우리 감사 베로니카 Schreiter 그녀의 우수한 기술 지원과 설립된 cryopreservation 기술과 세포 문화 모델의 도움이 수정. 또한, 우리는 이후 분석에 그들의 우수한 기술 지원에 대 한 마 렌 앤 더 스와 Swanhild Rodewald 감사 드리고.

참고: 소 난소 상업 도살에서 얻은 했다. 도살 장 부산물의 컬렉션은 독일 법 윤리적인 승인이 필요 하지 않습니다.
1. 근무 조건 및 준비
<ol><li>무 균을 보장 하기 위해 모든 미디어를 수행 하 고 조직 준비 뿐만 아니라 모든 문화 층 류 벤치를 사용 하 여 특수 세포 문화 연구소에서 일 합니다.</li>
	<li>버퍼링 하는 인산 염 (PBS, pH 7.4) 100 IU 페니실린, 0.1 mg/mL 스와 난소의 수송을 위한 0.5 µ g / µ L 암포 보충 x 1을 준비 합니다. 참고: 난소를 수신 하 고 GC 분리 사이 최대 기간은이 설정에서 2 h입니다.</li>
</ol>2입니다. 격리 소 Granulosa 셀의
<ol><li>
격리 절차를 시작 하기 전에 모든 혈액은 표면에서 제거 하 난소 (와 100 IU 페니실린, 0.1 mg/mL 스, 0.5 µ g / µ L 암포) 1 x PBS에 여러 번 씻는 다. 비 커를 사용 하 여, 내부 난소, 1 x PBS, 그것을 채워 놓고 다시 PBS를 삭제 합니다.
	<ol>
<li>난소는 모든 나머지 혈액에서 청소 될 때까지 3-4 x,이 세 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가능한 오염 최소화를 70% 알코올로 흠뻑 실험실 지우기를 사용 하 여 하나의 난소를 닦아냅니다.</li>
	<li>3 mL 주사기와 18 G 바늘 중간 소형 낭 puncturing 의해 GC 발음 (< 통치자로 측정 6 m m), 고 한 50 mL 원심 분리기 튜브에 소 낭 모양 액체 풀. 참고: 주사기, 축 축 하 게 (와 100 IU 페니실린, 0.1 mg/mL 스, 0.5 µ g / µ L 암포) 1 x PBS의 작은 금액을 소요. 이 적은 양의 소 낭 모양 액체를 수집 하는 데 도움이 하 고 셀 주사기 안에 집착 하지 않도록 합니다.</li>
	<li>여러 낭 puncturing 후 주사기와 바늘 1 x PBS와 함께 중간 청소 린스.</li>
</ol>3입니다. 셀의 cryopreservation
<ol><li>
Trypan 푸른 얼룩을 사용 하 고는 hemocytometer 아래 셀.
	<ol>
<li>실행 가능한 세포의 수를 계산 하는 0.25 %trypan 블루 솔루션의 1.5 µ L 튜브 준비. 참고: 살아있는 세포 유지 됩니다 흠 없는 trypan 블루 파란색 표시는 죽은 세포의 셀 벽에만 액세스할 수 있기 때문에.</li>
		<li>Trypan 블루 솔루션 granulosa 셀 서 스 펜 션의 15 µ L을 추가 하 고 부드럽게 그들을 믹스.</li>
		<li>hemocytometer의 두 약 실 전부에 있는 혼합물을 놓습니다. 생활의 수를 계산 (예:, 흠 없는) 셀 챔버 당 하나의 큰 광장에. 참고: 일부 혈액 세포를 볼 수 있습니다, 하지만 그들은 구분할 수 있습니다 그들의 매우 작은 크기.</li>
		<li>일반 지침;에 따라 두 챔버의 의미와 살아있는 세포의 수를 계산 살아있는 세포의 비율 난소 사이 다를 수 있습니다 있지만 6013를 초과 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
추가 분석에 대 한 참조로 갓 격리 granulosa 셀 풀에서 샘플을 가져가 라.
	<ol>
<li>격리 된 GC의 세포 수에 따라 정해 적절 한 수의 셀 참조 샘플으로 RNA, DNA, 또는 단백질 준비. 참고: RNA 분리 및 유전자 발현의 후속 평가, 1 x 105 세포는 충분 한, 반면 다른 후속 분석 다른, 일반적으로 더 높은 셀 숫자를 해야 할 수도 있습니다.</li>
		<li>신선한 튜브에 참조 셀의 하나 또는 여러 개의 aliquots를 배치 하 고 실내 온도 셀 펠 렛을 얻기 위해 최대 속도 (12000 x g)에서 1 분 동안 원심. 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>즉시 충격-동결 샘플 액체 질소. -80 ° c.에 샘플 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cryopreservation는 다음과 같이 수행 합니다.
	<ol>
<li>80% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 사용 하 여 냉동 매체를 준비 합니다.</li>
		<li>부드럽게 작은 GC를 위해서는 실내 온도와 500 x g3 분 동안 GC 원심.</li>
		<li>상쾌한을 신중 하 게 제거 하 고 부드럽게 셀 resuspend 덩어리 아니 더 많은 셀까지 100 %FCS (예를 들어, 1 mL)에서 볼 수 있습니다.</li>
		<li>셀 서 스 펜 션에 준비 된 냉동 매체의 1 볼륨 (예:, 1 mL)을 추가 하 고 극저온 유리병에 혼합물을 전송. 참고: 곳을 알아내는 보호 미디어의 최종 농도 90 %FCS 10 %DMSO 있을 것입니다.</li>
		<li>극저온 유리병 급속 동결을 방지 하는 전문된 (상용) 냉동 컨테이너에 배치 합니다. 샘플의 냉각 속도-1 ° C/분 이상 4 h-80 ° C 냉동 고로 전송 냉동 컨테이너를 넘지 말아야 한다.</li>
