 mL를 하룻밤 250 rpm에서 떨고와 30 ° C에서 그것을 성장 하 고.</li>
	<li>다음날 아침, 멸 균 일회용 시 저수지, 그리고 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시의 각 음에 쿼리 스트레인의 aliquot 160 µ L를 쿼리 효 모 스트레인을 붓는 다.</li>
	<li>액체 디스펜서를 사용 하 여 10 96 잘 접시의 각 음에 160 µ L YPD 미디어의 분배. 라이브러리 효 모와 쿼리 효 모 스트레인 짝짓기 나중이 접시를 사용 합니다.</li>
	<li>짧게 소용돌이 96 잘 접시 쿼리 긴장과 다음 사용 하 여 쿼리를 전송 하는 살 균 96 핀 복제기를 포함 하는 YPD 번호판 스트레인.</li>
	<li>짧게 소용돌이 라이브러리 변형 판 및, 각 라이브러리 스트레인 플레이트를 사용 하 여 새로운 살 균 96 핀 복제기 쿼리 긴장으로 주사 하는 YPD 번호판 라이브러리 긴장을 전송. 참고: 셀 글리세롤에 여러 동결 눈 녹은 물 주기 후 그들의 생존 능력을 잃게됩니다. 돌아가서 라이브러리 긴장 장기 보관 (-80 ° C 냉동 고) 가능 한 한 빨리 좋은 품질, 라이브러리를 유지 하 고 나중을 위해 준비 됩니다. 제대로 유지, 글리세롤 재고 냉동 고 10 시간 이상 해 동. 우리는 또한 강력 하 게 작업 복사본 및 글리세롤의 백업 복사본을 유지 것이 좋습니다. 작업 사진, 작동 하지 않을 때 즉시 새로운 확인 작업 복사본 백업 복사본에서.</li>
	<li>YPD 접시 24 h. 참고는 효의 펠 릿 표시 됩니다 각 우물의 바닥에서 24 시간 후에 30 ° c를 품 어.</li>
	<li>2% 유, 해당 하는 라이브러리 (예를 들어, 여기 우 라-그의-)를 플라스 미드에 뿐만 아니라 쿼리 스트레인에 플라스 미드에 선택 가능한 마커를 포함 하는 최소의 강하 매체와 채우기 96 잘 접시.</li>
	<li>살 균 96 핀 복제기를 사용 하 여 선택적 미디어 문화를 짝짓기 하는 YPD에서 누 룩을 전송. 48 h; 30 ° C에서 96 잘 접시를 품 어 만 성관계를 셀을 효 모와 형성 2 중 세포, 따라서 두 쿼리 플라스 미드를 포함 고 라이브러리 플라스 미드가이 미디어에서 성장할 수 있을 것입니다. 2 일 후 관찰 펠 릿 우물의 하단에 표시 됩니다.</li>
</ol>4. 분석 결과 보 이나
<ol><li>
유에 포함 된 선택적 미디어에 성장의 48 h 후 한 천 배지에서 효 자리.
	<ol>
<li>2 %agar 분명 폴리스 티 렌 플레이트, 1 개 포함 2% 갈 락 토스와 다른 포함 2% 포도 당을 사용 하 여 포함 된 우 라 그의 강하 격판덮개의 2 세트를 준비 합니다.</li>
		<li>1000 rpm에서 1 분 동안 소용돌이 96 잘 접시 다음 누 룩 2% 갈 락 토스와 2 %agar (FUS 및 라이브러리 유전자 유도 된다)를 포함 하는 우 라 그의 강하 번호판과 포도 당 2%와 2 %agar (FUS 및 라이브러리 유전자를 포함 하는 우 라 그의 강하 번호판 자리 억압)는 각 문화 잘 발견 quadruplicate에 한 천 배지 위에 로봇 탐지 기계를 사용 하 여 (즉, 1에서 문화 잘 발견 한 접시에 4 반점에).</li>
		<li>구경, 후 한 천 배지, 건조 하 고 다음 거꾸로 30 ° C 배양 기에서 그들을 배치 하자. 쿼리 스트레인에 독성 구조는 더 빨리/더 효 모 성장 기록 또는 기록 쿼리 스트레인에 독성 악화 됩니다 느린/덜 성장 한 천 배지 모든 24 h에 사진. 4 일에 대 한 번호판을 품 어. 참고: 각 문화 잘 발견하실 수 있습니다 한 천 배지 1-1에 이전 변환 기반 방법10에서 같이. 그러나, 1-에-4 여기 안보 (로봇 탐지 기계를 사용 하 여 편리 하 게 설정할 수 있습니다)이 크게 잘못 된 반응의 수를 줄여 분석 결과의 견고성을 증가. 긍정적인 안타 때 동일한에서 모든 4 식민지 잘 유사한 표현 형을 표시만 여겨진다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

여기, 우리는 짝짓기 사용 하 여 효 모 모델에 플라스 미드 도서관을 소개 하는 효 모에 플라스 미드 overexpression 화면 수행 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 신경 퇴행 성 질병 단백질 독성의 여러 효 모 모델 수 상영 플라스 미드 도서관으로 변형 하는 효 모의 동일한 컬렉션을 사용 하 여. 변화의 힘 드는 과정만는 고효율 효 모 후 쿼리 스트레인에 플라스 미드 도서관을 소개 ?...

