Wir sind dankbar für die nachdenkliche Gespräche mit Mitgliedern der Ju-Labor und Zhong Labor und die finanzielle Unterstützung von der Wright State University.

Hinweis: Das hier beschriebene Protokoll eignet sich für screening-Bibliothek Plasmide in zehn 96-Well-Platten enthalten aber kann skaliert werden oben oder unten entsprechend. Das Protokoll muss wiederholt werden, um die gesamte Bibliothek Überprüfung abzuschließen. In der Regel kann Abschirmung gegen 10 Platten Bibliothek Gene jeweils bequem durch 1 Person behandelt werden.
1. Vorbereitung für 96-Well-Hefe-Transformation
Hinweis: Dieser Schritt ist wie zuvor beschrieben7,10durchgeführt.
<ol><li>Aliquoten 5 µL (ca. 50 – 100 ng) der Plasmid-DNA aus einer angeordneten Plasmid-Bibliothek in jede Vertiefung ein Rundboden-96-Well-Platte. Hinweis: Ein Beispiel für solch eine Bibliothek wäre eine Hefe gen Überexpression Bibliothek10.</li>
	<li>Impfen Sie 150 mL Hefe Pepton Traubenzucker (YPD) Medien in eine 500 mL-Flasche mit einer Kolonie (2 – 3 mm Durchmesser) von der haploiden Hefe-Stamm W303α. Brüten sie über Nacht bei 30 ° C mit schütteln (200 u/min).</li>
	<li>Am nächsten Morgen messen die OD600 der Übernacht-Kultur und verdünnen die Hefekultur OD600 = 0,1 (bis zu) 2 l YPD. Inkubieren sie bei 30 ° C mit schütteln (200 u/min) ~ 5 h bis die Kultur OD600 erreicht = 0,4 – 0,6.</li>
</ol>2. Hefe-Transformation
<ol><li>Ernte die Hefekultur 8 sterile 250 mL Zentrifuge Flaschen füllen und Zentrifugieren sie bei Raumtemperatur bei 3.000 X g für 10 Minuten abgießen der Überstand ohne Unterbrechung das Pellet. Hinweis: Führen Sie alle Schritte der Zentrifugation bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Hefe mit sterilem destilliertem H2O. 100 mL sterilen H2O hinzufügen, jede Flasche Zentrifuge und Wirbel um die Zelle Pellet aufzuwirbeln. Kombinieren Sie die gewaschenen Zellen in 2 Flaschen und Zentrifuge auf 3.000 X g für 5 min. Weg des Überstands Gießen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen in jeder Flasche in 100 mL der 0,1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc, 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA) und Zentrifugieren sie 3.000 x g für 5 min. Gießen aus der Überstand.</li>
	<li>Beim Zentrifugieren, 5 mL Lachs Samenzellen DNA (10 mg/mL) bei 100 ° C mit einem Block Heizung für 3 min. Kochen und dann abkühlen auf Eis.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie die Zelle-Pellets in 25 mL 0,1 M LiOAc/1XTE in jeder Flasche, kombinieren Sie die resuspendierte Zellen und übertragen Sie sie auf eine 150 mL Flasche. 5 mL der vorgekühlten Lachsen Samenzellen DNA und bei 30 ° C mit schütteln (225 u/min) für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Den Teig Zelle in eine sterile Einweg-Reagenz-Reservoir und mit einer Mehrkanal-Pipette, 35 µL der Zelle Mischung in jede Vertiefung der Rundboden-96-Well-Platte, enthält die Bibliothek Plasmid DNA übertragen. Wirbel der 96-Well-Platten mit einer Platte Vortexer für 1 min bei 1.000 u/min. Inkubieren Sie die Platten für 30 min bei 30 ° C ohne schütteln. Hinweis: Stapeln Sie die Platten nicht, so kann die Wärme effizienter übertragen. Wir haben festgestellt, dass aufschütteln der 96-Well-Platten bei 1.000 u/min verursacht keine Flüssigkeit, aus dem Brunnen zu verschütten, aber eine sichere Wirbel Geschwindigkeit getestet werden, sollte bevor Sie den Schritt ausführen.</li>
	<li>Bereiten Sie in einem Kolben 200 mL des Puffers Transformation, eine Endkonzentration von 40 % PEG3350, 10 % DMSO und 0,1 M LiOAc enthält. Vorbereitung des Umwandlung Puffers unmittelbar vor der Anwendung und durch Schütteln mischen.</li>
	<li>Entfernen Sie 96-Well-Platten aus dem Inkubator 30 ° C und mischen sie für 30 s bei 1.000 u/min mit der Platte Vortexer. Hinzu kommen 125 µL des Puffers Transformation jedes gut und dann Wirbel die Platten für 1 min bei 1.000 u/min.</li>
