Wir danken für ihre hervorragenden technischen Betreuung und hilfreiche Modifikationen des etablierten Kryokonservierung Technik und Zelle-Kultur-Modells Veronica Schreiter. Darüber hinaus möchten wir danken Maren Anders und Swanhild Rodewald für ihre hervorragenden technischen Betreuung in der nachfolgenden Analyse.

Hinweis: Bovine Eierstöcke wurden von einem kommerziellen Schlachthof erhalten. Die Auflistung der Schlachthof Nebenprodukte erfordert keine ethische Zulassung nach deutschem Recht.
(1) Arbeitsbedingungen und Vorbereitungen
<ol><li>Um Sterilität zu gewährleisten, führen Sie alle Medien und Gewebe Vorbereitung sowie alle Kultur in eine spezialisierte Zelle kulturlabor mit Hilfe einer Laminar-Flow Bank arbeiten.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7.4) mit 0,5 µg/µL Amphotericin für den Transport der Eierstöcke, 100 IE Penicillin und 0,1 mg/mL Streptomycin ergänzt. Hinweis: Die maximale Dauer zwischen Erhalt der Eierstöcke und die GC zu isolieren ist 2 h in diesem Set-up.</li>
</ol>2. Isolierung der bovinen Granulosa Zellen
<ol><li>
Waschen Sie die Eierstöcke mehrmals mit 1 X PBS-Puffer (mit 100 IE Penicillin, 0,1 mg/mL Streptomycin und 0,5 µg/µL Amphotericin), um Blut von der Oberfläche zu entfernen, bevor die Isolierung Schritte ausführen. Ein Becherglas, legen Sie die Eierstöcke im Inneren, füllen Sie ihn mit 1 X PBS, und verwerfen Sie die PBS wieder.
	<ol>
<li>Wiederholen Sie diese Waschschritt 3 – 4 X, bis die Eierstöcke vom restlichen Blut gereinigt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wischen Sie einem Eierstock mit einem Lab Tuch getränkt mit 70 % Alkohol, um mögliche Verunreinigungen zu minimieren.</li>
	<li>Mit einer 3 mL Spritze und ein 18 G-Nadel Aspirieren die GC von kleinen bis mittleren Follikel Punktion (< 6 mm, mit einem Lineal gemessen), und die follikelflüssigkeit in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen zu bündeln. Hinweis: Um die Spritze zu befeuchten, nehmen Sie eine kleine Menge von 1 X PBS (mit 100 IE Penicillin, Streptomycin 0,1 mg/mL und 0,5 µg/µL Amphotericin). Dies hilft, kleine Mengen von follikelflüssigkeit sammeln und verhindert, dass Zellen im Inneren der Spritze kleben.</li>
	<li>Spülen Sie nach Punktion mehrere Follikel die Spritze und Nadel mit 1 X PBS für die Zwischenreinigung.</li>
</ol>3. Kryokonservierung von Zellen
<ol><li>
Verwenden Sie Trypan Blau Färbung und zählen Sie die Zellen unter einem Hemocytometer.
	<ol>
<li>Um die Anzahl der lebensfähigen Zellen bereiten Sie einen Schlauch mit 1,5 µL einer 0,25 % igen Trypan blau Lösung. Hinweis: Die lebenden Zellen ungefärbten bleibt da Trypan blau nur die Zelle Barriere von abgestorbenen Zellen zugreifen kann, die dann blau erscheinen.</li>
		<li>Die Trypan blau Lösung 15 µL Zellsuspension Granulosa hinzufügen und vorsichtig mischen.</li>
		<li>Legen Sie die Mischung in beiden Kammern des einen Hemocytometer. Die Anzahl der lebenden (z.B.ungefärbt) Zellen auf einem großen Platz pro Kammer. Hinweis: Obwohl einige Blutkörperchen gesehen werden kann, können sie anhand ihrer sehr geringen Größe unterschieden werden.</li>
		<li>Berechnen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit dem Mittelwert der beiden Kammer Plätze nach den allgemeinen Richtlinien; der Anteil der lebenden Zellen kann variieren zwischen Eierstöcke aber übersteigt 60 %13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nehmen Sie eine Probe aus dem frisch isolierte Granulosa Zelle Pool als Referenz für die weitere Analyse.
	<ol>
<li>Abhängig von der Zellenzahl des isolierten GC beiseite stellen eine angemessene Zahl von Zellen als Referenzproben für RNA oder DNA-Protein-Vorbereitung. Hinweis: Für RNA isoliert und die anschließende Auswertung der Genexpression reichen 1 x 105 Zellen, während andere späteren Analysen verschiedener, in der Regel höhere Zellzahlen benötigen könnte.</li>
		<li>Legen Sie einen oder mehrere Aliquote der Referenzzellen in einem frischen Rohr und für 1 min bei Raumtemperatur und Höchstgeschwindigkeit (12.000 X g) zu einer Zelle Pellet Zentrifugieren. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Sofort Schock-Einfrieren der Proben in flüssigem Stickstoff. Speichern der Probe bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Führen Sie folgendermaßen die Kryokonservierung.
	<ol>
<li>Bereiten Sie das einfrierende Medium mit 80 % fetalen Kälberserum (FCS) und 20 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO).</li>
		<li>Um sanft die GC Pellets, Zentrifugieren der GC für 3 min bei Raumtemperatur und 500 X g.</li>
		<li>Den überstand vorsichtig und sanft Aufschwemmen der Zellen in 100 % FCS (z.B. 1 mL) bis keine weitere Zelle Klumpen sind sichtbar.</li>
