Agradecemos a Verónica Schreiter por su excelente asistencia técnica y modificaciones útiles del modelo de cultura de técnica y de la célula de criopreservación establecido. Además, queremos agradecer a Maren Anders y Swanhild Rodewald por su excelente asistencia técnica en el análisis posterior.

Nota: Los ovarios bovinos se obtuvieron de un matadero comercial. La colección de subproductos de matadero no requiere una aprobación ética según la ley alemana.
1. condiciones de trabajo y preparativos
<ol><li>Para garantizar la esterilidad, realizar todos los medios y preparación de tejido, así como toda cultura de trabajo en un laboratorio de cultura de célula especializada utilizando un banco de flujo laminar.</li>
	<li>Preparar 1 x de tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4) con 100 UI de penicilina, estreptomicina 0.1 mg/mL y 0,5 μg/μl anfotericina para el transporte de los ovarios. Nota: La duración máxima entre recibir los ovarios y aislar el GC es de 2 horas en este montaje.</li>
</ol>2. aislamiento de células de la Granulosa bovina
<ol><li>
Lave los ovarios varias veces en PBS 1 x (con 100 UI de penicilina, estreptomicina 0.1 mg/mL y 0,5 μg/μl anfotericina) para quitar la sangre de la superficie antes de iniciar el procedimiento de aislamiento. Utilizar un vaso de precipitados, coloque los ovarios dentro, llenar con PBS 1 x y descartar el PBS otra vez.
	<ol>
<li>Repita este paso de lavado 3 – 4 x, hasta que los ovarios se limpian de sangre restante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpie un ovario con un laboratorio para limpiar con alcohol al 70%, para reducir posibles contaminaciones.</li>
	<li>Con una jeringa de 3 mL y una aguja de 18 G, Aspire la GC por punción de los folículos de tamaño pequeño a mediano (< 6 mm, mide con una regla) y el líquido folicular en un tubo de centrífuga de 50 mL. Nota: Para humedecer la jeringa, tome una pequeña cantidad de PBS 1 x (con 100 UI penicilina estreptomicina de 0,1 mg/mL y 0,5 μg/μl anfotericina). Esto ayuda a recoger pequeñas cantidades de líquido folicular y evita que las células se pegue dentro de la jeringa.</li>
	<li>Después de pinchar varios folículos, enjuague la jeringa y aguja con 1 x PBS para la limpieza intermedia.</li>
</ol>3. criopreservación de las células
<ol><li>
Utilizar la tinción de azul de tripano y contar las células en un hemocitómetro.
	<ol>
<li>Para contar el número de células viables, preparar un tubo con 1,5 μl de una solución de 0.25% azul de trypan. Nota: Las células vivas permanecerá sin mancha porque azul trypan sólo puede acceder a la barrera de la célula de células muertas, que luego aparecen en azul.</li>
		<li>Añadir 15 μl de la suspensión de células de la granulosa a la solución de azul de tripano y mezclar suavemente.</li>
		<li>Coloque la mezcla en ambas cámaras un hemocitómetro. Contar el número de la vida (p. ej., mancha) las células en una gran plaza por cámara. Nota: Aunque se observan algunas células de la sangre, se puede distinguir por su tamaño muy pequeño.</li>
		<li>Calcular el número de células vivas con la media de ambos cuadrados de cámara según las directrices generales; la proporción de las células vivas puede variar entre los ovarios pero debe exceder 60%13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Toma una muestra de la piscina de la célula de granulosa recientemente aisladas como referencia para su posterior análisis.
	<ol>
<li>Dependiendo de la cuenta de célula de la GC aislado, reservar un número adecuado de células como muestras de referencia de RNA, DNA o proteína preparación. Nota: Para el aislamiento de RNA y la posterior evaluación de la expresión génica, las 1 x 105 células son suficientes, mientras que otros análisis posteriores podrían requerir un número de células diferentes, generalmente más alta.</li>
		<li>Coloque una o varias partes alícuotas de las células de referencia en un fresco tubo y centrifugar durante 1 minuto a temperatura ambiente y velocidad máxima (12.000 x g) para obtener un precipitado de células. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Inmediatamente choque-congelación de las muestras en nitrógeno líquido. Almacenar la muestra a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Llevar a cabo la criopreservación como sigue.
	<ol>
<li>Preparar el medio de congelación con 80% de suero de ternero fetal (FCS) y 20% de dimetilsulfóxido (DMSO).</li>
		<li>Para suavemente de la pelotilla de la GC, centrifugar el GC por 3 min a temperatura ambiente y x 500 g.</li>
		<li>Retire con cuidado el sobrenadante y resuspender suavemente las células en 100% FCS (p. ej., 1 mL) hasta no más celulares macizos son visibles.</li>
		<li>Agregar 1 volumen (por ejemplo, 1 mL) del medio de congelación preparado para la suspensión de células y transferir la mezcla a un frasco de criogénico. Nota: La concentración final de los medios de protección de cryo será 90% FCS y 10% DMSO.</li>
		<li>Coloque el frasco criogénico en un recipiente de congelación (disponible comercialmente) especializado que impide la congelación rápida. La velocidad de enfriamiento de las muestras no debe exceder-1 ° C/min transferencia el recipiente congelación en un congelador de-80 ° C durante al menos 4 h.</li>
		<li>Para un almacenaje más largo, coloque los frascos criogénicos en contenedores de ultra baja temperatura (por ejemplo, contenedores de nitrógeno líquido de fase). Nota: El protocolo se puede detener aquí, como la criopreservación permite un almacenaje más largo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. preparación de medios de comunicación y cultura placas para cultivo celular
<ol><li>
Capa celular placas con 0,02% de colágeno R. Nota: Colágeno R es conocido por ser esencial para una mejor sujeción de GC en cultura.<ol>
<li>Preparar una solución de R 0.02% colágeno con agua purificada apta para cultivo celular.</li>
		<li>Añadir 150 μL por pocillo de una placa de 24 pocillos (= 2 cm2/pozo) y asegurar que toda la superficie de la cultura está bien cubierta con la solución de colágeno I.</li>
		<li>Deje que la solución seque con la tapa abierta durante unas horas o toda la noche en la campana de flujo laminar.</li>
		<li>Cuando las placas estén completamente secas, les irradiar con luz ultravioleta durante 10-15 min minimizar la contaminación.</li>
		<li>Si es necesario, almacenar las placas a 4 ° C hasta por 2 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar los medios de comunicación y suplementos para el trabajo de la cultura bajo una campana de flujo laminar. Para una recuperación exitosa de la GC, tienen que ser procesados inmediatamente después de descongelarla.</li>
	<li>
Preparar los siguientes medios.
	<ol>
<li>Suplemento medio esencial mínimo de α (α-MEM) con 2 mM L-glutamina, bicarbonato de sódico 0,084%, 0.1% de albúmina sérica bovina (BSA), 20 mM HEPES, selenito de sodio de 4 ng/mL, 5 transferrina μg/mL, 10 ng/mL insulina y 1 mM no esenciales aminoácidos.</li>
		<li>Además, agregar estreptomicina penicilina y 0.1 mg/mL 100 UI a los medios de comunicación. Nota: Los antibióticos, una vez calentados, son estables durante aproximadamente 48 horas. Por lo tanto, alícuota la cantidad deseada de los medios de comunicación para la creación de cultura y medios de comunicación previsto intercambiar. Caliente previamente sólo las alícuotas de los medios de comunicación a 37 ° C en un baño de agua. Los medios preparados pueden conservarse a 4 ° C durante no más de 3 meses.</li>
		<li>Para inducir la actividad esteroide en GC bovino cultivada, suplemento del α-MEM además con 20 ng/mL hormona folículo-estimulante (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 y 2 μm androstenediona. Nota: Siempre complementar estos componentes poco antes del inicio de un cambio de cultura o los medios de comunicación. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación para soluciones FSH y el IGF-1, ya que esto podría comprometer la actividad esteroide.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. trabajo de la cultura de la célula
