우리 감사 베로니카 Schreiter 그녀의 우수한 기술 지원과 설립된 cryopreservation 기술과 세포 문화 모델의 도움이 수정. 또한, 우리는 이후 분석에 그들의 우수한 기술 지원에 대 한 마 렌 앤 더 스와 Swanhild Rodewald 감사 드리고.

참고: 소 난소 상업 도살에서 얻은 했다. 도살 장 부산물의 컬렉션은 독일 법 윤리적인 승인이 필요 하지 않습니다.
1. 근무 조건 및 준비
<ol><li>무 균을 보장 하기 위해 모든 미디어를 수행 하 고 조직 준비 뿐만 아니라 모든 문화 층 류 벤치를 사용 하 여 특수 세포 문화 연구소에서 일 합니다.</li>
	<li>버퍼링 하는 인산 염 (PBS, pH 7.4) 100 IU 페니실린, 0.1 mg/mL 스와 난소의 수송을 위한 0.5 µ g / µ L 암포 보충 x 1을 준비 합니다. 참고: 난소를 수신 하 고 GC 분리 사이 최대 기간은이 설정에서 2 h입니다.</li>
</ol>2입니다. 격리 소 Granulosa 셀의
<ol><li>
격리 절차를 시작 하기 전에 모든 혈액은 표면에서 제거 하 난소 (와 100 IU 페니실린, 0.1 mg/mL 스, 0.5 µ g / µ L 암포) 1 x PBS에 여러 번 씻는 다. 비 커를 사용 하 여, 내부 난소, 1 x PBS, 그것을 채워 놓고 다시 PBS를 삭제 합니다.
	<ol>
<li>난소는 모든 나머지 혈액에서 청소 될 때까지 3-4 x,이 세 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가능한 오염 최소화를 70% 알코올로 흠뻑 실험실 지우기를 사용 하 여 하나의 난소를 닦아냅니다.</li>
	<li>3 mL 주사기와 18 G 바늘 중간 소형 낭 puncturing 의해 GC 발음 (< 통치자로 측정 6 m m), 고 한 50 mL 원심 분리기 튜브에 소 낭 모양 액체 풀. 참고: 주사기, 축 축 하 게 (와 100 IU 페니실린, 0.1 mg/mL 스, 0.5 µ g / µ L 암포) 1 x PBS의 작은 금액을 소요. 이 적은 양의 소 낭 모양 액체를 수집 하는 데 도움이 하 고 셀 주사기 안에 집착 하지 않도록 합니다.</li>
	<li>여러 낭 puncturing 후 주사기와 바늘 1 x PBS와 함께 중간 청소 린스.</li>
</ol>3입니다. 셀의 cryopreservation
<ol><li>
Trypan 푸른 얼룩을 사용 하 고는 hemocytometer 아래 셀.
	<ol>
<li>실행 가능한 세포의 수를 계산 하는 0.25 %trypan 블루 솔루션의 1.5 µ L 튜브 준비. 참고: 살아있는 세포 유지 됩니다 흠 없는 trypan 블루 파란색 표시는 죽은 세포의 셀 벽에만 액세스할 수 있기 때문에.</li>
		<li>Trypan 블루 솔루션 granulosa 셀 서 스 펜 션의 15 µ L을 추가 하 고 부드럽게 그들을 믹스.</li>
		<li>hemocytometer의 두 약 실 전부에 있는 혼합물을 놓습니다. 생활의 수를 계산 (예:, 흠 없는) 셀 챔버 당 하나의 큰 광장에. 참고: 일부 혈액 세포를 볼 수 있습니다, 하지만 그들은 구분할 수 있습니다 그들의 매우 작은 크기.</li>
		<li>일반 지침;에 따라 두 챔버의 의미와 살아있는 세포의 수를 계산 살아있는 세포의 비율 난소 사이 다를 수 있습니다 있지만 6013를 초과 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
추가 분석에 대 한 참조로 갓 격리 granulosa 셀 풀에서 샘플을 가져가 라.
	<ol>
<li>격리 된 GC의 세포 수에 따라 정해 적절 한 수의 셀 참조 샘플으로 RNA, DNA, 또는 단백질 준비. 참고: RNA 분리 및 유전자 발현의 후속 평가, 1 x 105 세포는 충분 한, 반면 다른 후속 분석 다른, 일반적으로 더 높은 셀 숫자를 해야 할 수도 있습니다.</li>
		<li>신선한 튜브에 참조 셀의 하나 또는 여러 개의 aliquots를 배치 하 고 실내 온도 셀 펠 렛을 얻기 위해 최대 속도 (12000 x g)에서 1 분 동안 원심. 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>즉시 충격-동결 샘플 액체 질소. -80 ° c.에 샘플 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cryopreservation는 다음과 같이 수행 합니다.
	<ol>
<li>80% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 사용 하 여 냉동 매체를 준비 합니다.</li>
		<li>부드럽게 작은 GC를 위해서는 실내 온도와 500 x g3 분 동안 GC 원심.</li>
		<li>상쾌한을 신중 하 게 제거 하 고 부드럽게 셀 resuspend 덩어리 아니 더 많은 셀까지 100 %FCS (예를 들어, 1 mL)에서 볼 수 있습니다.</li>
		<li>셀 서 스 펜 션에 준비 된 냉동 매체의 1 볼륨 (예:, 1 mL)을 추가 하 고 극저온 유리병에 혼합물을 전송. 참고: 곳을 알아내는 보호 미디어의 최종 농도 90 %FCS 10 %DMSO 있을 것입니다.</li>
		<li>극저온 유리병 급속 동결을 방지 하는 전문된 (상용) 냉동 컨테이너에 배치 합니다. 샘플의 냉각 속도-1 ° C/분 이상 4 h-80 ° C 냉동 고로 전송 냉동 컨테이너를 넘지 말아야 한다.</li>