		<li>Die Zellsuspension 1 Volumen (z.B. 1 mL) des Mediums vorbereitet Einfrieren hinzu und übertragen Sie die Mischung zu einem kryogenen Fläschchen. Hinweis: Die Endkonzentration der Cryo-Schutz Medien werden 90 % FCS und 10 % DMSO.</li>
		<li>Legen Sie die kryogene Fläschchen in einem spezialisierten (im Handel erhältlich) Einfrieren Behälter, der schnelles Gefrieren verhindert. Die Abkühlgeschwindigkeit der Proben sollte-1 ° C/min. Transfer der eiskalten Container in einem-80 ° C Gefrierschrank für mindestens 4 Stunden nicht überschreiten.</li>
		<li>Legen Sie bei längerer Lagerung die kryogenen Fläschchen in ultra-niedrigen Temperaturen Behältern (z.B. Flüssigphase Stickstoff Behälter). Hinweis: Das Protokoll kann hier gestoppt werden, da die Kryokonservierung längeren Lagerung ermöglicht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Vorbereitung von Medien und Kultur-Platten für die Zellkultur
<ol><li>
Mantel Zellplatten Kultur mit 0,02 % Kollagen R. Hinweis: Kollagen R ist essentiell für eine verbesserte Anlage des GC in Kultur bekannt.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 0,02 % Kollagen R Lösung mit gereinigtem Wasser geeignet für Zellkultur.</li>
		<li>Fügen Sie 150 µL pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte (= 2 cm2/gut) und stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche der Kultur mit der Kollagen R Lösung gut abgedeckt ist.</li>
		<li>Lassen Sie die Lösung Trocknen mit dem Deckel offen für ein paar Stunden oder über Nacht in der Laminar-Flow-Haube.</li>
		<li>Wenn die Kultur Platten vollkommen trocken sind, bestrahlen sie mit UV-Licht für 10 – 15 min um Kontamination zu minimieren.</li>
		<li>Bei Bedarf speichern Sie die Platten bei 4 ° C für bis zu 2 Monate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Medien und Ergänzungen für Kultur Arbeit unter einem Laminar-Flow-Haube. Sie müssen für eine erfolgreiche Wiederherstellung der GC nach dem Auftauen sofort verarbeitet werden.</li>
	<li>
Folgenden Medien vorbereiten.
	<ol>
<li>Α-Minimal wesentlichen Medium (α-MEM) mit 2 mM L-Glutamin, Natriumbicarbonat 0.084 %, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL Natriumselenit, 5 µg/mL Transferrin, 10 ng/mL Insulin und 1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren zu ergänzen.</li>
		<li>Darüber hinaus fügen Sie 100 IE Penicillin und 0,1 mg/mL Streptomycin an die Medien. Hinweis: Die Antibiotika, einmal erwärmt, sind stabil für ca. 48 h. Also, aliquoten die gewünschte Menge für den Kultur-Aufbau und geplanten Medien austauschen. Wärmen Sie nur die Medien Aliquote auf 37 ° C in einem Wasserbad vor. Die vorbereiteten Medien können bei 4 ° C nicht länger als 3 Monate gespeichert werden.</li>
		<li>Um Steroid Tätigkeit in kultivierten bovine GC zu induzieren, ergänzen Sie die α-MEM zusätzlich mit 20 ng/mL Follikel – Förderung Hormon (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 und 2 µM Androstendion. Hinweis: Immer ergänzen Sie diese Komponenten kurz vor dem Beginn der Kultur oder Medien Austausch. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen für FSH und IGF-1 Stammlösungen, wie dies die Steroide Tätigkeit beeinträchtigen könnten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Zelle Kultur Arbeit
<ol><li>Tauen Sie die Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 3 – 4 min. schnell auf und übertragen Sie die Zellsuspension in 37 ° C vorgewärmte α-MEM (ohne Hormon Ergänzung). Für die Zentrifugation empfiehlt sich ein Endvolumen von 10 mL.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die GC für 3 min bei Raumtemperatur und bei 500 X g. Verwerfen Sie den überstand. Fügen Sie die vorgewärmte und ergänzte α-MEM und Aufschwemmen der Zellen vorsichtig.</li>
	<li>Samen der GC bei einer Dichte von 1 x 105 oder 1 x 106 Zellen pro Bohrloch in einem Endvolumen von 500 µL. umfassen technische Wiederholungen von mindestens drei Kultur Brunnen pro Zustand.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellkultur im Brutschrank bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 8d.</li>
	<li>Führen Sie ein Datenträgeraustausch jeden zweiten Tag. Ersetzen Sie nur zwei Drittel der Nährmedien, Stress zu reduzieren und die Anpassung der Zellen, um die neuen Medien zu erleichtern. Hinweis: Die GC bilden einen typische Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp nach ein paar Tagen in Kultur und neigen dazu, zusammen zu gruppieren. In der hohen Zelldichte Kultur befinden sich größere Cluster immer häufiger im Vergleich zu der normalen Dichte GC-Kultur (Abbildung 1, linke vs. Rechte Fenster).</li>
</ol>6. nachträgliche Analyse der kultivierten Granulosa Zellen