<ol><li>Descongelar las células rápidamente en un baño de agua a 37 ° C durante 3 – 4 minutos y transferir la suspensión de células a 37 ° C con α-MEM (sin suplemento de hormona). Para la centrifugación, se recomienda un volumen final de 10 mL.</li>
	<li>Centrifugue la GC por 3 min a temperatura ambiente y a 500 x g. Deseche el sobrenadante. Agregar a precalentado y suplido α-MEM y resuspender las células con cuidado.</li>
	<li>Semilla de la GC en una densidad de 1 x 105 o 1 x 106 células por pocillo en un volumen final de 500 μl. incluye repeticiones técnicas de al menos tres pozos de cultura por condición.</li>
	<li>Incubar el cultivo de células en una incubadora a 37 ° C con 5% CO2 para el 8 d.</li>
	<li>Realizar un intercambio de medios de comunicación todos los días. Reemplazar sólo las dos terceras partes de los medios de cultivo para reducir el estrés y facilitar la adaptación de las células a los medios de comunicación fresco. Nota: El GC forman un fenotipo típico de fibroblasto-como después de unos días en la cultura y tienden a agrupan. En la cultura de alta densidad celular, grupos más grandes se encuentran más frecuentemente en comparación con la cultura de densidad normal GC (figura 1, izquierda vs derecha panel).</li>
</ol>6. posterior análisis de células de la Granulosa cultivadas
<ol><li>Para realizar el análisis de la hormona esteroide, recoger los medios de comunicación y congelar a-20 ° C. Utilizar métodos apropiados para analizar la concentración de estradiol y progesterona en el pasado los medios de comunicación [por ejemplo, radioinmunoanálisis (RIA)]14.</li>
	<li>Para el posterior análisis de moléculas diferentes (RNA, DNA, proteínas, etc.), lyse las células directamente en la placa de cultivo con un agente lisis apropiado según lo recomendado por el proveedor. Nota: Para la mayoría de los procedimientos de aislamiento, es posible dejar el protocolo, como las células sometidas a lisis pueden conservarse a-20 ° C hasta 1 semana. Para un almacenaje más largo, las células deben ser mantenidas a-80 ° C.</li>
	<li>Para determinar la abundancia de transcripción, sintetizar cDNA y medir en tiempo real cuantitativa de la polimerasa (qPCR) la reacción en cadena técnicas15transcripciones específicas. Una evaluación estadística debe incluir al menos tres réplicas de culturas diferentes de la célula, originadas de preparaciones de diferentes celulares (Replica biológica).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro.">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li><li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture.">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li><li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex.">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li><li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resource:+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes.">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li><li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. 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K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system:+induction+and+maintenance+of+estradiol+production,+response+to+follicle-+stimulating+hormone,+and+morphological+characteristics.">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li><li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media.">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li><li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell,+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited.">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li><li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro.">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li><li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells.">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells.">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li><li>Schneider, F., Br&#252;ssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts.">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li><li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density.">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage.">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).</li><li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions.">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li><li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El modelo de cultura de célula presentado ofrece una herramienta para analizar granulosa célula diferenciación in vitro. Varios estudios demostraron que un cultivo libre de suero es un requisito para mantener la actividad esteroide cultivada bovina GC o GC de otras especies8,9. Además, cubriendo la placa de cultivo con componentes de la matriz extracelular (p. ej., colágeno I)13, mejoró la fijación de las células considerablemente. Otra característica importante es el período de cultivo prolongado. Recientemente, se ha demostrado que una cultura a largo plazo es necesaria para obtener suficiente actividad esteroidogénica y una expresión equilibrada de granulosa célula identidad marcadores17. Parece que la GC requiere tiempo para recuperarse del estrés físico durante el procedimiento de aislamiento.
Los suplementos de los medios de comunicación FSH, IGF-1 y la androstenediona son conocidos por inducir la actividad de la aromatasa en cultivan GC. Sobre todo, los suplementos con androstenediona es absolutamente necesario, como el GC necesita un precursor para la síntesis de estradiol. Esto ha sido publicado previamente11,18 y, por lo tanto, no fue más investigado durante el presente estudio. Sin embargo, una adaptación de la FSH, IGF-1 y las concentraciones de androstenediona puede ser necesaria para otros montajes experimentales.
La técnica de criopreservación descrita aquí puede ayudar a mejorar la organización de los experimentos de cultivo de tejidos por lo que los hace más independientes de la fuente variable con los ovarios. Según pruebas previas, la criopreservación no afecta el fenotipo de GC o la producción de esteroides en la cultura. Además, la abundancia de las transcripciones de marcador en las células cultivadas no reveló diferencias significativas comparando muestras preparadas de células recién aisladas con los previamente sometidos a criopreservación16.
Un parámetro fundamental para el modelo actual de la cultura de GC es la célula placas de densidad. Como se muestra en los Resultados de representante, aumentando la densidad de placas indujo cambios notables de las características fisiológicas y moleculares. Varios genes se regulan de manera específica, que se asemejan a los cambios que son inducidos por la estimulación de la LH en vivo4,19. El hecho de que un aumento de la densidad celular puede conducir a procesos de diferenciación como en GC bovino cultivada debe considerarse meticulosamente en este modelo de GC en vitro para evitar resultados contradictorios entre repeticiones. Por lo tanto, resultados contradictorios con otros estudios podrían atribuirse a las densidades celulares diferentes y deben ser examinadas más de cerca.
El modelo de cultura descrito aquí se reveló que no responden a la LH, como los transcritos del receptor de la LHCGR están cerca del límite de detección. Por lo tanto, una simulación de la oleada de LH por igual la situación en vivo no pudo inducir diferenciación13. Sin embargo, este modelo proporciona una herramienta útil para el estudio activo estradiol GC en cultivo primario, en particular como no funcional bovinas líneas de GC existen en la actualidad.
Diferentes protocolos de tratamiento pueden probarse en el actual modelo de cultura de la GC que ayudan a desentrañar los mecanismos de regulación de la producción de esteroides o diferenciación de GC. Factores más, solos que están involucrados en procesos de desarrollo pueden analizarse por separado. Por lo tanto, este modelo de cultura proporciona una base para muchas aplicaciones diferentes.

