Name: a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells
Uploaded: 2018-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

אנו מודים ורוניקה Schreiter על סיוע טכני מעולה שלה והשינויים מועיל של הקפאה קריוגנית הוקמה טכניקה ותא תרבות המודל. בנוסף, אנחנו רוצה להודות אנדרס Maren, Swanhild Rodewald לסיוע טכני מעולה שלהם בניתוח עוקבות.

הערה: השחלות שור התקבלו מהמשחטה מסחרי. האוסף של תוצרי לוואי מטבחיים אינו דורש אישור מוסרי לפי החוק הגרמני.
1. עובד ההכנות ותנאים
<ol><li>כדי להבטיח עקרות, לבצע כל המדיה, רקמות הכנה, כמו גם כל תרבות לעבוד במעבדה התרבות תאים מיוחדים באמצעות ספסל זרימה שכבתית.</li>
	<li>להכין 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.4) בתוספת 100 IU פניצילין, סטרפטומיצין 0.1 מ"ג/מ"ל ו- 0.5 שהוא גוסס µg/µL עבור הובלה של השחלות. הערה: משך הזמן המקסימלי בין קבלת השחלות אנליטית GC הוא 2 ש ח בחודש זה.</li>
</ol>2. בידוד תאי Granulosa שור
<ol><li>
לשטוף את השחלות מספר פעמים ב- PBS 1 x (עם 100 IU פניצילין, סטרפטומיצין 0.1 מ"ג/מ"ל ו 0.5 שהוא גוסס µg/µL) כדי להסיר דם מפני השטח לפני תחילת ההליך בידוד. השתמש גביע, למקם את השחלות בפנים, למלא אותו PBS 1 x ולאחר למחוק את PBS שוב.
	<ol>
<li>חזור על שלב זה כביסה 3-4 x, עד השחלות מנוקים הדם הנותרים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נגב שחלה אחת באמצעות מגבון מעבדה ספוג עם אלכוהול 70%, כדי למזער את מציג אפשרי.</li>
	<li>עם מזרק 3 מ"ל, עם מחט 18 גרם, תשאף GC מאת ניקב זקיקים קטן-בינוני (< 6 מ מ, נמדד עם סרגל), ואת מאגר הזקיקים נוזל בצינור צנטריפוגה אחד 50 מ ל. הערה: כדי להרטיב את המזרק, לקחת כמות קטנה של PBS 1 x (עם 100 IU פניצילין, סטרפטומיצין 0.1 מ"ג/מ"ל ו 0.5 שהוא גוסס µg/µL). זה עוזר כדי לאסוף כמויות קטנות של נוזל הזקיקים ומונעת התאים נשארים בתוך המזרק.</li>
	<li>לאחר ניקב מספר זקיקים, לשטוף את המזרק ואת המחט עם 1 x PBS לניקוי ביניים.</li>
</ol>3. הקפאה קריוגנית של תאים
<ol><li>
השתמש trypan blue מכתים, לספור את התאים תחת hemocytometer.
	<ol>
<li>כדי לספור את מספר התאים קיימא, הכן צינור עם 1.5 µL של פתרון trypan blue 0.25%. הערה: התאים החיים יישאר וללא רבב בגלל trypan blue יכול רק גישה המכשול תא של תאים מתים, אשר לאחר מכן יופיעו כחול.</li>
		<li>להוסיף µL 15 של התליה תא granulosa הפתרון trypan blue ומערבבים אותם בעדינות.</li>
		<li>מקם את התערובת שתי לשכות hemocytometer. לספור את מספר החיים (למשל, מוכתם) תאים ריבוע גדול אחד לכל תא. הערה: אמנם ניתן לראות כמה תאי דם, הם ניתן לזיהוי על ידי גודלם קטן מאוד.</li>
		<li>לחשב את מספר התאים החיים עם הממוצע של שני ריבועים קאמרית על פי הנחיות כלליות; היחס של תאים חיים יכול להשתנות בין השחלות אך יעלה 60%13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לקחת דגימה מן הבריכה תא מבודד טרי granulosa כנקודת התייחסות לצורך ניתוח נוסף.
	<ol>
<li>בהתאם הרוזן תא מבודד GC, להפריש מספר מתאים של תאים כמו דוגמיות RNA, דנ א או חלבון הכנה. הערה: עבור בידוד RNA והערכת עוקבות בביטוי הגן, עונה 1 פרק 105 תאים מספיקים, ואילו אחרים ניתוחים הבאים עשויים לדרוש מספרים שונים, בדרך כלל גבוה יותר תא.</li>
		<li>במקום אחד או כמה aliquots של התאים התייחסות בצינור טריים, centrifuge זה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, המהירות המרבית (12,000 x g) כדי להשיג גלולה התא. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>מיד הלם-הקפאת הדגימות של חנקן נוזלי. חנות הדוגמה ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לבצע את הקפאה קריוגנית כדלקמן.
	<ol>
<li>להכין את המדיום הקפאה באמצעות נסיוב עגל העובר 80% (FCS) ו- 20% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד).</li>
		<li>על מנת בעדינות הצניפה GC, centrifuge GC למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, x 500 g.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע בזהירות, בעדינות resuspend התאים ב- FCS 100% (למשל, 1 מ"ל) עד פלאפון יותר גושים גלויים.</li>
		<li>להוסיף 1 נפח (למשל, 1 מ"ל) של המדיום קפוא מוכן התליה תא ולהעביר את התערובת ל בקבוקון ההקפאה. הערה: הריכוז הסופי של התקשורת הגנה על הקפאה יהיה דימתיל סולפוקסיד FCS ו-10%-90%.</li>
		<li>הכנס את המבחנה קריוגני מיכל הקפאה (זמינים מסחרית) מיוחדים, שמונעת הקפאה מהירה. קצב הקירור הדגימות לא יעלה-1 ° C/הגבלת העברת המכולה מקפיא בפריזר-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות.</li>
		<li>לאחסון ארוך יותר, מקם את הבקבוקונים קריוגני במיכלים טמפרטורה נמוכה במיוחד (למשל, מיכלי חנקן נוזלי שלב). הערה: הפרוטוקול ניתן לעצור כאן, כמו הקפאה קריוגנית מאפשר אחסון ארוך יותר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הכנה של תקשורת, תרבות צלחות התרבות התא
<ol><li>
המעיל תא תרבות צלחות עם קולגן 0.02% R. הערה: קולגן R ידוע חיונית בשביל להודעת משופרת של GC בתרבות.<ol>
<li>להכין פתרון 0.02% R קולגן עם מים מורתחים מתאים תרבית תאים.</li>
		<li>להוסיף 150 µL לכל טוב לתוך צלחת 24-טוב (= 2 ס מ2/טוב) ולוודא כי פני התרבות טוב מכוסה עם הפתרון קולגן R.</li>
		<li>תן פתרון יבש עם מכסה פתוח לכמה שעות או למשך הלילה בשכונה זרימה שכבתית.</li>
		<li>כאשר הלוחות תרבות יבש לחלוטין, להאיר אותם באור UV למשך 10-15 דקות למזער את הזיהום.</li>
		<li>במידת הצורך, לאחסן את הצלחות ב 4 ° C עד 2 חודשים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין מדיה ותוספי עבור תרבות העבודה במסגרת תא למינארי. להחלמה מוצלחת של GC, יש להם יעובדו מיד לאחר מפשיר.</li>
	<li>
להכין את המדיה הבאים.
	<ol>
<li>תוספת בינוני חיוני α-מינימלי (α-מ) עם 2 מ מגלוטמין 0.084% סודיום ביקרבונט, 0.1% אלבומין שור (BSA), 20 מ מ HEPES, 4 ננוגרם למ"ל סודיום סלניט, 5 transferrin µg/mL, 10 ננוגרם למ"ל אינסולין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1 מ מ.</li>