		<li>긴 저장을 위해 (예를 들면, 액체 단계 질소 용기) 초 저온 용기에 극저온 튜브를 놓습니다. 참고: 프로토콜 수 있습니다 중지 여기는 cryopreservation 긴 저장 허용.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 세포 배양에 대 한 미디어와 문화 접시의 준비
<ol><li>
0.02% 콜라겐 R. 코트 세포 배양 배지 참고: 콜라겐 R 문화에서 GC의 향상 된 첨부 파일에 대 한 필수적인 것으로 알려져 있다.<ol>
<li>순화 된 물 세포 배양에 적합 한 0.02% 콜라겐 R 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>24-잘 접시에 잘 당 150 µ L를 추가 (= 2 cm2/잘) 그 문화권의 전체 표면 잘 덮여 콜라겐 R 솔루션을 확인 하십시오.</li>
		<li>뚜껑을 열고 몇 시간 동안 건조 또는 층 류 두건에 하룻밤 솔루션을 보자.</li>
		<li>배양 배지는 완전히 건조, 오염을 최소화 하기 위해 10-15 분 동안 UV 빛 들을 비추는.</li>
		<li>필요한 경우 최대 2 개월까지 4 ° C에서 접시를 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미디어와 문화 일 층 흐름 후드에 대 한 보충을 준비 합니다. GC의 성공적인 복구, 그들은 녹고 후 즉시 처리 해야 합니다.</li>
	<li>
다음 미디어를 준비 합니다.
	<ol>
<li>Α-최소한의 필수 매체 (α-MEM)와 2 mM L-글루타민, 0.084% 나트륨 중 탄산염, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL 나트륨 selenite, 5 µ g/mL 올려진다, 10 ng/mL 인슐린 1 m m 비 본질적인 아미노산을 보충 한다.</li>
		<li>또한, 미디어 100 IU 페니실린과 0.1 mg/mL 스를 추가 합니다. 참고: 일단 예 열, 항생제 약 48 h에 대 한 안정적입니다. 따라서, aliquot 문화권 설정에 대 한 미디어 및 계획 된 미디어의 원하는 금액 교환 합니다. 미리 따뜻한 물 욕조에 37 ° C에 미디어 aliquots만. 4 ° C에서 3 개월 이상 준비 된 미디어를 저장할 수 없습니다.</li>
		<li>교양된 소 GC에서 스테로이드 활동을 유도 하는 α-MEM 20 ng/mL 뿌리-자극 호르몬 (FSH)과 또한, 50 ng/mL R3 IGF-1, 그리고 2 µ M androstenedione 보충. 참고: 항상 이러한 구성 요소는 문화 또는 미디어 교환의 발병 직전 보충. 이 스테로이드 활동을 손상 시킬 수도 있는 FSH 및 IGF-1 재고 솔루션에 대 한 반복된 및 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 세포 문화 작업
<ol><li>3-4 분 동안 37 ° C에 물 목욕에 신속 하 게 세포를 해 동 하 고 37 ° C (호르몬 보충) 없이 미리 따뜻하게 α-MEM에 세포 현 탁 액을 전송. 원심 분리, 10 mL의 최종 볼륨을 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>500 x g와 실내 온도에 3 분 동안 GC 원심 폐기는 상쾌한. 미리 예 열 하 고 보충 α-MEM을 추가 하 고 셀을 신중 하 게 resuspend.</li>
	<li>500 µ L. 마지막 볼륨에서 1 x 105 또는 잘 당 1 x 106 세포의 조밀도에 씨 GC 조건 당 적어도 3 개의 문화 우물의 기술 복제를 포함합니다.</li>
	<li>8 d 5% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에서 세포 배양 품 어.</li>
	<li>미디어 교환 매일 수행 합니다. 스트레스를 줄이기 위해 고 신선한 미디어 셀의 적응을 쉽게 하기 위해 문화 미디어의 2/3만을 교체 합니다. 참고: GC 문화에 몇 일 후에 전형적인 구와 같은 표현 형을 형성 하 고 함께 클러스터 해 경향이 있다. 높은 세포 조밀도 문화에 더 큰 클러스터는 일반 밀도 GC 문화 (그림 1, 왼쪽 대 오른쪽 패널)에 비해 더 자주 발견 된다.</li>
</ol>6. 이후 분석 교양된 Granulosa 셀의
<ol><li>스테로이드 호르몬 분석을 수행 하려면 미디어를 수집 하 고-20 ° c.에 그것을 동결합니다 적절 한 메서드를 사용 하 여 보낸된 미디어 [예: 방사 면역 검정 법 (RIA)]14에 estradiol과 progesterone 농도 분석.</li>
	<li>다른 대상 분자 (RNA, DNA, 단백질, 등)의 후속 분석을 위해 공급 업체에서 권장 하는 대로 적절 한 lysing 에이전트와 문화 접시에 직접 세포를 lyse. 참고: 대부분의 격리 절차에 대 한 이건 여기, 프로토콜을 막을 수로 lysed 세포-20 ° C에서 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다. 긴 저장을 위해 셀-80 ° c.에 유지 되어야 한다</li>
	<li>사본을 풍부를 확인 하려면 cDNA를 합성 하 고 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 기법15특정 성적을 측정 한다. 통계 평가 다른 세포 준비 (생물 복제)에서 유래 하는 다른 세포 배양의 적어도 3 개의 복제를 포함 해야 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. 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저자는 공개 없다.