		<li>긴 저장을 위해 (예를 들면, 액체 단계 질소 용기) 초 저온 용기에 극저온 튜브를 놓습니다. 참고: 프로토콜 수 있습니다 중지 여기는 cryopreservation 긴 저장 허용.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 세포 배양에 대 한 미디어와 문화 접시의 준비
<ol><li>
0.02% 콜라겐 R. 코트 세포 배양 배지 참고: 콜라겐 R 문화에서 GC의 향상 된 첨부 파일에 대 한 필수적인 것으로 알려져 있다.<ol>
<li>순화 된 물 세포 배양에 적합 한 0.02% 콜라겐 R 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>24-잘 접시에 잘 당 150 µ L를 추가 (= 2 cm2/잘) 그 문화권의 전체 표면 잘 덮여 콜라겐 R 솔루션을 확인 하십시오.</li>
		<li>뚜껑을 열고 몇 시간 동안 건조 또는 층 류 두건에 하룻밤 솔루션을 보자.</li>
		<li>배양 배지는 완전히 건조, 오염을 최소화 하기 위해 10-15 분 동안 UV 빛 들을 비추는.</li>
		<li>필요한 경우 최대 2 개월까지 4 ° C에서 접시를 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미디어와 문화 일 층 흐름 후드에 대 한 보충을 준비 합니다. GC의 성공적인 복구, 그들은 녹고 후 즉시 처리 해야 합니다.</li>
	<li>
다음 미디어를 준비 합니다.
	<ol>
<li>Α-최소한의 필수 매체 (α-MEM)와 2 mM L-글루타민, 0.084% 나트륨 중 탄산염, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL 나트륨 selenite, 5 µ g/mL 올려진다, 10 ng/mL 인슐린 1 m m 비 본질적인 아미노산을 보충 한다.</li>
		<li>또한, 미디어 100 IU 페니실린과 0.1 mg/mL 스를 추가 합니다. 참고: 일단 예 열, 항생제 약 48 h에 대 한 안정적입니다. 따라서, aliquot 문화권 설정에 대 한 미디어 및 계획 된 미디어의 원하는 금액 교환 합니다. 미리 따뜻한 물 욕조에 37 ° C에 미디어 aliquots만. 4 ° C에서 3 개월 이상 준비 된 미디어를 저장할 수 없습니다.</li>
		<li>교양된 소 GC에서 스테로이드 활동을 유도 하는 α-MEM 20 ng/mL 뿌리-자극 호르몬 (FSH)과 또한, 50 ng/mL R3 IGF-1, 그리고 2 µ M androstenedione 보충. 참고: 항상 이러한 구성 요소는 문화 또는 미디어 교환의 발병 직전 보충. 이 스테로이드 활동을 손상 시킬 수도 있는 FSH 및 IGF-1 재고 솔루션에 대 한 반복된 및 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 세포 문화 작업
<ol><li>3-4 분 동안 37 ° C에 물 목욕에 신속 하 게 세포를 해 동 하 고 37 ° C (호르몬 보충) 없이 미리 따뜻하게 α-MEM에 세포 현 탁 액을 전송. 원심 분리, 10 mL의 최종 볼륨을 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>500 x g와 실내 온도에 3 분 동안 GC 원심 폐기는 상쾌한. 미리 예 열 하 고 보충 α-MEM을 추가 하 고 셀을 신중 하 게 resuspend.</li>
	<li>500 µ L. 마지막 볼륨에서 1 x 105 또는 잘 당 1 x 106 세포의 조밀도에 씨 GC 조건 당 적어도 3 개의 문화 우물의 기술 복제를 포함합니다.</li>
	<li>8 d 5% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에서 세포 배양 품 어.</li>
	<li>미디어 교환 매일 수행 합니다. 스트레스를 줄이기 위해 고 신선한 미디어 셀의 적응을 쉽게 하기 위해 문화 미디어의 2/3만을 교체 합니다. 참고: GC 문화에 몇 일 후에 전형적인 구와 같은 표현 형을 형성 하 고 함께 클러스터 해 경향이 있다. 높은 세포 조밀도 문화에 더 큰 클러스터는 일반 밀도 GC 문화 (그림 1, 왼쪽 대 오른쪽 패널)에 비해 더 자주 발견 된다.</li>
</ol>6. 이후 분석 교양된 Granulosa 셀의
<ol><li>스테로이드 호르몬 분석을 수행 하려면 미디어를 수집 하 고-20 ° c.에 그것을 동결합니다 적절 한 메서드를 사용 하 여 보낸된 미디어 [예: 방사 면역 검정 법 (RIA)]14에 estradiol과 progesterone 농도 분석.</li>
	<li>다른 대상 분자 (RNA, DNA, 단백질, 등)의 후속 분석을 위해 공급 업체에서 권장 하는 대로 적절 한 lysing 에이전트와 문화 접시에 직접 세포를 lyse. 참고: 대부분의 격리 절차에 대 한 이건 여기, 프로토콜을 막을 수로 lysed 세포-20 ° C에서 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다. 긴 저장을 위해 셀-80 ° c.에 유지 되어야 한다</li>
	<li>사본을 풍부를 확인 하려면 cDNA를 합성 하 고 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 기법15특정 성적을 측정 한다. 통계 평가 다른 세포 준비 (생물 복제)에서 유래 하는 다른 세포 배양의 적어도 3 개의 복제를 포함 해야 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. 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저자는 공개 없다.