		<li>בנוסף, להוסיף סטרפטומיצין פניצילין ו- 0.1 מ"ג/מ"ל 100 IU למדיה. הערה: האנטיביוטיקה, פעם להתחמם, יציבים עבור-48 שעות. לכן, aliquot הכמות הרצויה של המדיה עבור הסידור תרבות ומדיה המתוכנן להחליף. לחמם רק את המדיה aliquots עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים. ניתן לאחסן את המדיה מוכן ב 4 ° C לא יותר מ- 3 חודשים.</li>
		<li>כדי לגרום לפעילות סטרואידים הם אורגניים GC שור, תוספת של α-מ בנוסף עם 20 ng/mL הורמון מגרה זקיק (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 ו- 2 מיקרומטר androstenedione. הערה: תמיד תוספת רכיבים אלה זמן קצר לפני תחילתה של החלפת תרבות או מדיה. הימנע חוזרות מחזורים ההקפאה-הפשרה לפתרונות מניות FSH ו- IGF-1, כמו זה מסכן את הפעילות סטרואידים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. תא תרבות עבודה
<ol><li>להפשיר את התאים במהירות בתוך אמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3-4 דקות, להעביר התליה תא מראש ומחוממת 37 ° C α-מ (ללא תוספת הורמון). צנטריפוגה, מומלץ נפח סופי של 10 מ"ל.</li>
	<li>Centrifuge GC למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר ולא ב 500 x g. למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף מראש ומחוממת, שהושלם α-מ, resuspend את התאים בזהירות.</li>
	<li>זרעי GC-צפיפות של עונה 1 פרק 105 או עונה 1 פרק 106 תאים לכל טוב נפח סופי של 500 µL. כוללים משכפל טכני לפחות שלוש בארות תרבות לכל תנאי.</li>
	<li>דגירה התרבות תאים בתוך אינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור 8 קבוצו.</li>
	<li>לבצע החלפת מדיה בכל יום אחר. להחליף רק שני שלישים של תרבות המדיה כדי להפחית את הלחץ וכדי להקל את העיבוד של התאים למדיה טריים. הערה: GC יוצרים פנוטיפ פיברובלסט דמוי אופייני אחרי כמה ימים בתרבות, נוטים אשכול ביחד. בתרבות תא-צפיפות גבוהה, אשכולות גדולים נמצאים בתדירות גבוהה יותר לעומת התרבות נורמלי צפיפות GC (איור 1, שמאל לעומת לוח נכון).</li>
</ol>6. לא חשפה Granulosa בתרבית תאים
<ol><li>כדי לבצע ניתוח הורמונים סטרואידים, לאסוף את המדיה תקפיא את זה ב-20 ° C. השתמש שיטות המתאימות כדי לנתח את הריכוז אסטרדיול ופרוגסטרון ב בילה מדיה [למשל, רדיו אימונולוגי (RIA)]14.</li>
	<li>לניתוח עוקבות של מולקולות יעד אחר (RNA, DNA, חלבונים, וכו '), lyse התאים ישירות לתוך המנה תרבות עם סוכן lysing המתאים כפי שהומלץ על ידי הספק. הערה: עבור רוב ההליכים בידוד, אפשרי לעצור את הפרוטוקול פה, כמו התאים lysed שניתן לאחסן ב-20 ° C עד 1 לשבוע. לאחסון ארוך יותר, יש לשמור את התאים ב- 80 ° c</li>
	<li>כדי לקבוע את השפע התעתיק, לסנתז cDNA ומדידת תעתיקים ספציפיים על-ידי טכניקות כמותיות פולימראז בזמן אמת תגובת שרשרת (qPCR)15. הערכה סטטיסטית צריך לכלול לפחות שלושה שכפולי של תרביות תאים שונים, שמקורם תאים שונים ההכנות (משכפל ביולוגי).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro.">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li><li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture.">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li><li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex.">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li><li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resource:+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes.">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li><li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+granulosa+cell+lines.">Ovarian granulosa cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).</li><li>Bernath, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+inhibits+fibronectin+gene+expression+in+a+newly+developed+granulosa+cell+line+by+a+mechanism+that+suppresses+cAMP-responsive+element-dependent+transcriptional+activation.">Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).</li><li>Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+between+freshly+isolated+and+spontaneously+immortalized+bovine+granulosa+cells:+protein+secretion,+steroid+metabolism,+and+responsiveness+to+growth+factors.">Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).</li><li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system:+induction+and+maintenance+of+estradiol+production,+response+to+follicle-+stimulating+hormone,+and+morphological+characteristics.">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li><li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media.">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li><li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell,+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited.">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li><li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro.">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li><li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells.">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells.">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li><li>Schneider, F., Br&#252;ssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts.">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li><li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density.">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage.">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).</li><li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions.">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li><li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