	<li>Die Platten bei 30 ° C für 30 min inkubieren und dann Hitze Schock die Hefe indem man die Platten in einem Inkubator 42 ° C für 15 Minuten. Hinweis: Stapeln Sie die Platten nicht.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Platten für 5 min bei 3.000 X g. Entfernen des Transformation-Puffers aus den Vertiefungen durch invertieren die Platten in einem Abfallbehälter und mit Nachdruck dumping des Puffers von den Platten. Beflecken Sie schnell die invertierten Platten auf einem sauberen Papiertuch, keine Flüssigkeit auf die Oberseite der Platten zu entfernen.</li>
	<li>Spülen Sie die Zellen, indem Sie die Platten 200 µL des minimalen Dropout mittlere entspricht die auswählbare Markierung auf dem Plasmid Bibliothek hinzufügen. Hinweis: Wir haben ein synthetisches Ura-Medium.</li>
	<li>Die Platten für 5 min bei 3.000 X g Zentrifugieren und den überstand über einem Abfallbehälter wie in Schritt 2.10 entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 160 µL minimal Ura-Medium enthält 2 % Glukose. Wirbel die Platten für 1 min bei 1.000 u/min und inkubieren sie bei 30 ° C für 48 h ohne schütteln. Beachten Sie nach 48 h, dass ein Pellet transformierte Hefe am unteren Rand jedes gut sichtbar ist.</li>
	<li>Fügen Sie mithilfe eines liquiden Dispensers 100 µL der Ura-Medien mit Glukose in jede Vertiefung einen neuen Satz von 96-Well Platten.</li>
	<li>Wirbel der Platten, die die transformierte Hefe (aus Schritt 2.13) bei 1.000 u/min für 30 s. mit einem sterilen Kunststoff 96-poligen Replikator, legen Sie die Stifte in die Vertiefungen der transformierten hefehaltigen und dann in die entsprechenden Vertiefungen der neuen Platten zu impfen gefüllt mit Medien. Inkubieren Sie die neuen Platten bei 30 ° C für 24 h. Hinweis: Wenn mit 10 Platten arbeiten, kann das Medium auch verzichtet werden manuell mit Mehrkanal-Pipetten.</li>
	<li>Nach 24 Stunden sollte ein Pellet Hefe im unteren Teil jedes erfolgreich transformierten hefehaltigen gut sichtbar sein. Um diese Hefestämme Glycerin Vorrat zu speichern, fügen Sie 50 µL 50 % Glycerin in jede Vertiefung Wirbel die Platten für 30 s bei 1.000 u/min, die Platten mit Dichtungsband Abdichten und frieren sie bei-80 ° C. Hinweis: Die oben genannten Schritte müssen nur einmal durchgeführt werden. Zukünftige Vorführungen von verschiedenen Hefe Modelle gegen die gleiche Bibliothek Einweg-Reagenz Reservoir aus Glycerin-Aktien starten und sofort aus den folgenden Schritten fortfahren.</li>
</ol>3. Paarung zwischen Zellen, die Bibliothek Gene und Abfrage Hefe
<ol><li>Um die Bibliothek Stämme aus dem Glycerin bestand wieder zu beleben, nimm die 96-Well-Platten aus dem-80 ° C Gefrierschrank, entfernen die Abdichtung Band, und lassen Sie die Hefe bei etwa 30 min bei Raumtemperatur Auftauen.</li>
	<li>Einmal die Hefe aufgetaut hat, können Sie einen sterilen Kunststoff 96-poligen Replikator impfen zu frischen Ura-Medien mit 2 % Glukose in 96-Well Platten 160 µL Glycerin Aktien und inkubieren sie bei 30 ° C für 24 h, sofort nachdem die Bibliothek Stämme verwendet werden , die Platten mit Dichtungsband abdichten, und wieder in die-80 ° C Gefrierschrank.</li>
	<li>Am selben Tag die Bibliothek Stämme (W303α) aufgetaut, impfen die Abfrage Hefestamm (hier der FUS in W303a), 50 mL YPD und wachsen sie über Nacht bei 30 ° C mit schütteln bei 250 u/min.</li>
	<li>Am nächsten Morgen Gießen Sie den Abfrage-Hefe-Stamm zu einem sterilen Einweg-Reagenz-Reservoir und aliquoten 160 µL der Abfrage Belastung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette.</li>
	<li>Mit dem liquid Dispenser, 160 µL YPD Medien verzichten Sie in jede Vertiefung der zehn 96-Well-Platten. Verwenden Sie diese Platten später für die Paarung der Abfrage-Hefe-Stamm mit der Bibliothek Hefe.</li>
	<li>Kurz Wirbel der 96-Well-Platte mit dem Abfrage-Stamm und dann mit einem sterilen 96-poligen Replikator um die Abfrage zu übertragen, die YPD-Platten belasten.</li>