제시 셀 문화 모델 granulosa 셀 차별화 시험관을 분석 하는 도구를 제공 합니다. 여러 연구 결과 혈 청 무료 재배 경작된 소 GC 또는 다른 종8,9의 GC에서 스테로이드 활동을 유지 하기 위해 필수 보여주었다. 또한 기질 (예를 들어, 콜라겐 R)13의 구성 요소와 문화 접시 코팅, 크게 향상의 셀 첨부 파일. 또 다른 중요 한 기능은 장기 문화 기간입니다. 최근에, 그것은 장기 문화는 충분 한 steroidogenic 활동과 granulosa 셀 정체성 마커17의 균형된 식을 얻기 위해 필요한 증명 되었습니다. 그것은 GC 물리적 스트레스 로부터 격리 절차 동안 복구 시간을 필요로 나타납니다.
FSH, IGF-1, androstenedione 알려져 있습니다에서 aromatase 활동을 유도 하기 위해 미디어 보충 교양 GC. 특히, androstenedione와 보완은 절대적으로 필요한, GC로 필요 전조 estradiol 합성 합니다. 이것은 계속 이전11,18 에 게시 하 고, 따라서 하지 추가 조사는 현재 연구 중. 그러나, FSH, IGF-1, 그리고 androstenedione 농도의 적응은 다른 실험 설정에 대 한 필요할 수 있습니다.
여기에 설명 된 cryopreservation 기술을 더 난소와 다양 한 공급에서 독립 함으로써 조직 배양 실험 기구를 개선 하기 위해 도울 수 있다. 이전 테스트에 따르면 cryopreservation GC 형 또는 스테로이드 생산 문화에 미치지 않는다. 또한, 경작된 한 세포에 표식 증명서의 풍부는 이전 cryopreservation16에 들어서는 그 갓 고립 된 세포에서 준비 하는 샘플을 비교 하는 중요 한 차이점이 공개 하지 않았다.
현재 GC 문화 모델에 대 한 중요 한 매개 변수는 밀도 도금 하는 셀입니다. 대표 결과같이 생리 및 분자 특성의 놀라운 변화를 유도 도금 밀도 증가. 몇몇 유전자는 LH 자극 vivo에서4,19에 의해 유도 되는 변화를 닮은 특정 방식으로 통제 된다. 한 증가 셀 밀도 교양된 소 GC 차별화와 같은 프로세스를 구동할 수 있다 사실 꼼꼼하게 복제 사이 충돌 하는 결과 피하기 위해이 GC 모델 체 외에 간주 있다. 따라서, 다른 연구 결과와 모순 된 결과 다른 셀 밀도를 관찰 수 있습니다 그리고 더 면밀 하 게 조사 해야 합니다.
설명 된 문화 모델 LH에 응답 하지 않는 것을 여기 공개 LHCGR 수용 체의 성적으로는 검출 한계. 따라서, 모두 LH 서 지의 시뮬레이션 vivo에서 상황 차별화13유도를 하지 못했습니다. 그럼에도 불구 하 고, estradiol-액티브 GC 주 문화에서를 공부 하는 유용한 도구를 제공 하는이 모델, 현재 존재 하는 특히 더로 기능 소 GC 라인.
스테로이드 생산 또는 GC 차별화의 규제 메커니즘을 해명 하는 데 도움이 현재 GC 문화 모델에서 다른 치료 프로토콜을 테스트할 수 있습니다. 개발 프로세스에 관련 된 추가, 단일 요소를 개별적으로 분석할 수 있습니다. 따라서,이 문화 모델은 많은 다른 응용 프로그램에 대 한 기반을 제공합니다.