המודל התרבות התא שהוצגו מספקת כלי לניתוח granulosa תא בידול חוץ גופית בתוך. מספר מחקרים הראו כי הטיפוח-תרגול ללא סרום הוא תנאי הכרחי לשמירה על פעילות סטרואידים הם אורגניים GC שור או GC של מינים אחרים,8,9. בנוסף, ציפוי המנה תרבות עם רכיבים של מטריצה חוץ-תאית (למשל, קולגן R)13, שיפור ההחזקה של התאים באופן משמעותי. תכונה חשובה נוספת היא תקופת תרבות ממושך. . לאחרונה, זה הוכח כי תרבות לטווח ארוך יש צורך לקבל ביטוי מאוזן של granulosa תא זהות סמני17ופעילות שחלת בקר מספקת. נראה כי GC דורשים את הזמן כדי להתאושש מן הלחץ הפיזי במהלך ההליך בידוד.
תוספי מדיה FSH, IGF-1 ו androstenedione ידועים לזירוז פעילות ארומטאז תרבותי GC. במיוחד, תוספי עם androstenedione הכרחי לחלוטין, כמו GC הצורך הקדמה אסטרדיול סינתזה. זה כבר פורסם בעבר11,18 ו, לכן, לא עוד יותר נחקר במהלך המחקר הנוכחי. עם זאת, עיבוד של FSH, IGF-1, ובתמצית androstenedione ייתכן שיהיה צורך אחרים set-ups ניסיוני.
הקפאה קריוגנית בטכניקה המתוארת כאן יכול לעזור לשפר את הארגון של תרביות רקמה ניסויים על ידי הפיכתם עצמאית יותר מן ההיצע בדרגות שונות עם השחלות. על פי בדיקות קודמות, הקפאה קריוגנית אינה משפיעה על פנוטיפ GC או ייצור הסטרואידים בתרבות. כמו כן, השפע של סמן תעתיקים בתאים בתרבית לא חשפו הבדלים משמעותיים השוואת דוגמיות מקריסטלים של תאים בודדים טרי עם אלה נתון בעבר הקפאה קריוגנית16.
פרמטר קריטי עבור המודל הנוכחי של תרבות GC הוא התא יופיצ צפיפות. כפי שמוצג על ידי נציג תוצאות, הגדלת הצפיפות ציפוי המושרה שינויים יוצא דופן של מאפיינים פיזיולוגיים ומולקולרית. מספר גנים מוסדרים באופן ספציפי, הדומה השינויים הם המושרה על ידי גירוי LH ויוו4,19. העובדה כי צפיפות גדל והולך התא יכול לנהוג דמוי-התמיינות תהליכים ב- GC שור בתרבית צריך להיחשב בקפידה במודל זה GC במבחנה כדי למנוע תוצאות סותרות בין משכפל. לכן, תוצאות סותרות עם מחקרים אחרים ייתכן ולשייך צפיפויות תאים שונים, יש לבחון מקרוב יותר.
המודל התרבות המתואר כאן מתגלה כי שאינם מגיבים LH, כמו התמלילים של הקולטן LHCGR נמצאים בקרבת הגבול זיהוי. לפיכך, סימולציה של גל LH כאחד המצב ויוו נכשל לזירוז בידול13. בכל זאת, מודל זה מספק כלי שימושי ללמוד GC אסטרדיול-פעיל בתרבות העיקרי, בפרט כמו לא פונקציונלי-שור GC שורות קיימות כיום.
פרוטוקולי טיפול שונה יכול להיבדק במודל תרבות נוכח GC לעזור לפענח את מנגנוני הרגולציה של ייצור סטרואידים או בידול GC. גורמים נוספים, אחד המעורבים בתהליכים התפתחותיים יכול להיות מנותח בנפרד. לכן, מודל זה תרבות מספק בסיס עבור יישומים שונים רבים.