제시 셀 문화 모델 granulosa 셀 차별화 시험관을 분석 하는 도구를 제공 합니다. 여러 연구 결과 혈 청 무료 재배 경작된 소 GC 또는 다른 종8,9의 GC에서 스테로이드 활동을 유지 하기 위해 필수 보여주었다. 또한 기질 (예를 들어, 콜라겐 R)13의 구성 요소와 문화 접시 코팅, 크게 향상의 셀 첨부 파일. 또 다른 중요 한 기능은 장기 문화 기간입니다. 최근에, 그것은 장기 문화는 충분 한 steroidogenic 활동과 granulosa 셀 정체성 마커17의 균형된 식을 얻기 위해 필요한 증명 되었습니다. 그것은 GC 물리적 스트레스 로부터 격리 절차 동안 복구 시간을 필요로 나타납니다.
FSH, IGF-1, androstenedione 알려져 있습니다에서 aromatase 활동을 유도 하기 위해 미디어 보충 교양 GC. 특히, androstenedione와 보완은 절대적으로 필요한, GC로 필요 전조 estradiol 합성 합니다. 이것은 계속 이전11,18 에 게시 하 고, 따라서 하지 추가 조사는 현재 연구 중. 그러나, FSH, IGF-1, 그리고 androstenedione 농도의 적응은 다른 실험 설정에 대 한 필요할 수 있습니다.
여기에 설명 된 cryopreservation 기술을 더 난소와 다양 한 공급에서 독립 함으로써 조직 배양 실험 기구를 개선 하기 위해 도울 수 있다. 이전 테스트에 따르면 cryopreservation GC 형 또는 스테로이드 생산 문화에 미치지 않는다. 또한, 경작된 한 세포에 표식 증명서의 풍부는 이전 cryopreservation16에 들어서는 그 갓 고립 된 세포에서 준비 하는 샘플을 비교 하는 중요 한 차이점이 공개 하지 않았다.
현재 GC 문화 모델에 대 한 중요 한 매개 변수는 밀도 도금 하는 셀입니다. 대표 결과같이 생리 및 분자 특성의 놀라운 변화를 유도 도금 밀도 증가. 몇몇 유전자는 LH 자극 vivo에서4,19에 의해 유도 되는 변화를 닮은 특정 방식으로 통제 된다. 한 증가 셀 밀도 교양된 소 GC 차별화와 같은 프로세스를 구동할 수 있다 사실 꼼꼼하게 복제 사이 충돌 하는 결과 피하기 위해이 GC 모델 체 외에 간주 있다. 따라서, 다른 연구 결과와 모순 된 결과 다른 셀 밀도를 관찰 수 있습니다 그리고 더 면밀 하 게 조사 해야 합니다.
설명 된 문화 모델 LH에 응답 하지 않는 것을 여기 공개 LHCGR 수용 체의 성적으로는 검출 한계. 따라서, 모두 LH 서 지의 시뮬레이션 vivo에서 상황 차별화13유도를 하지 못했습니다. 그럼에도 불구 하 고, estradiol-액티브 GC 주 문화에서를 공부 하는 유용한 도구를 제공 하는이 모델, 현재 존재 하는 특히 더로 기능 소 GC 라인.
스테로이드 생산 또는 GC 차별화의 규제 메커니즘을 해명 하는 데 도움이 현재 GC 문화 모델에서 다른 치료 프로토콜을 테스트할 수 있습니다. 개발 프로세스에 관련 된 추가, 단일 요소를 개별적으로 분석할 수 있습니다. 따라서,이 문화 모델은 많은 다른 응용 프로그램에 대 한 기반을 제공합니다.