Luteinización y ovulación exitosa dependen de alteraciones moleculares finamente afinadas y bien orquestadas en tipos de la célula folicular somáticos diversos. Puesto que los detalles de estos procesos de desarrollo no se entienden todavía completamente, más aclaración se requiere. Métodos in vivo son elaborados y costosos y, en particular, no mecanismos moleculares específicos de la dirección que se producen durante la Foliculogénesis. Por lo tanto, modelos reduccionistas en vitro se necesitan además, para proporcionar la penetración en datos de celulares y moleculares. Diferentes estudios describen la cultura de los folículos todo en el contexto de en vitro fecundación técnicas1,2,3. Porque los investigadores están interesados en los mecanismos de diferenciación, muchos estudios se centran en GC folicular. Estas células, directamente asociadas con el ovocito, son las principales fuentes de producción de estrógeno y, por lo tanto, juegan un papel esencial en la Foliculogénesis y luteinización4.
Inmortalizado células de especies diferentes se han desarrollado líneas de GC. La mayoría de ellos, sin embargo, no muestra suficiente hormona esteroide producción5. Hasta ahora, sólo uno de células de bovino que GC ha sido establecida6, pero esta línea perdió su actividad esteroidogénica después de varios pasajes7. Por lo tanto, desde la esteroidogénesis y, en particular, producción de estradiol es un rasgo esencial de la funcionalidad de la GC, es conveniente estudiar estos aspectos en modelos de cultura de célula primaria. En estudios previos, se demostró que sólo se puede observar una producción considerable de estradiol bajo condiciones de cultivo libre de suero8,9. Además, la suplementación de un precursor de la síntesis de estradiol es otro requisito previo, GC no expresan la enzima necesaria que puede convertir progesterona androstenediona10. Además, el efecto sinérgico de la FSH y el IGF-1 suplementación en vitro revelaron una actividad optimizada de la aromatasa, la enzima dominante del estradiol síntesis11. En el presente Protocolo, también se describen otros factores importantes que tienen un impacto sustancial en el modelo de cultura de la GC. En particular, la célula galjanoplastia densidad tiene enormes efectos sobre el resultado del experimento12. Además, se pudo establecer una técnica de criopreservación de GC bovina que no interfiere significativamente con la fisiología de la GC en la cultura. Esta técnica ayuda a mejorar la organización del trabajo de la cultura de célula y a optimizar la densidad de placas preferido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 182-05</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin (250 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2612</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe (Omnifix Luer)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>Roth</td>
			<td>C724.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-preservation vials (2 ml)</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 89020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX cell freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture dish, 24-well, flat bottom</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen R (0.2 %)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>F 0915</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin (200 mM)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1713</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1603</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin (10 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516</td>
			<td>dissolved in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEA</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0293</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4021</td>
			<td>we prefer to use a stock solution of 2 &#181;g/ml, diluted in 0.9 % NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR3-IGF-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1146</td>
			<td>we use a stock solution of 2 &#181;g/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>androstenedione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46033</td>
			<td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