ביוץ מוצלחת ואת luteinization תלוי שינויים מולקולריים דק מכוון, מתוזמר היטב סוגי התאים הזקיקים סומאטית. מאז פרטים של תהליכים התפתחותיים אלה אינם עדיין לגמרי מובנים, עוד יותר להבהרה נדרש. In vivo גישות משוכללות ויקרות, בפרט, להיכשל כתובת המנגנונים המולקולריים ספציפיות המתרחשות במהלך folliculogenesis. לכן, מודלים reductionistic במבחנה נדרשים בנוסף, כדי לספק תובנות פרטים תאית ומולקולרית. מחקרים שונים מתארים את התרבות של כל זקיקי בהקשר של במבחנה הפריה טכניקות1,2,3. כי החוקרים מעוניינים מנגנונים של בידול, מחקרים רבים מתמקדים GC הזקיקים. תאים אלה, הקשורים ישירות oocyte, הם המקורות העיקריים של ייצור אסטרוגן, לכן, תפקיד חיוני בכל רחבי folliculogenesis ו- luteinization4.
מונצחים תא שורות של GC פותחו זנים שונים. עם זאת, רובם, אינם מראים ייצור הורמונים סטרואידים מספיקות5. עד כה, תא אחד בלבד שורה של שור ש-GC כבר הקים6, אך הקו הזה איבד את פעילותה שחלת בקר לאחר קטעים מספר7. לכן, מאז steroidogenesis, ובעיקר, אסטרדיול הפקה היא תכונה חיונית הפונקציונליות GC, מומלץ ללמוד היבטים אלה במודלים התרבות התא הראשי. במחקרים קודמים, הוכח כי הפקה אסטרדיול ניכר יכול רק להיות שנצפו תחת תרבות סרום ללא תנאים8,9. בהמשך, תוספת של הסימן המקדים של אסטרדיול סינתזה היא תנאי הכרחי נוסף, כפי GC להיכשל להביע את האנזים הנחוץ ניתן להמיר androstenedione10פרוגסטרון. בנוסף, אפקט סינרגיסטי של FSH ו- IGF-1 תוספי במבחנה חשף פעילות אופטימיזציה של ארומטאז, האנזים מפתח של אסטרדיול סינתזה11. בפרוטוקול הנוכחי, מתוארים גם גורמים חשובים אחרים, שיש להם השפעה משמעותית על המודל התרבות GC. בפרט, התא יופיצ צפיפות יש השפעות עצומה על התוצאה של ניסוי12. יתר על כן, יכול להקים טכניקה הקפאה קריוגנית של GC שור זה אינם מתערבים באופן משמעותי GC פיזיולוגיה בתרבות. טכניקה זו מסייעת לשפר את הארגון של התא תרבות עבודה כדי למטב את הצפיפות ציפוי המועדפת.