성공적인 배 란과 luteinization 정밀 하 게 조정 하 고 잘 조율 된 분자 변경 다른 체세포 follicular 셀 형식에 따라 달라 집니다. 이러한 개발 프로세스의 세부 정보는 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 때문에, 더 정화가 필요 합니다. Vivo에서 접근 정교 하 고 비용이 많이 드는 이며, 특히 folliculogenesis 동안 발생 하는 주소 특정 분자 메커니즘을 실패 합니다. 따라서, reductionistic 생체 외에서 모델 필요 또한, 세포질이 고 분자 세부 사항에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 다른 연구는 체 외 수정 기술1,2, 에서 3의 맥락에서 전체 낭의 문화를 설명합니다. 연구원은 차별화의 메커니즘에 관심이 있기 때문에, 많은 연구 follicular GC에 초점. 직접 oocyte와 관련 된 이러한 셀 스 트로 겐 생산의 주요 소스 이며, 따라서, folliculogenesis 및 luteinization4에 걸쳐 필수적인 역할.
셀 라인 GC의 다른 종에서 개발 되었습니다 불후 그러나 그들의 대부분은, 충분 한 스테로이드 호르몬 생산5표시 되지 않습니다. 지금까지, 하나의 셀 라인 GC 되었습니다 소의 설립6, 그러나이 선 여러 구절7후 steroidogenic 활동을 잃었다. 따라서,부터 steroidogenesis 그리고, 특히에서, estradiol 생산 GC 기능의 필수적인 기능입니다, 그리고 그것은 이러한 측면에서 1 차 셀 문화 모델을 공부 하는 것이 좋습니다. 이전 학문에서는, 그것은 상당한 estradiol 생산 세럼 무료 문화 조건8,9아래만 관찰 될 수 있는 시연 했다. 더욱, estradiol 종합의 선구자의 보충은 또 다른 필수 구성 요소, GC androstenedione10프로 변환할 수 있습니다 필요한 효소를 표현 하지 못하는. 또한, FSH 및 IGF-1 보충에서 체 외에서 의 시너지 효과 estradiol 합성11의 주요 효소 aromatase의 최적화 된 활동을 밝혔다. 현재 프로토콜에서 GC 문화 모델에 상당한 영향을 미칠 다른 중요 한 요인은 또한 설명 합니다. 특히, 셀 밀도 도금 실험12의 결과에 엄청난 영향을 있다. 또한, GC 생리학 문화에 크게 방해 하지 않는 소 GC의 cryopreservation 기술 수립 될 수 있습니다. 이 기술은 세포 문화 작품의 조직 개선 하 고 선호 도금 밀도 최적화 하기 위해 도움이 됩니다.