<ol><li>Steroidhormon Analysen durchführen, die Medien sammeln und frieren sie bei-20 ° C. Verwenden Sie geeignete Methoden, um die Östradiol und Progesteron-Konzentration in der abgebrannten Medien [z. B. Radioimmunoassay (RIA)]14zu analysieren.</li>
	<li>Lösen Sie für die anschließende Analyse der verschiedenen Zielmoleküle (RNA, DNA, Proteine, etc.) die Zellen direkt in der Kulturschale mit einem entsprechenden lysiereinrichtung Mittel wie vom Lieferanten empfohlen. Hinweis: Für die meisten Isolierungsmaßnahmen ist es möglich das Protokoll hier beenden die lysierten Zellen bei-20 ° C bis zu 1 Woche gespeichert werden können. Bei längerer Lagerung sollten die Zellen bei-80 ° c gehalten werden</li>
	<li>Bestimmen die Abschrift Fülle, cDNA zu synthetisieren und spezifische Protokolle durch quantitative Real-Time Polymerase Kettenreaktion (qPCR) Techniken15messen. Eine statistische Auswertung sollten mindestens drei Wiederholungen von verschiedenen Zellkulturen, stammen aus verschiedenen Zelle Vorbereitungen (biologische Wiederholungen) enthalten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. 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R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions.">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li><li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das vorgestellte zellenmodell Kultur stellt ein Tool um Granulosa Zelle Differenzierung in Vitrozu analysieren. Mehrere Studien zeigten, dass eine serumfreie Kultivierung eine Voraussetzung ist für die Aufrechterhaltung Steroid Tätigkeit in kultivierten bovine GC oder GC von anderen Arten8,9. Darüber hinaus verbessert Beschichten der Kulturschale mit Komponenten der extrazellulären Matrix (z.B. Kollagen R)13, die Anlage der Zellen deutlich. Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die längere kulturdauer. Vor kurzem wurde nachgewiesen, dass eine langfristige Kultur ausreichend steroidogenic Aktivität und einen ausgewogenen Ausdruck Granulosa Zelle Identität Marker17zu erhalten muss. Es scheint, dass GC erfordern die Zeit zur Wiederherstellung der körperlichen Belastung bei der Isolierung.
Die Medien-Ergänzungen bekannt sind FSH, IGF-1 und Androstendion induzieren Aromatase-Aktivität in kultivierten GC. Vor allem, benötigen Sie die Supplementierung mit Androstendion ist absolut notwendig, als die GC einen Vorläufer für Estradiol Synthese. Dies wurde früher veröffentlichten11,18 , und daher wurde nicht weiter untersucht, während die vorliegende Studie. Allerdings kann eine Anpassung der FSH, IGF-1 und Androstendion Konzentrationen für andere Versuchsanordnungen erforderlich sein.
Die hier beschriebene Kryokonservierung-Technik kann helfen, um die Organisation der Gewebekultur Experimente zu verbessern, indem sie unabhängiger von den unterschiedlichen Versorgung mit Eierstöcken. Nach vorherigen Tests wirkt Kryokonservierung nicht GC Phänotyp oder Steroid-Produktion in Kultur. Auch verraten die Fülle der Marker Transkripte in kultivierten Zellen nicht signifikante Unterschiede vergleichen Proben, aus frisch isolierte Zellen vorbereitet, mit denen zuvor ausgesetzt Kryokonservierung16.
Ein entscheidender Parameter für das gegenwärtige Modell der GC-Kultur ist die Zelle Dichte Beschichtung. Wie die Vertreter Ergebnissegezeigt, induziert die Erhöhung der Dichte Beschichtung bemerkenswerte Veränderungen der physiologischen und molekularen Eigenschaften. Mehrere Gene sind geregelt in einer bestimmten Weise, ähnlich wie die Veränderungen, die durch LH Stimulation in Vivo4,19induziert werden. Die Tatsache, dass eine zunehmende Zelldichte Differenzierung-ähnliche Prozesse in kultivierten bovine GC fahren kann hat akribisch in diesem GC in-vitro- Modell berücksichtigt werden, um widersprüchliche Ergebnisse auf Wiederholungen zu vermeiden. Daher widersprüchliche Ergebnisse mit anderen Studien möglicherweise unterschiedlichen Zelldichten zugeschrieben werden und sollte genauer untersucht werden.
Das Kultur-Modell beschrieben offenbarte hier nicht reagiert, LH, als die Transkripte des Rezeptors LHCGR sind nahe an der Nachweisgrenze liegt. Daher ist eine Simulation der LH-Anstieg gleichermaßen die in-Vivo -Situation induzieren Differenzierung13fehlgeschlagen. Dennoch bietet dieses Modell ein hilfreiches Werkzeug um Estradiol-aktive GC in Primärkultur zu studieren, insbesondere da keine funktionale bovine GC-Linien gibt es derzeit.
Unterschiedliche Behandlungsprotokolle können getestet werden, des gegenwärtigen GC-Kultur-Modells, die dazu beitragen, die um regulatorische Mechanismen der Steroid Produktion oder GC-Differenzierung zu entwirren. Weitere, einzelne Faktoren, die in den Entwicklungsprozessen beteiligt sind, können separat analysiert werden. Daher bietet dieses Kultur-Modell eine Grundlage für viele verschiedene Anwendungen.