성공적인 배 란과 luteinization 정밀 하 게 조정 하 고 잘 조율 된 분자 변경 다른 체세포 follicular 셀 형식에 따라 달라 집니다. 이러한 개발 프로세스의 세부 정보는 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 때문에, 더 정화가 필요 합니다. Vivo에서 접근 정교 하 고 비용이 많이 드는 이며, 특히 folliculogenesis 동안 발생 하는 주소 특정 분자 메커니즘을 실패 합니다. 따라서, reductionistic 생체 외에서 모델 필요 또한, 세포질이 고 분자 세부 사항에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 다른 연구는 체 외 수정 기술1,2, 에서 3의 맥락에서 전체 낭의 문화를 설명합니다. 연구원은 차별화의 메커니즘에 관심이 있기 때문에, 많은 연구 follicular GC에 초점. 직접 oocyte와 관련 된 이러한 셀 스 트로 겐 생산의 주요 소스 이며, 따라서, folliculogenesis 및 luteinization4에 걸쳐 필수적인 역할.
셀 라인 GC의 다른 종에서 개발 되었습니다 불후 그러나 그들의 대부분은, 충분 한 스테로이드 호르몬 생산5표시 되지 않습니다. 지금까지, 하나의 셀 라인 GC 되었습니다 소의 설립6, 그러나이 선 여러 구절7후 steroidogenic 활동을 잃었다. 따라서,부터 steroidogenesis 그리고, 특히에서, estradiol 생산 GC 기능의 필수적인 기능입니다, 그리고 그것은 이러한 측면에서 1 차 셀 문화 모델을 공부 하는 것이 좋습니다. 이전 학문에서는, 그것은 상당한 estradiol 생산 세럼 무료 문화 조건8,9아래만 관찰 될 수 있는 시연 했다. 더욱, estradiol 종합의 선구자의 보충은 또 다른 필수 구성 요소, GC androstenedione10프로 변환할 수 있습니다 필요한 효소를 표현 하지 못하는. 또한, FSH 및 IGF-1 보충에서 체 외에서 의 시너지 효과 estradiol 합성11의 주요 효소 aromatase의 최적화 된 활동을 밝혔다. 현재 프로토콜에서 GC 문화 모델에 상당한 영향을 미칠 다른 중요 한 요인은 또한 설명 합니다. 특히, 셀 밀도 도금 실험12의 결과에 엄청난 영향을 있다. 또한, GC 생리학 문화에 크게 방해 하지 않는 소 GC의 cryopreservation 기술 수립 될 수 있습니다. 이 기술은 세포 문화 작품의 조직 개선 하 고 선호 도금 밀도 최적화 하기 위해 도움이 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 182-05</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin (250 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2612</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe (Omnifix Luer)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>Roth</td>
			<td>C724.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-preservation vials (2 ml)</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 89020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX cell freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture dish, 24-well, flat bottom</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen R (0.2 %)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>F 0915</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin (200 mM)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1713</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1603</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin (10 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516</td>
			<td>dissolved in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEA</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0293</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4021</td>
			<td>we prefer to use a stock solution of 2 &#181;g/ml, diluted in 0.9 % NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR3-IGF-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1146</td>
			<td>we use a stock solution of 2 &#181;g/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>androstenedione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46033</td>
			<td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