<table><tbody><tr><td>PBS Instamed w/o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 182-05</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &amp;micro;g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2213</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>amphotericin (250 &amp;micro;g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2612</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>3 mL syringe (Omnifix Luer)</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>18 G needle</td><td>Roth</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Merck-Millipore</td><td>S 0115</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>cryo-preservation vials (2 mL)</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 89020</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX cell freezing container</td><td>Corning</td><td>432004</td><td></td></tr><tr><td>culture dish, 24-well, flat bottom</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 92424</td><td></td></tr><tr><td>collagen R (0.2 %)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Merck-Millipore</td><td>F 0915</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0282</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1713</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1603</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>dissolved in sterile water</td></tr><tr><td>transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td>dissolved in sterile water</td></tr><tr><td>insulin (10 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>dissolved in 1x PBS</td></tr><tr><td>NEA</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0293</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma</td><td>F4021</td><td>we prefer to use a stock solution of 2 &amp;micro;g/mL, diluted in 0.9 % NaCl</td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Sigma</td><td>I1146</td><td>we use a stock solution of 2 &amp;micro;g/mL, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/mL BSA</td></tr><tr><td>androstenedione</td><td>Sigma</td><td>46033</td><td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td></tr></tbody></table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

난소 granulosa 셀 (GC)는 estradiol 합성의 주요 소스입니다. Preovulatory 황 호르몬 (LH) 서 지에 의해 유도 된 세포는 티크의 및, 특히, granulosa 셀 계층의 뿌리깊은 그들의 형태, 생리, 및 분자 특성 변경 및 황 체 호르몬 생성 신체를 형성 임신을 유지 하기 위한 책임이 있다는 luteum 셀 문화 모델 folliculo-luteal 변환에 관련 된 기본 규제 메커니즘 연구 필수 도구입니다. 제시 프로토콜 격리 절차 및 중간 소형 낭 (< 6 m m)에서 소 GC의 cryopreservation에 집중 한다. 이 기술로, GC의 거의 순수한 인구를 얻을 수 있습니다. Cryopreservation 절차는 크게 시간 세포 배양의 관리는 직접 기본 조직 (난소) 공급의 독립적인 작동을 지원 합니다. 이 프로토콜에서는 소 GC의 estradiol 액티브 상태를 모방 하는 혈 청 무료 셀 문화 모델을 설명 합니다. 성공적인 스테로이드 활성 세포 배양에 필수적인 중요 한 조건은 프로토콜에 걸쳐 설명 되어 있습니다. 그것은 그 세포의 도금 밀도 증가 유도 특정 응답 변경된 진 식 프로필과 호르몬 생산에 의해 표시 된 대로 설명 했다. 또한,이 모델은 GC 차별화에 대 한 추가 연구를 위한 기초 및 다른 응용 프로그램을 제공합니다.