	<li>Wirbel der Bibliothek kurz belasten Platten und für jede Bibliothek Stamm Platte verwenden einen neue sterilen 96-poligen Replikator übertragen die Bibliothek Stämme auf die YPD-Platten, die mit dem Abfrage-Stamm geimpft worden. Hinweis: Zellen in Glycerin verlieren ihre Keimfähigkeit nach mehreren Zyklen der Tauwetter-Freeze. Rückkehr der Bibliothek-Stämme in die Langzeitspeicherung (-80 ° C Gefrierschrank) so bald wie möglich halten Sie die Bibliothek in guter Qualität und für eine spätere Verwendung bereit. Richtig gepflegt, können Sie die Glycerin-Aktie eingefroren und wieder aufgetaut mindestens 10 mal. Wir empfehlen außerdem, eine Arbeitskopie und backup-Kopien von Glycerin-Lager zu halten. Bei der Arbeit bestand nicht funktioniert, sofort eine neue Arbeitskopie aus der Sicherungskopie.</li>
	<li>Inkubieren Sie die YPD-Platten bei 30 ° C für 24 h. Beachten Sie, dass ein Pellet Hefe nach 24 h im unteren Teil jeder gut sichtbar sein wird.</li>
	<li>Füllung-96-Well-Platten mit einem minimalen Dropout-Medium mit 2 % Raffinose, entspricht die wählbaren Markierungen auf dem Plasmid in der Abfrage-Belastung sowie auf die Bibliothek Plasmid (z. B.- seine - hier Ura).</li>
	<li>Verwenden Sie einen sterilen 96-poligen Replikator Hefe von der YPD Paarung Kulturen zu den selektiven Medien übertragen. Die 96-Well-Platten bei 30 ° C für 48 h Inkubation; nur Hefezellen gedeckt haben und gebildeten diploiden Zellen und daher sowohl die Abfrage Plasmid enthalten und die Bibliothek Plasmid werden sich in diesem Medium wachsen. Feststellen Sie nach 2 Tagen, dass ein Pellet auf dem Boden der Näpfchen sichtbar ist.</li>
</ol>(4) Schmierblutungen Assay
<ol><li>
Nach 48 h des Wachstums in der Raffinose-haltigen selektivmedien vor Ort die Hefe auf Agarplatten.
	<ol>
<li>Bereiten Sie 2 Sets von Ura seine ausfallende Platten mit 2 % Agar mit klaren Polystyrol-Platten, eine mit 2 % Galaktose und das andere mit 2 % Glukose.</li>
		<li>Wirbel der 96-Well-Platten für 1 min bei 1.000 u/min, dann vor Ort die Hefe, die Ura-His-Dropout-Platten mit 2 % Galaktose und 2 % Agar (FUS und Bibliothek Gene induziert) und die Ura-His-Dropout-Platten mit 2 % Glukose und 2 % Agar (FUS und Bibliothek Gene unterdrückt) mit einem Roboter-spotting Maschine, durch die die Kultur in den einzelnen gut auf Agarplatten in vervierfacht fleckig ist (d. h., die Kultur in 1 gut ist gesichtet um 4 Punkte auf der Agarplatte).</li>
		<li>Lassen Sie nach dem Absetzen die Agarplatten trocknen, und dann legen Sie sie kopfüber in einem 30 ° C Brutschrank. Fotografieren Sie die Agarplatten alle 24 h eine schneller/mehr Hefe Wachstum verzeichnen, in der die Toxizität der Abfrage Dehnung gerettet wird, oder eine langsamer/weniger Wachstum verzeichnen, in der die Toxizität der Abfrage Dehnung noch verstärkt wird. 4 Tage inkubieren Sie die Platten. Hinweis: Die Kultur in jedem kann gut auf Agarplatten 1-zu-1 gesichtet werden, wie in einer vorherigen Umwandlung basierende Methode10gezeigt. Jedoch, die 1 bis 4 hier Schmierblutungen (die bequem aufgestellt werden kann der Roboter spotting maschinenbenutzung) deutlich erhöht die Robustheit des Tests durch die Reduzierung von Fehlalarmen. Positive Treffer gelten nur, wenn alle 4 Kolonien aus der gleichen nun einen ähnlichen Phänotyp zeigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+(Saccharomycotina).">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li><li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir ein Protokoll um ein Plasmid Überexpression Bildschirm in der Hefe, die zur Einführung der Plasmid-Bibliothek in der Hefe-Modell mit Paarung durchzuführen. Mithilfe dieses Ansatzes können mehrere Hefe-Modelle der Neurodegenerative Krankheit Protein Toxizität gezeigt mit der gleichen Sammlung von Hefe mit einem Plasmid-Bibliothek umgewandelt. Der mühsame Prozess der Transformation muss nur durchgeführt werden, sobald nach dem hocheffizienten Hefe Paarung verwendet wird, um der Plasmid-Bibliothe...