난소 granulosa 셀 (GC)는 estradiol 합성의 주요 소스입니다. Preovulatory 황 호르몬 (LH) 서 지에 의해 유도 된 세포는 티크의 및, 특히, granulosa 셀 계층의 뿌리깊은 그들의 형태, 생리, 및 분자 특성 변경 및 황 체 호르몬 생성 신체를 형성 임신을 유지 하기 위한 책임이 있다는 luteum 셀 문화 모델 folliculo-luteal 변환에 관련 된 기본 규제 메커니즘 연구 필수 도구입니다. 제시 프로토콜 격리 절차 및 중간 소형 낭 (< 6 m m)에서 소 GC의 cryopreservation에 집중 한다. 이 기술로, GC의 거의 순수한 인구를 얻을 수 있습니다. Cryopreservation 절차는 크게 시간 세포 배양의 관리는 직접 기본 조직 (난소) 공급의 독립적인 작동을 지원 합니다. 이 프로토콜에서는 소 GC의 estradiol 액티브 상태를 모방 하는 혈 청 무료 셀 문화 모델을 설명 합니다. 성공적인 스테로이드 활성 세포 배양에 필수적인 중요 한 조건은 프로토콜에 걸쳐 설명 되어 있습니다. 그것은 그 세포의 도금 밀도 증가 유도 특정 응답 변경된 진 식 프로필과 호르몬 생산에 의해 표시 된 대로 설명 했다. 또한,이 모델은 GC 차별화에 대 한 추가 연구를 위한 기초 및 다른 응용 프로그램을 제공합니다.

GC 도금 1 x 105 셀/잘 표시 전형적인 구와 같은 모습으로 그들은 섬유 아 세포에 비해 세포 확장을 형성 (그림 1a 및 1c) 클러스터를 구축 하는 경향이 있다. 의해 도금 밀도 10 배 증가 1 x 106 셀/잘 형태를 변경 하지 않은 하지만 더 많은 셀 클러스터 (그림 1b 및 1 d, 화살표) 관찰 될 수 있다. 같이 이미 이전 게시, 문화 요리 콜라겐 코팅은 크게 셀13의 첨부 파일 개선.
초기 cryopreservation 갓 격리 된 샘플에서 직접 경작 하는 그에 비해 문화에 세포의 생리 적 특성을 상당히 변화 하지는 않았다. 이 때 냉동 또는 신선한 고립 된 수영장에서 파생 된 배양된 세포를 비교 유전자 차이가 없 여러 마커의 사본 풍부 (정량 측정)로 그림 2 에 표시 됩니다.
그림 3 정상 대 높은 밀도에서 교양 소 GC에서 스테로이드 호르몬 분석 (RIA로 측정)의 대표적인 결과 보여준다. Estradiol 농도 호르몬 생산 경향이 높은 반면 정상 밀도 문화에 비해 고밀도 문화에 크게 감소 됩니다.
높은- 대 정상 밀도 문화에서 (정량에 의해 측정 되는) 몇몇 유전자의 비교 분석 (그림 4) 상당한 효과를 밝혔다. CYP19A1, estradiol 생 합성 aromatase FSHR, 생식 샘 자극 호르몬 수용 체의 주요 효소를 인코딩 했다 크게 다운-규제. 대조적으로, RGS2 및 VNN2 유전자는 상당한 업 레 귤 레이 션 보였다. 이러한 결과 명확 하 게 밀도 도금 하는 세포를 증가 시켜 세포 분화의 특정 프로세스 유도 된다 건의 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> 그림 1: 정상 (왼쪽된 패널)과 높은 세포 밀도 (오른쪽 패널)에서 소 granulosa 셀 교양. 1 x 105 셀/잘의 밀도에서 경작 하는(및 c) 셀 표시 전형적인 구와 같은 표현 형. (b 와 d) 정상적인 밀도 (왼쪽된 패널)에서 세포에 비해 더 자주 큰 셀 클러스터 (화살표)를 형성 하는 경향이 높은 도금 밀도 (1 x 106 셀/잘)에서 경작 하는 GC 바 규모 = 100 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> 그림 2: cryopreservation 그리고 격리 후 직접 경작 하는 세포의 비교. 셀 잘 당 1 x 105 세포의 밀도에 교양 있었다. 몇 가지 마커 성적 유전자 발현 평가 되었다 고 배양된 세포 또는 초기 cryopreservation 없이 차이 밝혀. boxplot 보여줍니다 n 의 중앙값 = 3. 양측 스튜던트 t-테스트, p-값이 포함 되어 있습니다. 이 그림은 Baufeld 및 Vanselow16에서 재생 된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> 그림 3: 스테로이드 호르몬 농도 granulosa 셀 다른 도금 밀도에서 경작에. Estradiol (e 2) 농도 감소 크게 GC 높은 세포 조밀도에 교양 있었다 때 황 체 호르몬 (P4) 농도 경향이 높은 반면. 호르몬 농도 DNA 콘텐츠를 다른 핸드폰 번호에 대 한 표준화에 대 한 수정 되었습니다. 평균 및 SEM을 n = 3이 표시 됩니다. p > 0.05, 양측 스튜던트 t-테스트. 이 그림은 Baufeld 그 외 여러분 에서 재현 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> 그림 4: granulosa 셀에 기능 키 성적표의 풍부한 경작는 정상적인 대 에서 높은 도금 밀도. 8 d에 대 한 혈 청 자유로운 조건에서 배양 소 GC 몇몇 선택 된 마커 유전자의 특정 규정을 밝혔다. boxplot 표시 n 의 중앙값 = 3 개별 복제. p < 0.05, 양측 스튜던트 t-테스트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