GC 도금 1 x 105 셀/잘 표시 전형적인 구와 같은 모습으로 그들은 섬유 아 세포에 비해 세포 확장을 형성 (그림 1a 및 1c) 클러스터를 구축 하는 경향이 있다. 의해 도금 밀도 10 배 증가 1 x 106 셀/잘 형태를 변경 하지 않은 하지만 더 많은 셀 클러스터 (그림 1b 및 1 d, 화살표) 관찰 될 수 있다. 같이 이미 이전 게시, 문화 요리 콜라겐 코팅은 크게 셀13의 첨부 파일 개선.
초기 cryopreservation 갓 격리 된 샘플에서 직접 경작 하는 그에 비해 문화에 세포의 생리 적 특성을 상당히 변화 하지는 않았다. 이 때 냉동 또는 신선한 고립 된 수영장에서 파생 된 배양된 세포를 비교 유전자 차이가 없 여러 마커의 사본 풍부 (정량 측정)로 그림 2 에 표시 됩니다.
그림 3 정상 대 높은 밀도에서 교양 소 GC에서 스테로이드 호르몬 분석 (RIA로 측정)의 대표적인 결과 보여준다. Estradiol 농도 호르몬 생산 경향이 높은 반면 정상 밀도 문화에 비해 고밀도 문화에 크게 감소 됩니다.
높은- 대 정상 밀도 문화에서 (정량에 의해 측정 되는) 몇몇 유전자의 비교 분석 (그림 4) 상당한 효과를 밝혔다. CYP19A1, estradiol 생 합성 aromatase FSHR, 생식 샘 자극 호르몬 수용 체의 주요 효소를 인코딩 했다 크게 다운-규제. 대조적으로, RGS2 및 VNN2 유전자는 상당한 업 레 귤 레이 션 보였다. 이러한 결과 명확 하 게 밀도 도금 하는 세포를 증가 시켜 세포 분화의 특정 프로세스 유도 된다 건의 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> 그림 1: 정상 (왼쪽된 패널)과 높은 세포 밀도 (오른쪽 패널)에서 소 granulosa 셀 교양. 1 x 105 셀/잘의 밀도에서 경작 하는(및 c) 셀 표시 전형적인 구와 같은 표현 형. (b 와 d) 정상적인 밀도 (왼쪽된 패널)에서 세포에 비해 더 자주 큰 셀 클러스터 (화살표)를 형성 하는 경향이 높은 도금 밀도 (1 x 106 셀/잘)에서 경작 하는 GC 바 규모 = 100 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> 그림 2: cryopreservation 그리고 격리 후 직접 경작 하는 세포의 비교. 셀 잘 당 1 x 105 세포의 밀도에 교양 있었다. 몇 가지 마커 성적 유전자 발현 평가 되었다 고 배양된 세포 또는 초기 cryopreservation 없이 차이 밝혀. boxplot 보여줍니다 n 의 중앙값 = 3. 양측 스튜던트 t-테스트, p-값이 포함 되어 있습니다. 이 그림은 Baufeld 및 Vanselow16에서 재생 된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> 그림 3: 스테로이드 호르몬 농도 granulosa 셀 다른 도금 밀도에서 경작에. Estradiol (e 2) 농도 감소 크게 GC 높은 세포 조밀도에 교양 있었다 때 황 체 호르몬 (P4) 농도 경향이 높은 반면. 호르몬 농도 DNA 콘텐츠를 다른 핸드폰 번호에 대 한 표준화에 대 한 수정 되었습니다. 평균 및 SEM을 n = 3이 표시 됩니다. p > 0.05, 양측 스튜던트 t-테스트. 이 그림은 Baufeld 그 외 여러분 에서 재현 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> 그림 4: granulosa 셀에 기능 키 성적표의 풍부한 경작는 정상적인 대 에서 높은 도금 밀도. 8 d에 대 한 혈 청 자유로운 조건에서 배양 소 GC 몇몇 선택 된 마커 유전자의 특정 규정을 밝혔다. boxplot 표시 n 의 중앙값 = 3 개별 복제. p < 0.05, 양측 스튜던트 t-테스트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

혈 청 무료 조건에서 소 granulosa 셀의 장기적인 문화 모델을 설명 합니다. 이 모델에서는 다른 도금 밀도에 스 트로 겐 생산의 특성으로 다양 한 요인의 효과 연구 하는 연구원 소 granulosa 셀.