Erfolgreichen Eisprung und luteinisierung hängen fein abgestimmt und harmonisch molekulare Veränderungen in verschiedenen somatischen follikulären Zelltypen. Da diese Entwicklungsprozesse Details noch nicht vollständig verstanden sind, ist ein weiterer Klärung erforderlich. In Vivo Ansätze sind aufwendig und kostspielig und vor allem nicht Adresse spezifischen molekularen Mechanismen, die bei Folliculogenesis auftreten. Daher sind Feldstudie in-vitro- Modelle darüber hinaus Einblick in zellulären und molekularen Details bieten musste. Verschiedene Studien beschreiben die Kultur des gesamten Follikel im Rahmen von in-vitro- Befruchtung Techniken1,2,3. Weil Forscher Mechanismen der Differenzierung interessiert sind, konzentrieren sich viele Studien auf follikulären GC. Diese Zellen, die Eizelle direkt zugeordnet sind die Hauptquellen der Östrogen-Produktion und somit eine wichtige Rolle im gesamten Folliculogenesis und luteinisierung4.
Zelle, die Linien der GC aus verschiedenen Arten entwickelt wurden verewigt. Die meisten von ihnen, zeigen jedoch keine ausreichende Steroidhormon Produktion5. Bisher nur eine Zell-Linie von Rindern wurde GC6gegründet, aber diese Linie verlor seine steroidogenic Aktivität nach mehreren Passagen7. Daher seit steroidgenese und vor allem Estradiol Produktion ist ein wesentliches Merkmal der GC-Funktionalität, ist es ratsam, diese Aspekte in Primärzelle Kultur Modelle zu studieren. In früheren Studien wurde gezeigt, dass eine erhebliche Estradiol Produktion nur unter serumfreien Kultur Bedingungen8,9beobachtet werden kann. Weiter ist die Ergänzung einer Vorstufe der Estradiol-Synthese auf, eine weitere Voraussetzung, wie GC nicht das notwendige Enzym zum Ausdruck bringen, das Androstendion10Progesteron umwandeln kann. Darüber hinaus ergab die synergistische Wirkung von FSH und IGF-1-Supplementierung in Vitro eine optimierte Aktivität der Aromatase, das Schlüsselenzym der Estradiol Synthese11. In diesem Protokoll werden auch andere wichtigen Faktoren, die einen erheblichen Einfluss auf die GC-Kultur-Modell beschrieben. Insbesondere hat die Zelle Dichte Beschichtung enorme Auswirkungen auf das Ergebnis des Experiments12. Darüber hinaus konnte eine Kryokonservierung Technik des bovinen GC, der GC Physiologie in Kultur nicht erheblich beeinträchtigt wird hergestellt werden. Diese Technik hilft, die Organisation der Zelle Kultur Arbeit zu verbessern und die bevorzugte Beschichtung Dichte zu optimieren.