Las células granulosas del ovario (GC) son la mayor fuente de síntesis de estradiol. Inducida por el aumento preovulatorio de hormona luteinizante (LH), las células de la teca y, en particular, de la capa de células de la granulosa profundamente cambian sus características morfológicas, fisiológicas y moleculares y forman el corpus de la producción de progesterona lúteo que se encarga de mantener el embarazo. Modelos de celulares de cultura son herramientas esenciales para el estudio de los mecanismos reguladores subyacentes implicados en la transformación folliculo-lútea. El protocolo presentado se centra en el procedimiento de aislamiento y criopreservación de GC bovina de folículos de tamaño pequeño a mediano (< 6 mm). Con esta técnica, puede obtenerse una población casi pura de GC. El procedimiento de criopreservación facilita enormemente el tiempo de gestión de la cultura de célula de trabajo independiente de una fuente de tejido (ovarios) de primaria directa. Este protocolo describe un modelo de cultura de célula libre de suero que imita el estado activo estradiol de GC bovina. Condiciones importantes que son esenciales para un cultivo exitoso celular activo esteroide se discuten en el protocolo. Está demostrado que aumentar la densidad de placas de las células induce una respuesta específica como lo indica una producción de perfil y de la hormona de expresión de gen alterado. Además, este modelo proporciona una base para futuros estudios sobre diferenciación de GC y otras aplicaciones.