Die angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae hat in der wissenschaftlichen Grundlagenforschung1 verbreitet, um zelluläre Prozesse, die direkt im Zusammenhang mit Krankheiten des Menschen zu verstehen. Darüber hinaus hat es als Modellorganismus verwendet worden für Studium menschlichen krankheitsassoziierten Proteine, wie diejenigen, die am häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, Morbus Parkinson, Chorea Huntington und Amyotrophe verbunden Lateralsklerose (ALS)2. Ein Vorteil der Hefe-Modells ist die Leichtigkeit, mit der ein genomweite Bildschirm ausgeführt werden kann, um zelluläre Signalwege, die im Zusammenhang mit der Toxizität von krankheitsbezogenen Proteine, wodurch Einblicke in den Mechanismus der Toxizität zu identifizieren. Ein solcher Bildschirm nennt einen Überexpression Bibliothek Bildschirm, in dem jedes 5.500 Hefe-Gene in einer angeordneten Bibliothek umgewandelt ist ein Hefe-Modell zu identifizieren, welche Gene Toxizität bei überexprimiert ändern können. Dieses Screening-Methode wurde erfolgreich in den Hefe-Modellen der mehrere Neurodegenerative Krankheit-verbundenen Proteine, einschließlich Huntingtin für Chorea Huntington3, α-Synuclein für Parkinson-Krankheit4,5 angewendet , Aβ für Alzheimer-Krankheit6, und FUS und TDP-43 ALS7,8,9. Während es in der Regel in einer Weise Hochdurchsatz-10erfolgt, ist die aufwändigste Schritt des Bildschirms individuell 5.500 Hefe-Gene aus einer angeordneten Bibliothek verändern. Dieser Schritt muss jedes Mal, wenn das Screening wiederholt durchgeführt werden, und wenn ein neu gegründeten Hefe-Modell untersucht werden muss. Es ist wichtig, einen effizienteren Weg, um diese Aufgabe zu finden.
Hefezellen können stabil in haploide und diploide Formen existieren. Es gibt zwei gegenüberliegende Paarung Arten von haploiden Zellen, Paarung Typ ein und α. haploiden Zellen von jeder Paarung produzieren und sezernieren ihre eigenen spezifischen Paarung Pheromon, auf die nur die entgegengesetzte Paarung Typ Zellen reagieren. Dies ermöglicht die Paarung zwischen ein und α Zellen, stabile diploide Zellen, a/α zu produzieren. Dieser Prozess ist spontan und hocheffiziente11. Wir profitieren von dieser einzigartigen Lebenszyklus von S. Cerevisiae , Plasmid-Bibliothek einzuführen. Genauer gesagt, wird jedes Gen in der angeordneten Plasmid-Bibliothek in haploiden Zellen eine Paarung Art, d. h., α Zellen umgewandelt werden. Diese Zellen mit den Genen der Bibliothek werden dann auf Glycerin Lager in einem angeordneten 96-Well-Format gespeichert werden. Für jedes Modell der Hefe, die untersucht werden muss, können Hefezellen mit den Bibliothek-Genen aus dem Glycerin bestand aufgetaut werden und das Screening kann erfolgen durch Paarung mit dem Hefe-Modell des Interesses an der gegenüberliegenden Paarung Typ, d.h.Paarung ein. Diese Idee der Verwendung Paarung von zwei Gene in der Hefe zusammenzubringen ist nicht neu. Es wurde erfolgreich in der Hochdurchsatz-Hefe angewendet, die zwei-Hybrid-Screening, in dem ein Köder zu konstruieren (d.h.Gal4 DNA-bindende Domäne Fusionen) in einer Paarung zusammen gebracht wird, durch Paarung mit einer Beute-Konstrukt aus einer angeordneten Bibliothek 12. jedoch wurde diese Strategie nie in Überexpression Bibliothek Vorführungen, derer immer traditionelle Transformationsmethoden angewendet.