<table><tbody><tr><td>PBS Instamed w/o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 182-05</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &amp;micro;g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2213</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>amphotericin (250 &amp;micro;g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2612</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>3 mL syringe (Omnifix Luer)</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>18 G needle</td><td>Roth</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Merck-Millipore</td><td>S 0115</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>cryo-preservation vials (2 mL)</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 89020</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX cell freezing container</td><td>Corning</td><td>432004</td><td></td></tr><tr><td>culture dish, 24-well, flat bottom</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 92424</td><td></td></tr><tr><td>collagen R (0.2 %)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Merck-Millipore</td><td>F 0915</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0282</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1713</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1603</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>dissolved in sterile water</td></tr><tr><td>transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td>dissolved in sterile water</td></tr><tr><td>insulin (10 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>dissolved in 1x PBS</td></tr><tr><td>NEA</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0293</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma</td><td>F4021</td><td>we prefer to use a stock solution of 2 &amp;micro;g/mL, diluted in 0.9 % NaCl</td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Sigma</td><td>I1146</td><td>we use a stock solution of 2 &amp;micro;g/mL, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/mL BSA</td></tr><tr><td>androstenedione</td><td>Sigma</td><td>46033</td><td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td></tr></tbody></table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

Ovarian Granulosa Zellen (GC) sind die Hauptquelle der Estradiol-Synthese. Induziert durch die Schwankung der preovulatorische Luteinisierendes Hormon (LH), Zellen von der Theca und insbesondere der Granulosa Zelle Schicht zutiefst ihre morphologischen, physiologischen und molekularen Eigenschaften verändern und bilden Progesteron produzieren Korpus Luteum, das für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft verantwortlich ist. Zellmodelle Kultur sind wesentliche Instrumente, um die zugrunde liegenden Regulationsmechanismen beteiligt in der Folliculo-luteal Transformation zu studieren. Die vorgestellte Protokoll konzentriert sich auf die Isolierung Verfahren und Kryokonservierung von Rindern GC von kleinen bis mittleren Follikel (< 6 mm). Mit dieser Technik erhalten Sie eine nahezu reine Bevölkerung von GC. Das Verfahren der Kryokonservierung erleichtert Zeit Management der Zellkultur arbeiten unabhängig von einer direkten primäre Gewebe (Eierstöcke) Versorgung. Dieses Protokoll beschreibt ein Serum-freie Zelle Kultur-Modell, das den Estradiol-aktiv-Status des bovinen GC imitiert. Wichtige Voraussetzungen, die notwendig für eine erfolgreiche Steroid-aktive Zellkultur sind im gesamten Protokoll diskutiert. Es wird gezeigt, dass eine konkrete Antwort Erhöhung der Beschichtung Dichte der Zellen induziert werden, wie durch eine veränderte Gen Ausdruck Profil und Hormon-Produktion. Darüber hinaus bietet dieses Modell eine Grundlage für weitere Studien auf GC Differenzierung und andere Anwendungen.