기본 소 Granulosa 에스트로겐 생산의 조직 문화 모델 세포

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

a-tissue-culture-model-estrogen-producing-primary-bovine-granulosa

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K 조회수.  Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN). 혈 청 무료 조건에서 소 granulosa 셀의 장기적인 문화 모델을 설명 합니다. 이 모델에서는 다른 도금 밀도에 스 트로 겐 생산의 특성으로 다양 한 요인의 효과 연구 하는 연구원 소 granulosa 셀.

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Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

연구

의학

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

발생학

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

인간의 유선 상피의 호르몬 응답 3D 문화 모델

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

생체공학

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

가축의 초기 개국 여포에서 온수에 대한 생체 외 문화 전략

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

3D Bovine Ileal Enteroid Culture에서 2D Monolayer 확립

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating drug efficacy and toxicity, and tissue bioengineering. However, applying these models for the described reasons may be limited because of the three-dimensional (3D) nature of these models. For example, using 3D enteroid culture systems to study digestive diseases is challenging due to the inaccessibility of the intestinal lumen and its secreted substances. Indeed, stimulation of 3D organoids with pathogens requires either luminal microinjection, mechanical disruption of the 3D structure, or generation of apical-out enteroids. Moreover, these organoids cannot be co-cultured with immune and stromal cells, limiting in-depth mechanistic analysis into pathophysiological dynamics. To circumvent this, we optimized a bovine primary cell two-dimensional (2D) enteroid-derived monolayer culture system, allowing co-culture with other relevant cell types. Ileal crypts isolated from healthy adult cattle were cultured to generate 3D organoids that were cryopreserved for future use. A 2D monolayer was created using revived 3D enteroids that were passaged and disrupted to yield single cells, which were seeded on basement membrane extract-coated transwell cell culture inserts, thereby exposing their apical surface. The intestinal monolayer polarity, cellular differentiation, and barrier function were characterized using immunofluorescence microscopy and measuring transepithelial electrical resistance. Stimulation of the apical surface of the monolayer revealed the expected functionality of the monolayer, as demonstrated by cytokine secretion from both apical and basal compartments. The described 2D enteroid-derived monolayer model holds great promise in investigating host-pathogen interactions and intestinal physiology, drug development, and regenerative medicine.

저자 스포트라이트: 숙주-병원체 상호작용 연구를 위한 고급 장내 모델 

Enteroids are emerging as a novel model for studying tissue physiology and pathophysiology, drug development, and regenerative medicine. Here, we describe a bovine primary cell 2D enteroid-derived culture system that permits co-culture with relevant tissue cell types. This model offers a translational advantage for gastrointestinal research modeling.

중개 생물의학 연구에 응용하기 위한 소 1차 장내염 유래 2차원 단층 배양 시스템 생성

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

기본 소 Granulosa 에스트로겐 생산의 조직 문화 모델 세포

요약

더 많은 비디오 탐색

3 차원 Heterotypic

난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

인간의 유선 상피의 호르몬 응답 3D 문화 모델

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

가축의 초기 개국 여포에서 온수에 대한 생체 외 문화 전략

중개 생물의학 연구에 응용하기 위한 소 1차 장내염 유래 2차원 단층 배양 시스템 생성

중개 생물의학 연구에 응용하기 위한 소 1차 장내염 유래 2차원 단층 배양 시스템 생성

중개 생물의학 연구에 응용하기 위한 소 1차 장내염 유래 2차원 단층 배양 시스템 생성