<table><tbody><tr><td>PBS Instamed w/o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 182-05</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &amp;micro;g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2213</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>amphotericin (250 &amp;micro;g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2612</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>3 mL syringe (Omnifix Luer)</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>18 G needle</td><td>Roth</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Merck-Millipore</td><td>S 0115</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>cryo-preservation vials (2 mL)</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 89020</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX cell freezing container</td><td>Corning</td><td>432004</td><td></td></tr><tr><td>culture dish, 24-well, flat bottom</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 92424</td><td></td></tr><tr><td>collagen R (0.2 %)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Merck-Millipore</td><td>F 0915</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0282</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1713</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1603</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>dissolved in sterile water</td></tr><tr><td>transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td>dissolved in sterile water</td></tr><tr><td>insulin (10 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>dissolved in 1x PBS</td></tr><tr><td>NEA</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0293</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma</td><td>F4021</td><td>we prefer to use a stock solution of 2 &amp;micro;g/mL, diluted in 0.9 % NaCl</td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Sigma</td><td>I1146</td><td>we use a stock solution of 2 &amp;micro;g/mL, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/mL BSA</td></tr><tr><td>androstenedione</td><td>Sigma</td><td>46033</td><td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td></tr></tbody></table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

תאים granulosa השחלות (GC) הם המקור העיקרי של אסטרדיול סינתזה. המושרה על ידי גל הורמון מחלמן preovulatory (LH), תאי theca את, בפרט, granulosa תא השכבה עמוקות לשנות מאפיינים מורפולוגיים, הפיזיולוגית המולקולרי שלהם ויוצרים הקורפוס ייצור פרוגסטרון התשובה כי הוא אחראי על שמירת הריון. תא תרבות הן כלי חיוני ללמוד את מנגנוני הרגולציה כבסיס מעורב הטרנספורמציה folliculo-luteal. פרוטוקול הציג מתמקד הליך הבידוד של הקפאה קריוגנית של שור GC של זקיקים קטן-בינוני (< 6 מ מ). בטכניקה זו, ניתן להשיג אוכלוסיה טהור של GC. ההליך הקפאה קריוגנית מאוד מקל זמן ניהול של התרבות תאים לעבודה עצמאית של היצע רקמות (השחלות) ישיר הראשי. פרוטוקול זה מתאר תרבות ללא סרום תא מודל המחקה את מצב פעיל אסטרדיול GC שור. תנאים חשובים כי הם חיוניים עבור תרבות מוצלח תא סטרואידים-פעילה הם דנו לאורך כל הפרוטוקול. הוכח כי הגדלת הצפיפות ציפוי של התאים גורם לתגובה ספציפית כמצוין על-ידי פרופיל ביטוי וייצור הורמונים ג'ין שינו. יתר על כן, מודל זה מספק בסיס ללימודי ב- GC בידול ויישומים אחרים.