GC vergoldet auf 1 x 105 Zellen/Brunnen Display eine typische Fibroblasten aussehen, wie sie eine Zelle Erweiterung vergleichbar mit Fibroblasten bilden und neigen dazu, Cluster (Abb. 1a und 1 c) zu bauen. Erhöhung der Beschichtung-Dichte von 10-fach bis 1 x 106 Zellen/Well die Morphologie nicht ändern aber mehr zellcluster beobachtet werden (Abbildung 1 b und 1D, Pfeile). Wie bereits in einer früheren Publikation dargestellt verbessert die Kollagen-Beschichtung der Kultur Gerichte weitgehend die Befestigung des Zellen-13.
Anfängliche Kryokonservierung änderte sich nicht wesentlich die physiologischen Eigenschaften der Zellen in der Kultur im Vergleich zu denen direkt aus frisch isolierte Proben kultiviert. Dies wird in Abbildung 2 als die Abschrift Fülle (gemessen durch qPCR) gezeigt, mehrere Marker, die Gene nicht unterscheiden beim Vergleich von kultivierter Zellen entweder gefroren oder frisch isolierte Becken abgeleitet.
Abbildung 3 zeigt repräsentative Ergebnisse der Steroidhormon Analyse (gemessen von RIA) in bovinen GC am normalen vs. high-Density kultiviert. Die Östradiol-Konzentration ist in der High-Density-Kultur im Vergleich zu der normalen Dichte Kultur erheblich gesunken, während die Progesteron-Produktion tendenziell höher.
Eine vergleichende Analyse mehrerer Gene (gemessen durch qPCR) in hoch- vs. normale Dichte Kulturen ergab einen signifikanten Effekt (Abbildung 4). CYP19A1, zentrale Enzym Aromatase Estradiol Biosynthese sowie der Gonadotropin-Rezeptor FSHR, Codierung wurden deutlich nach unten geregelt. Im Gegensatz dazu zeigte die Gene RGS2 und VNN2 eine bedeutende Up-Verordnung. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass bestimmte Prozesse der Zelldifferenzierung induziert werden, indem man die Zelle Dichte Beschichtung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Abbildung 1: kultiviert bovine Granulosa Zellen an Normal (linken Panels) und hohe Zelldichte (richtigen Platten). (a und c) Zellen, die bei einer Dichte von 1 x 105 Zellen/gut kultiviert angezeigt einen typische Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp. (b und d) GC bei einer hohen Beschichtung Dichte (1 x 106 Zellen/na) großzellige Cluster (Pfeile) bilden tendenziell häufiger im Vergleich zu Zellen, die unter einer normalen Dichte (linken) kultiviert. Skalieren von Balken = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Abbildung 2: Vergleich der Zellen kultiviert direkt nach Isolation und Kryokonservierung. Die Zellen wurden bei einer Dichte von 1 x 105 Zellen pro Bohrloch kultiviert. Die Genexpression von mehrere Marker Abschriften wurde ausgewertet und ergab keinen Unterschied zwischen kultivierten Zellen mit oder ohne eine anfängliche Kryokonservierung. Das Boxplot zeigt den Median n = 3. Zweiseitigen Student t-test, p-Werte sind im Preis inbegriffen. Diese Zahl wird vom Baufeld und Vanselow16wiedergegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Abbildung 3: Steroidhormon Konzentration in Granulosa Zellen kultiviert bei verschiedenen Beschichtung dichten. Estradiol (E2) Konzentration verringerte sich deutlich bei GC auf eine hohe Zelldichte, kultiviert wurden während die Konzentration von Progesteron (P4) nur tendenziell höher. Die Hormon-Konzentration wurde für die DNA-Gehalt für verschiedene Zellzahlen normalisieren korrigiert. Der Mittelwert und SEM von n = 3 gezeigt. p > 0,05, zweiseitigen Student t-test. Diese Zahl wird vom Baufeld Et Al. reproduziert. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Abbildung 4: Fülle von funktionell wichtige Transkripte in Granulosa Zellen kultiviert auf einer normalen vs. eine hohe Beschichtung Dichte. Bovine GC kultiviert serumfreien Bedingungen für 8D offenbart eine spezifische Verordnung von mehreren ausgewählten Markergene. Das Boxplot zeigt den Median n = 3 einzelnen Wiederholungen. p < 0,05, zweiseitigen Student t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Eine langfristige Kultur-Modell des bovinen Granulosa Zellen unter serumfreien Bedingungen wird beschrieben. Dieses Modell erlaubt es den Forschern, die Auswirkungen der unterschiedlichen Faktoren und Bedingungen zu studieren, wie verschiedene Beschichtung dichten auf die Merkmale der Östrogen-produzierenden bovine Granulosa Zellen.