GC plateado 1 x 105 células/pozo pantalla un aspecto fibroblasto-como típico ya que forman una extensión celular comparable a fibroblastos y tienden a crear clústeres (Figura 1a y 1C). Aumento de la densidad de placas por 10 veces a 1 x 106 células/pocillo no cambió la morfología pero más racimos de célula pueden observarse (Figura 1b y 1D, flechas). Como ya se indica en una publicación anterior, la capa de colágeno de los platos de la cultura en gran medida mejora la fijación de las células13.
Criopreservación de inicial no cambió considerablemente las características fisiológicas de las células en cultivo en comparación con los cultivados directamente de muestras recién aisladas. Esto se muestra en la figura 2 como la abundancia de transcripción (medida por qPCR) de marcador varios genes no difirió al comparar células cultivadas derivadas de piscinas ya sea congelados o recién aislados.
La figura 3 muestra resultados representativos de los análisis de hormonas esteroideas (medido por RIA) en GC bovino cultivada en normal y alta densidad. La concentración de estradiol es disminuyó significativamente en la cultura de alta densidad en comparación con la cultura de densidad normal, mientras que la producción de progesterona tiende a ser mayor.
Un análisis comparativo de varios genes (medido por qPCR) en alta vs densidad normal culturas reveló un efecto significativo (figura 4). CYP19A1, codificación de la enzima clave de la biosíntesis de estradiol aromatasa, así como el receptor de gonadotropinas FSHR, fueron significativamente regula. En contraste, los genes RGS2 y VNN2 demostraron una significativa para arriba-regulación. Estos resultados sugieren claramente que induce procesos específicos de la diferenciación celular mediante el aumento de la célula de densidad de la galjanoplastia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Figura 1: cultivo de células de la granulosa bovina en normal (paneles de la izquierda) y alta densidad celular (paneles de la derecha). (y c) las células cultivadas con una densidad de 1 x 105 células/pozo muestran un fenotipo típico de fibroblasto-como. (b y d) GC cultivada en una chapado alta densidad (1 x 106 células/pocillo) tienden a formar racimos de célula grande (flechas) con mayor frecuencia en comparación con las células bajo una densidad normal (panel izquierdo). Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Figura 2: comparación de células cultivadas directamente después de aislamiento y criopreservación de. Las células fueron cultivadas con una densidad de 1 x 105 células por pocillo. La expresión génica de varias transcripciones de marcador se evaluó y no reveló ninguna diferencia entre las células cultivadas con o sin una criopreservación inicial. El boxplot muestra la mediana de n = 3. De Student dos colas t-test, p-los valores están incluidos. Esta figura se reproduce de Baufeld y Vanselow16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Figura 3: concentración de hormonas esteroides en células de la granulosa cultivadas en placas diferentes densidades. La concentración de estradiol (E2) disminuyó significativamente cuando los GC fueron cultivadas en una alta densidad celular, mientras que la concentración de progesterona (P4) sólo tendió a ser mayor. La concentración de la hormona fue corregida para que el contenido de ADN normalizar para un número diferente de células. La media y SEM de n = 3 se muestran. p > 0.05, dos colas estudiante t-pruebas. Esta figura se reproduce de Baufeld et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Figura 4: Abundancia de transcripciones claves funcionales en células de la granulosa cultivadas en una normal frente a una densidad de placas alta. GC bovino cultivada bajo condiciones libre de suero para el 8 d reveló una regulación específica de varios genes del marcador seleccionado. El boxplot muestra la mediana de n = 3 réplicas individuales. p < 0.05, dos colas estudiante t-pruebas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Se describe un modelo de cultura a largo plazo de las células de la granulosa bovina en condiciones libres de suero. Este modelo permite a los investigadores estudiar los efectos de diversos factores y condiciones como placas diferentes densidades en las características de la producción de estrógeno células de la granulosa bovina.