GC מצופה-עונה 1 פרק 105 תאים/טוב התצוגה מראה דמוי פיברובלסט אופייני כפי שהם יוצרים סיומת תא להשוות fibroblasts נוטים לבנות אשכולות (איור 1a וג 1). הגדלת צפיפות ציפוי על ידי 10-fold עונה 1 פרק 106 תאים/טוב לא שינתה את המורפולוגיה אבל יכול להיות שנצפו אשכולות תאים נוספים (איור 1b ו- 1 י, חצים). כפי שמוצג כבר בפרסום הקודם, הציפוי קולגן של מאכלים תרבות השתפר במידה רבה ההחזקה של תאים13.
הקפאה קריוגנית הראשונית לא השתנה במידה ניכרת מאפיינים פיזיולוגיים של תאים בתרבות לעומת הילדים ישירות תרבותי מדגימות טרי מבודד. זה מוצג באיור 2 שפע תעתיק (נמדד על-ידי qPCR) של סמן מספר גנים לא שונות בעת השוואה בין תאים בתרבית נגזר בריכות קפוא או טרי מבודד.
איור 3 מראה תוצאות נציג של ניתוח הורמונים סטרואידים (נמדד על ידי ריאה) ב- GC שור תרבותי-נורמלי לעומת צפיפות גבוהה. ריכוז אסטרדיול יופחתו במידה משמעותית בתרבות בצפיפות גבוהה לעומת התרבות רגיל-צפיפות, ואילו ייצור פרוגסטרון נוטה להיות גבוה יותר.
ניתוח השוואתי של מספר גנים (נמדד על-ידי qPCR) בתרבויות גבוהה לעומת רגיל-צפיפות חשף אפקט משמעותי (איור 4). CYP19A1, קידוד האנזים מפתח של אסטרדיול ביוסינטזה ארומטאז, כמו גם את הקולטן גונדוטרופין FSHR, היו באופן משמעותי למטה מוסדר. לעומת זאת, הגנים RGS2 ו- VNN2 הראו משמעותי למעלה-תקנה. תוצאות אלו מראים בבירור כי תהליכים ספציפיים של התמיינות הם המושרה על ידי הגדלת תא יופיצ צפיפות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> איור 1: תרבותי תאים granulosa שור על רגיל (לוחות שמאלה) וצפיפות גבוהה התא (נכון פאנלים). ( ג) ותאי תרבותי-צפיפות של תאים 1 x 10 5/באר מוצגת הפנוטיפ פיברובלסט דמוי טיפוסי. (b ו- d) GC תרבותי-צפיפות גבוהה ציפוי (1 x 106 תאים/טוב) נטו כדי ליצור תאים גדולים אשכולות (חיצים) בתדירות גבוהה יותר לעומת התאים תחת צפיפות נורמלי (החלונית הימנית). גודל ברים = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> איור 2: השוואה של תאים תרבותי ישירות לאחר בידוד, לאחר הקפאה קריוגנית. התאים היו תרבותי-צפיפות של תאים5 עונה 1 פרק 10 לכל טוב. בביטוי הגן של הפרוטוקולים סמן מספר הוערך וגילה אין הבדל בין תאים בתרבית עם או בלי הקפאה קריוגנית הראשונית. Boxplot מראה את החציון של n = 3. דו-זנבית של סטודנט t-לבדוק, p-ערכים הינם כלולים. איור זה מתרבה מ Baufeld ו- Vanselow16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> איור 3: ריכוז הורמונים סטרואידים בתאים granulosa תרבותי-ציפוי שונים צפיפויות. ריכוז אסטרדיול (E2) ירדה משמעותית כאשר GC היו תרבותי-צפיפות גבוהה תא, ואילו ריכוז הפרוגסטרון (P4) רק נוטה להיות גבוה יותר. ריכוז ההורמון תוקנה עבור התוכן דנ א לנרמל למספרים תאים שונים. מתכוונת ואת SEM של n = 3 מוצגים. 0.05 > p , דו-זנבית של סטודנט t-מבחן. איור זה מתרבה מ. Baufeld et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> איור 4: שפע של הפרוטוקולים מפתח פונקציונלי בתאים granulosa תרבותי-נורמלי לעומת צפיפות גבוהה יופיצ. GC שור תרבותי בתנאים ללא סרום עבור 8 קבוצו חשף תקנה ספציפית של מספר גנים סמן שנבחרו. Boxplot מציגה את החציון של n = 3 משכפל בודדים. p < 0.05, דו-זנבית של סטודנט t-מבחן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

מודל התרבות ארוכת טווח של תאים granulosa שור בתנאים ללא סרום מתואר. מודל זה מאפשר לחוקרים לחקור את ההשפעות של גורמים שונים ותנאים כמו ציפוי שונים צפיפויות על המאפיינים של ייצור אסטרוגן בתאי granulosa שור.