Ein Tissue Culture Modell der Östrogen-produzierenden primäre Bovine Granulosa Zellen

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

a-tissue-culture-model-estrogen-producing-primary-bovine-granulosa

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Aufrufe.  Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN). Eine langfristige Kultur-Modell des bovinen Granulosa Zellen unter serumfreien Bedingungen wird beschrieben. Dieses Modell erlaubt es den Forschern, die Auswirkungen der unterschiedlichen Faktoren und Bedingungen zu studieren, wie verschiedene Beschichtung dichten auf die Merkmale der Östrogen-produzierenden bovine Granulosa Zellen.

Serie: A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Heterotypische Dreidimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Forschung

Medizin

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Entwicklungsbiologie

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

Eine dreidimensionale Zellkulturmodell zu primären humanen Knochenmark und seine Malignome Studieren

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

Ein Hormon ansprechenden 3D-Kultur Modell des menschlichen Brustdrüse Epithel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Biotechnik

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

In Vitro Kulturstrategie für Oozyten aus dem frühen Antralfollikel bei Rindern

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Etablierung einer 2D-Monoschicht aus 3D-Rinder-Ilealenteroidkulturen

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating drug efficacy and toxicity, and tissue bioengineering. However, applying these models for the described reasons may be limited because of the three-dimensional (3D) nature of these models. For example, using 3D enteroid culture systems to study digestive diseases is challenging due to the inaccessibility of the intestinal lumen and its secreted substances. Indeed, stimulation of 3D organoids with pathogens requires either luminal microinjection, mechanical disruption of the 3D structure, or generation of apical-out enteroids. Moreover, these organoids cannot be co-cultured with immune and stromal cells, limiting in-depth mechanistic analysis into pathophysiological dynamics. To circumvent this, we optimized a bovine primary cell two-dimensional (2D) enteroid-derived monolayer culture system, allowing co-culture with other relevant cell types. Ileal crypts isolated from healthy adult cattle were cultured to generate 3D organoids that were cryopreserved for future use. A 2D monolayer was created using revived 3D enteroids that were passaged and disrupted to yield single cells, which were seeded on basement membrane extract-coated transwell cell culture inserts, thereby exposing their apical surface. The intestinal monolayer polarity, cellular differentiation, and barrier function were characterized using immunofluorescence microscopy and measuring transepithelial electrical resistance. Stimulation of the apical surface of the monolayer revealed the expected functionality of the monolayer, as demonstrated by cytokine secretion from both apical and basal compartments. The described 2D enteroid-derived monolayer model holds great promise in investigating host-pathogen interactions and intestinal physiology, drug development, and regenerative medicine.

Autor im Rampenlicht: Fortschrittliches enteroides Modell zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen 

Enteroids are emerging as a novel model for studying tissue physiology and pathophysiology, drug development, and regenerative medicine. Here, we describe a bovine primary cell 2D enteroid-derived culture system that permits co-culture with relevant tissue cell types. This model offers a translational advantage for gastrointestinal research modeling.

Generierung eines bovinen primären enteroiden zweidimensionalen Monolayer-Kultursystems für Anwendungen in der translationalen biomedizinischen Forschung

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

Ein Tissue Culture Modell der Östrogen-produzierenden primäre Bovine Granulosa Zellen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Heterotypische Dreidimensionale

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

Eine dreidimensionale Zellkulturmodell zu primären humanen Knochenmark und seine Malignome Studieren

Ein Hormon ansprechenden 3D-Kultur Modell des menschlichen Brustdrüse Epithel

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

In Vitro Kulturstrategie für Oozyten aus dem frühen Antralfollikel bei Rindern

Generierung eines bovinen primären enteroiden zweidimensionalen Monolayer-Kultursystems für Anwendungen in der translationalen biomedizinischen Forschung

Generierung eines bovinen primären enteroiden zweidimensionalen Monolayer-Kultursystems für Anwendungen in der translationalen biomedizinischen Forschung

Generierung eines bovinen primären enteroiden zweidimensionalen Monolayer-Kultursystems für Anwendungen in der translationalen biomedizinischen Forschung