싹 트는 효 모 Saccharomyces cerevisiae 널리 사용 되었습니다 기본 과학 연구1 에 직접 인간의 질병에 관련 된 세포 프로세스를 이해 하. 또한, 그것은 사용 되는 모델 생물으로 가장 흔한 신경 퇴행 성 질환, 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 헌팅턴 병, 그리고 루를 포함 하 여에 연결 등 인간의 질병 관련 단백질, 공부에 대 한 옆 경화 증 (ALS)2. 효 모 모델의 장점은는 게놈 넓은 스크린 따라서 그들의 독성의 메커니즘에 대 한 통찰력을 주는 질병 관련 단백질의 독성에 관련 된 세포 경로 식별 하기 위해 수행할 수 있는 용이성입니다. 이러한 한 화면은 기준점과 라이브러리에 5500 효 모 유전자 각각의 어떤 유전자 독성 overexpressed 때 수정할 수 있습니다 식별 하는 효 모 모델로 변환 됩니다 overexpression 라이브러리 화면을 이라고 합니다. 이 검사 방법은 여러 신경 퇴행 성 질환 관련 단백질의 Huntington의 질병3, 파 킨 슨 병4,5 α-synuclein huntingtin 포함 효 모 모델에 성공적으로 적용 된 , 알 츠 하이 머 병6, FUS 및 TDP-43 ALS7,,89Aβ. 일반적으로는 높은 처리량 방법10에서 이루어집니다, 하는 동안 화면의 가장 노동 집약적인 단계는 개별적으로 기준점과 라이브러리에서 5500 효 모 유전자 변형 시키는. 심사, 반복 때마다가이 단계를 수행 해야 합니다 그리고 때마다 새로 설립된 된 효 모 모델 공부 될 필요가 있다. 그것은이 작업을 수행 하는 더 효율적인 방법을 찾을 수 해야 합니다.
효 모 세포는 단일과 2 중 형태로 안정적으로 존재할 수 있습니다. 두 유형의 단일 셀, 짝짓기 형식 짝짓기 반대는 각 짝짓기의 α. 단일 셀 생산을 입력 하 고 짝짓기 형식 셀 반대만 응답 하는 그들의 자신의 특정 짝짓기 페로몬을 분 비 하는 고. 이로써 간의 짝짓기는 생산 안정 된 2 중 세포, / α α 세포. 이 과정은 자발적이 고 매우 효율적인11. 우리 플라스 미드 도서관 소개 S. cerevisiae 의이 독특한 라이프 사이클의 활용할 수 있습니다. 좀 더 구체적으로, 기준점과 플라스 미드 도서관에서 각 유전자 한 짝짓기 종류, 즉, α 셀의 단일 세포로 변형 됩니다. 라이브러리 유전자를 포함 하는 이러한 셀 다음 글리세롤 주식 기준점과 96 잘 형식에서에 저장 됩니다. 상영 하는 각 효 모 모델, 라이브러리 유전자를 포함 하는 효 모 세포 글리세롤 주식에서 재개 수 있습니다 되 고 반대 짝짓기 종류, 즉, 짝짓기 종류의 효 모 모델 짝짓기를 통해 심사를 할 수 있는 한. 효 모에 두 개의 유전자를 함께가지고 짝짓기를 사용의이 아이디어를 새로운 되지 않습니다. 2 하이브리드 심사, 있는 미끼 생성 한 짝짓기 형식에 (즉, Gal4 DNA 바인딩 도메인 융해) 소집 짝짓기 기준점과 라이브러리에서 먹이 구조를 통해 높은 처리량 효 모에 성공적으로 적용 된 그러나 12.,이 전략 적 overexpression 라이브러리 검 진, 항상 전통적인 변환 방법 사용에 적용 되었습니다.
우리의 실험실 이전 ALS 관련 단백질 FUS7의 효 모 모델을 설립. 변환 메서드를 사용 하 여 overexpression 라이브러리 심사를 통해 우리 FUS overexpressed 때의 독성을 구출 하는 5 개의 효 모 유전자를 (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, 및 VHR1)을 발견 했다. 이들이 발견 했다 독립적으로 확인 하지 비슷한 연구와 다른 그룹8. hUPF1, ECM32의 인간 상 동 기관 나중 기본 신경 세포13 와 ALS14 도의 동물 모델에서 독성을 억제 하기 위해 표시 했다. 이 5 개의 유전자를 사용 하 여 원리의 증거로, 그들은 짝짓기에 의해 FUS 효 모 모델에 소개 될 때 모든 5 개의 유전자 마찬가지로 FUS 독성을 구조 설명 합니다. 라이브러리 유전자를 포함 하는 효 모 세포 글리세롤 주식에 영구적으로 저장 하 고 필요할 때마다 부활 수 있습니다, 이후이 짝짓기 기반 메서드 변환 라이브러리에 대 한 검사를 해야 할 때마다 시간이 많이 걸리는 단계를 제거 합니다. 짝짓기 하는 것이 없는 플라스 변환 관련 고효율 이후이 전략 또한 크게 정화 및 큰 플라스 미드 도서관의 변화와 관련 된 비용을 줄입니다. 우리 도서관 FUS의 효 모 모델에 대 한 심사를 성공적으로이 메서드를 적용 됩니다.
짝짓기 기반 검사 절차 그림 1에 간략하게 설명 되어 있습니다. 처음, 기준점과 플라스 미드 도서관 종류 α 96 잘 접시의 각 잘 포함 효 모 특정 라이브러리 플라스 미드로 변형 되어 있는 높은 처리량 효 모 전이 프로토콜을 사용 하 여 짝짓기의 단일 효 모 긴장으로 변화 됩니다. 이 컬렉션 변환 효 해 동 하 고 나중에 사용 하기 위해 부활 수 있는 글리세롤 주식으로 저장 됩니다. 이 경우 FUS 독성에 관심사의 효 모 모델 반대 짝짓기 형식과 단일 효 모 스트레인에 생성 해야 합니다 (유형 짝짓기는). 살 균 96 핀 복제기를 사용 하 여 높은 처리량으로, FUS 긴장과 플라스 미드 도서관을 포함 하는 효 모 종자는 96 잘 접시 포함 된 리치 미디어를 전송 하며 수 친구. 짝짓기, 각 작은 볼륨 다음 짝짓기 문화의 잘 96 잘 접시 합성 강하 미디어 모두 FUS를 포함 하는 2 중 효 모에 포함 된 전송 및 라이브러리 유전자 성장할 수 있다. 로봇 탐지 기계는 FUS 및 라이브러리 유전자의 표정을 유도 된 한 천 배지 위에 각 우물에서 효 모 문화를 전송에 사용 됩니다.  또한, 효 모 문화는 어디 FUS 및 라이브러리 유전자 표현 되지 않는다 하는 한 천 배지를 제어 하 발견 됩니다. 한 천 배지에서 성장, 다음 구조 또는 악화 FUS 독성 유전자 식별 합니다.