מודל תרביות רקמה של ייצור אסטרוגן Granulosa שור ראשי תאים

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

a-tissue-culture-model-estrogen-producing-primary-bovine-granulosa

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Views.  Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN). מודל התרבות ארוכת טווח של תאים granulosa שור בתנאים ללא סרום מתואר. מודל זה מאפשר לחוקרים לחקור את ההשפעות של גורמים שונים ותנאים כמו ציפוי שונים צפיפויות על המאפיינים של ייצור אסטרוגן בתאי granulosa שור.

Video: A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Heterotypic תלת ממדי<em&gt; במבחנה</em&gt; מידול של אינטראקציות stromal-אפיתל בייזום והתקדמות סרטן השחלות

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Medicine

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Developmental Biology

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

מודל התרבות 3D-תגובת הורמון של האפיתל בלוטת חלב האדם

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Bioengineering

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

במבחנה תרבות אסטרטגיה עבור Oocytes מ זקיק אנטרל מוקדם בבקר

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

הקמת מונולייר דו-ממדי מתרבית אנטרואידית אילית בקר תלת מימדית

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating drug efficacy and toxicity, and tissue bioengineering. However, applying these models for the described reasons may be limited because of the three-dimensional (3D) nature of these models. For example, using 3D enteroid culture systems to study digestive diseases is challenging due to the inaccessibility of the intestinal lumen and its secreted substances. Indeed, stimulation of 3D organoids with pathogens requires either luminal microinjection, mechanical disruption of the 3D structure, or generation of apical-out enteroids. Moreover, these organoids cannot be co-cultured with immune and stromal cells, limiting in-depth mechanistic analysis into pathophysiological dynamics. To circumvent this, we optimized a bovine primary cell two-dimensional (2D) enteroid-derived monolayer culture system, allowing co-culture with other relevant cell types. Ileal crypts isolated from healthy adult cattle were cultured to generate 3D organoids that were cryopreserved for future use. A 2D monolayer was created using revived 3D enteroids that were passaged and disrupted to yield single cells, which were seeded on basement membrane extract-coated transwell cell culture inserts, thereby exposing their apical surface. The intestinal monolayer polarity, cellular differentiation, and barrier function were characterized using immunofluorescence microscopy and measuring transepithelial electrical resistance. Stimulation of the apical surface of the monolayer revealed the expected functionality of the monolayer, as demonstrated by cytokine secretion from both apical and basal compartments. The described 2D enteroid-derived monolayer model holds great promise in investigating host-pathogen interactions and intestinal physiology, drug development, and regenerative medicine.

מחבר זרקור: מודל אנטרואידים מתקדם לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן 

Enteroids are emerging as a novel model for studying tissue physiology and pathophysiology, drug development, and regenerative medicine. Here, we describe a bovine primary cell 2D enteroid-derived culture system that permits co-culture with relevant tissue cell types. This model offers a translational advantage for gastrointestinal research modeling.

יצירת מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ראשונית שמקורה באנטרואיד בקר ליישומים במחקר ביו-רפואי תרגומי

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

מודל תרביות רקמה של ייצור אסטרוגן Granulosa שור ראשי תאים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Heterotypic תלת ממדי

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

מודל התרבות 3D-תגובת הורמון של האפיתל בלוטת חלב האדם

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

במבחנה תרבות אסטרטגיה עבור Oocytes מ זקיק אנטרל מוקדם בבקר

יצירת מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ראשונית שמקורה באנטרואיד בקר ליישומים במחקר ביו-רפואי תרגומי

יצירת מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ראשונית שמקורה באנטרואיד בקר ליישומים במחקר ביו-רפואי תרגומי

יצירת מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ראשונית שמקורה באנטרואיד בקר ליישומים במחקר ביו-רפואי תרגומי