Unser Labor gegründet zuvor ein Hefe-Modell von ALS-assoziierten Protein FUS7. Durch Überexpression Bibliothek Screening mit der Transformationsmethode entdeckten wir fünf Hefe-Gene (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1und VHR1), die Toxizität von FUS bei überexprimiert zu retten. Diese Ergebnisse waren unabhängig von einer anderen Gruppe8mit einer ähnlichen Studie bestätigt. hUPF1, eine menschliche Homolog des ECM32, wurde später gezeigt, Toxizität in primären Nervenzellen13 und im Tiermodell ALS14 sowie zu unterdrücken. Mit diesen fünf Gene als Kaufnachweis Prinzip, zeigen wir, dass alle fünf Gene ebenso FUS Toxizität zu retten, wenn sie bei der Paarung in die FUS-Hefe-Modell eingeführt werden. Da Hefezellen mit den Bibliothek-Genen können dauerhaft in Glycerin Lager gespeichert und wiederbelebt, wenn nötig, wird diese Paarung basierende Methode den zeitaufwendigsten Schritt der Transformation jedes Mal entfernen braucht die Bibliothek gegen untersucht werden. Da die Paarung hocheffiziente ohne Plasmid Transformation beteiligt ist, verringert sich diese Strategie auch erheblich die Kosten für Reinigung und Transformation einer großen Plasmid-Bibliothek. Wir wenden diese Methode erfolgreich zu einer Bibliothek screening gegen Hefe Modell des FUS.
Das Verfahren für die Paarung-basierten Screening ist in Abbildung 1kurz beschrieben. Zunächst die angeordneten Plasmid-Bibliothek verwandelt sich in einen haploiden Hefe-Stamm der Paarung Typ α mit einem Hochdurchsatz-Hefe Umwandlung Protokoll, in dem jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit einer bestimmten Bibliothek Plasmid transformiert Hefe enthält. Diese Sammlung von transformierten Hefe wird als Glycerin Stapel gespeichert, die aufgetaut und für den Einsatz später wiederbelebt werden kann. Das Hefe-Modell von Interesse, in diesem Fall FUS Toxizität muss in einem haploiden Hefestamm mit der gegenüberliegenden Paarung Art erzeugt werden (Typ Paarung ein). In gewissem Hochdurchsatz-mit sterilen 96-poligen Replikatoren die FUS Belastung und Hefestämme mit Plasmid-Bibliothek auf 96-Well-Platten mit rich-Media übertragen und erlaubt zu Paaren. Folgende Paarung, ein kleines Volumen von jedem Brunnen der Paarung Kultur wird in 96-Well-Platten mit synthetischen ausfallende Medien in welche nur diploid Hefe enthält sowohl die FUS übertragen und Bibliothek Gene wachsen können. Eine Roboter-spotting Maschine dient dann Hefekultur von jedem Bohrloch auf Agarplatten zu übertragen, wo der Ausdruck der FUS und die Bibliothek Gene induziert wird.  Darüber hinaus ist Hefekultur gesichtet, um Agarplatten zu steuern, wo FUS und die Bibliothek Gene nicht zum Ausdruck kommen. Nach einem Wachstum auf Agarplatten werden Gene, die zu retten oder verschlimmern FUS Toxizität identifiziert werden.