혈 청 무료 조건에서 소 granulosa 셀의 장기적인 문화 모델을 설명 합니다. 이 모델에서는 다른 도금 밀도에 스 트로 겐 생산의 특성으로 다양 한 요인의 효과 연구 하는 연구원 소 granulosa 셀.

기본 소 Granulosa 에스트로겐 생산의 조직 문화 모델 세포

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

a-tissue-culture-model-estrogen-producing-primary-bovine-granulosa

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

9.0K 조회수.  Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN). 혈 청 무료 조건에서 소 granulosa 셀의 장기적인 문화 모델을 설명 합니다. 이 모델에서는 다른 도금 밀도에 스 트로 겐 생산의 특성으로 다양 한 요인의 효과 연구 하는 연구원 소 granulosa 셀.

비디오: A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

쥐 Adrenocortical 셀 및 Steroidogenic 기능의 분석 실험의 기본 문화

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique tissue important for proper function of the synovial joint and is constituted by a dense extracellular matrix (ECM), rich in proteoglycan and type II collagen. Chondrocytes are the only cell type present within cartilage and are widespread and relatively low in number. Altered external stimuli and cellular signalling can lead to changes in ECM composition and deterioration, which are important pathological hallmarks in diseases such as osteoarthritis (OA) and rheumatoid arthritis.
Ex vivo cartilage models allow 1) profiling of chondrocyte mediated alterations of cartilage tissue turnover, 2) visualizing the cartilage ECM composition, and 3) chondrocyte rearrangement directly in the tissue. Profiling these alterations in response to stimuli or treatments are of high importance in various aspects of cartilage biology, and complement in vitro experiments in isolated chondrocytes, or more complex models in live animals where experimental conditions are more difficult to control.
Cartilage explants present a translational and easily accessible method for assessing tissue remodeling in the cartilage ECM in controllable settings. Here, we describe a protocol for isolating and culturing live bovine cartilage explants. The method uses tissue from the bovine knee, which is easily accessible from the local butchery. Both explants and conditioned culture medium can be analyzed to investigate tissue turnover, ECM composition, and chondrocyte function, thus profiling ECM modulation.

Here, we present a protocol describing isolation and culturing of cartilage explants from bovine knees. This method provides an easy and accessible tool to describe tissue changes in response to biological stimuli or novel therapeutics targeting the joint.

소 무릎 이식에서 연골 리모델링의 전 생체 외 조직 문화 모델

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

-Omics 분석 및 1 차 적인 세포 배양을 위한 박쥐의 조직 수집

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

해삼 장 세포의 1 차적인 배양에 있는 세포자멸 유도 그리고 탐지

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

소 난소 피질 조직 배양

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...