<table><tbody><tr><td>salmon Sperm DNA (SS-DNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD broth</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Granulated Agar</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Ura- drop out medium</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Lithium acetate, anhydrous</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350)</td><td>Spectrum Chemical&amp;nbsp;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96 Pin Replicator&amp;nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>non-treated, sterile</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research plus Multichannel Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>30-300ul volume</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R Centrifuge</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mating-based overexpression library screening in yeast

싹 트는 효 모 단백질 인간의 질병와 관련 된 공부에 모델로 널리 사용 되었습니다. 게놈 전체 유전자 검사는 일반적으로 효 모 연구에 사용 되는 강력한 도구입니다. 다양 한 효 모에 신경 퇴행 성 질환 관련 단백질의 식이 세포 독성 및 집계 형성, 업과 연구 결과 이러한 장애를 가진 환자에서 발생 합니다. 여기, 그 독성의 한정자 루 경화 증 관련 단백질 FUS의 효 모 모델을 검사 하는 방법을 설명 합니다. 변환을 사용 하 여, 대신이 새로운 심사 플랫폼 효 모 모델에 플라스 미드의 기준점과 라이브러리를 소개 하는 효의 짝짓기에 의존 합니다. 짝짓기 방법에는 두 명확한 이점이 있다: 첫째로, 그것은 매우 효율적인; 둘째, 플라스 미드의 사전 변환 된 기준점과 라이브러리 저장할 수 있습니다 글리세롤 주식으로 장기적이 고 신속 하 게 효 모 모델에 변환의 노동 집약 단계 없이 다른 스크린에 적용에 대 한 각 시간. 어떻게이 방법은 성공적으로 사용할 수 있습니다 설명 수정 FUS의 독성 유전자에 대 한 화면으로.

ALS 관련 단백질 FUS, RNA/DNA 의무적인 단백질, 단일 효 모7,8이전 연구 했다. 유전자 검사를 사용 하 여 변환 기반 방법 FUS 독성을 억제 하는 여러 효 모 유전자 발견. 효 모 유전자의 인간 상 동 기관 나중 기본 신경 세포 및 ALS13의 쥐 모델에서 독성 억제에 효과적인 것으로 입증 되었다. 여기, 우리는 사용 하 여 동?...

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Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

mating-based-overexpression-library-screening-in-yeast

Research

JoVE Journal

Genetics

7.6K 조회수.  Wright State University. 이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.

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A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

연구

생화학

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

유전학

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

면역학 및 감염병학

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

생물학

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>효모 표면 디스플레이 기법을 통한 단백질 기능 최적화

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

생체공학

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

요약

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단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

진화 방법에 감독