<table><tbody><tr><td>salmon Sperm DNA (SS-DNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD broth</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Granulated Agar</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Ura- drop out medium</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Lithium acetate, anhydrous</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350)</td><td>Spectrum Chemical&amp;nbsp;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96 Pin Replicator&amp;nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>non-treated, sterile</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research plus Multichannel Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>30-300ul volume</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R Centrifuge</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mating-based overexpression library screening in yeast

Angehende Hefe hat als Modell bei der Untersuchung von Proteinen verbunden mit menschlicher Krankheiten verbreitet. Genomweite genetisches Screening ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig in Hefe Studien verwendet. Der Ausdruck einer Reihe von neurodegenerativen Krankheit-assoziierte Proteine in Hefe verursacht Zytotoxizität und Aggregatbildung, Rekapitulation Befunde bei Patienten mit diesen Erkrankungen gesehen. Hier beschreiben wir eine Methode für das screening ein Hefe-Modell des Amyotrophic Lateral Sclerosis-assoziierten Proteins FUS für Modifikatoren von seiner Giftigkeit. Anstelle von Transformation, setzt diese neue Screening-Plattform auf die Paarung von Hefe eine angeordneten Bibliothek von Plasmiden in der Hefe-Modell einführen. Die Paarung Methode hat zwei Vorteile: Erstens ist es sehr effizient; Zweitens kann die bereits transformierte angeordneten Bibliothek der Plasmide für langfristig als ein Glycerin-Lager, und schnell auf andere Bildschirme ohne den arbeitsintensiven Schritt der Transformation in das Hefe-Modell angewendet jedes Mal gespeichert werden. Wir zeigen, wie erfolgreich diese Methode verwendet werden kann zum Bildschirm für Gene, die die Toxizität von FUS zu ändern.

Das ALS-assoziierten Protein FUS, eine RNA/DNA-bindendes Protein, war vorher im haploiden Hefe7,8studiert. Genetisches screening mit der Umwandlung basierende Methode entdeckte mehrere Hefe-Gene, die FUS Toxizität zu unterdrücken. Das menschliche Homolog von eines der Hefe Gene zeigte später wirksam zu unterdrücken Toxizität bei einer primären neuronale Zelle und Rattenmodell ALS13sein. Hier verwenden...

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Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Dieser Artikel stellt eine Paarung basierende Methode zur Überexpression Screening in der angehenden Hefe mit einer angeordneten Plasmid-Bibliothek zu erleichtern.

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

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Genetics

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Serie: Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Forschung

Biochemie

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetik

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Immunologie und Infektion

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Biologie

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>Optimierung der Proteinfunktionen durch Techniken zur Anzeige von Hefeoberflächen

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

Biotechnik

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Entwicklung Methode Regie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Entwicklung Methode Regie in