Un modelo de cultivo de tejidos de Granulosa bovino primario producción de estrógeno de las células

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.0K vistas.  Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN). Se describe un modelo de cultura a largo plazo de las células de la granulosa bovina en condiciones libres de suero. Este modelo permite a los investigadores estudiar los efectos de diversos factores y condiciones como placas diferentes densidades en las características de la producción de estrógeno células de la granulosa bovina.

Video: A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Investigación

Biología

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

Cultivo primario de células adrenocorticales rata y análisis de funciones Steroidogenic

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique tissue important for proper function of the synovial joint and is constituted by a dense extracellular matrix (ECM), rich in proteoglycan and type II collagen. Chondrocytes are the only cell type present within cartilage and are widespread and relatively low in number. Altered external stimuli and cellular signalling can lead to changes in ECM composition and deterioration, which are important pathological hallmarks in diseases such as osteoarthritis (OA) and rheumatoid arthritis.
Ex vivo cartilage models allow 1) profiling of chondrocyte mediated alterations of cartilage tissue turnover, 2) visualizing the cartilage ECM composition, and 3) chondrocyte rearrangement directly in the tissue. Profiling these alterations in response to stimuli or treatments are of high importance in various aspects of cartilage biology, and complement in vitro experiments in isolated chondrocytes, or more complex models in live animals where experimental conditions are more difficult to control.
Cartilage explants present a translational and easily accessible method for assessing tissue remodeling in the cartilage ECM in controllable settings. Here, we describe a protocol for isolating and culturing live bovine cartilage explants. The method uses tissue from the bovine knee, which is easily accessible from the local butchery. Both explants and conditioned culture medium can be analyzed to investigate tissue turnover, ECM composition, and chondrocyte function, thus profiling ECM modulation.

Here, we present a protocol describing isolation and culturing of cartilage explants from bovine knees. This method provides an easy and accessible tool to describe tissue changes in response to biological stimuli or novel therapeutics targeting the joint.

Un modelo de cultivo de tejido ex vivo de remodelación del cartílago en explantes de rodilla bovinas

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Colección de tejidos de murciélagos para análisis de émica y cultivo celular primario

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Inducción y detección de apoptosis en un cultivo primario de células intestinales de pepino marino

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Cultivo de tejido de corteza ovárica bovina

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Cultivo primario de células epiteliales pigmentarias de la retina porcina

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...