Ringraziamo Veronica Schreiter per la sua ottima assistenza tecnica e utili modifiche del modello di cultura tecnica e cella di crioconservazione stabilito. Inoltre, vorremmo ringraziare Maren Anders e Swanhild Rodewald per la loro eccellente assistenza tecnica nell'analisi successive.

Nota: Ovaie Bovine sono state ottenute da un macello commerciale. La raccolta di sottoprodotti di macellazione non richiede un'approvazione etica secondo la legge tedesca.
1. condizioni di lavoro e preparativi
<ol><li>Per garantire la sterilità, eseguire tutti i supporti e preparazione dei tessuti, così come tutta la cultura lavora in un laboratorio di cultura delle cellule specializzate utilizzando un banco di flusso laminare.</li>
	<li>Preparare 1 x tamponato fosfato salino (PBS, pH 7.4) completato con 100 UI di penicillina, 0,1 mg/mL di streptomicina e 0,5 µ g / µ l anfotericina per il trasporto delle ovaie. Nota: La durata massima tra ricevendo le ovaie e isolando il GC è 2h in questo set-up.</li>
</ol>2. isolamento delle cellule della Granulosa bovina
<ol><li>
Lavare le ovaie diverse volte in PBS 1X (con 100 UI di penicillina, 0,1 mg/mL di streptomicina e 0,5 µ g / µ l anfotericina) per rimuovere qualsiasi sangue dalla superficie prima di iniziare la procedura di isolamento. Utilizzare un becher, posizionare le ovaie all'interno, riempirlo con PBS 1X e scartare il PBS nuovamente.
	<ol>
<li>Ripetere questo passaggio di lavaggio 3 – 4 x, fino a quando le ovaie sono pulite da qualsiasi anima restante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulire un'ovaia servendosi di un panno di laboratorio imbevuto con alcool al 70%, per ridurre al minimo possibili contaminazioni.</li>
	<li>Con una siringa da 3 mL e un ago da 18 G, aspirare il GC da puntura follicoli di piccole e medie dimensioni (< 6 mm, misurato con un righello) e la piscina del liquido follicolare in un tubo di centrifuga da 50 mL. Nota: Per inumidire la siringa, prendere una piccola quantità di PBS 1X (con 100 UI penicillina, 0,1 mg/mL di streptomicina e 0,5 µ g / µ l anfotericina). Questo aiuta a raccogliere una piccola quantità di liquido follicolare e impedisce alle cellule di attaccarsi all'interno della siringa.</li>
	<li>Dopo parecchi follicoli di perforatura, risciacquare la siringa e l'ago con 1x PBS per pulizia intermedia.</li>
</ol>3. Crioconservazione delle cellule
<ol><li>
Utilizzare la colorazione blu di trypan e contare le celle sotto un emocitometro.
	<ol>
<li>Per contare il numero di cellule vitali, preparare una provetta con 1,5 µ l di una soluzione di blu di trypan 0.25%. Nota: Le cellule viventi rimarrà senza macchiate perché tripan blu può accedere solo la barriera delle cellule delle cellule morte, che poi appaiono blu.</li>
		<li>Aggiungere alla soluzione di blu di trypan 15 µ l della sospensione delle cellule della granulosa e mescolare delicatamente.</li>
		<li>Mettere il composto in entrambi gli alloggiamenti di un emocitometro. Contare il numero di vita (ad es., senza macchia) cellule in una grande piazza per camera. Nota: Anche se alcune cellule del sangue può essere visto, che si distinguono per la loro dimensione molto piccola.</li>
		<li>Calcolare il numero di cellule viventi con la media di entrambi i quadrati camera secondo le linee guida generali; la proporzione di cellule viventi può variare tra le ovaie ma deve superare i 60%13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prelevare un campione dal pool di cella di recente isolate della granulosa come riferimento per ulteriori analisi.
	<ol>
<li>A seconda il conteggio delle cellule del GC isolato, mettere da parte un numero adeguato di cellule come campioni di riferimento per la preparazione di proteine, DNA o RNA. Nota: Per l'isolamento di RNA e la successiva valutazione dell'espressione genica, 1 x 105 celle sono sufficienti, mentre altre successive analisi potrebbero richiedere numeri diversi, generalmente più elevati delle cellule.</li>
		<li>Inserire una o più aliquote di celle di riferimento in una nuova provetta e centrifugare esso per 1 min a temperatura ambiente e velocità massima (12.000 x g) per ottenere un pellet cellulare. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Immediatamente-congelamento dei campioni in azoto liquido. Conservare il campione a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eseguire la crioconservazione come segue.
	<ol>
<li>Preparare il supporto di congelamento utilizzando 80% siero fetale di vitello (FCS) e 20% di dimetilsolfossido (DMSO).</li>
		<li>Al fine di delicatamente a pellet il GC, centrifugare il GC per 3 min a temperatura ambiente e 500 x g.</li>
		<li>Rimuovere attentamente il supernatante e Risospendere delicatamente le cellule in 100% FCS (ad es., 1 mL) fino a nessuna cella più grumi sono visibili.</li>
		<li>Aggiungere 1 volume (ad esempio, 1 mL) del mezzo congelamento preparato alla sospensione cellulare e trasferire il composto in un vial criogeniche. Nota: La concentrazione finale di cryo-protezione media sarà 90% FCS e 10% DMSO.</li>
		<li>Posizionare la cuvetta criogenica in un contenitore di congelamento (disponibile in commercio) specializzato che previene il congelamento rapido. Il tasso di raffreddamento dei campioni non deve superare-1 ° C/min. da trasferire il contenitore di congelamento in un congelatore-80 ° C per almeno 4 ore.</li>
		<li>Per conservarli più a lungo, è possibile posizionare le fiale criogeniche in contenitori ultra-bassa temperatura (ad esempio, contenitori di azoto liquido fase). Nota: Il protocollo può essere fermato qui, come la crioconservazione permette di conservarli più a lungo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. preparazione dei supporti e piastre di coltura per la coltura delle cellule
<ol><li>
Piastre per colture cellulari cappotto con 0,02% collagene R. Nota: Collagene R sono conosciuta per essere essenziale per un allegato migliorato di GC nella cultura.<ol>
<li>Preparare una soluzione di R 0,02% collagene con acqua purificata adatto per colture cellulari.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (= 2cm2/bene) e garantire che l'intera superficie della cultura è ben coperto con la soluzione di collagene R.</li>
		<li>Lasciate che la soluzione a secco con il coperchio aperto per poche ore o durante la notte nella cappa a flusso laminare.</li>
		<li>Quando le piastre di coltura sono completamente asciutte, li irradiare con luce UV per 10 – 15 min minimizzare la contaminazione.</li>
		<li>Se necessario, è possibile memorizzare le piastre a 4 ° C fino a 2 mesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare i media e i supplementi per il lavoro di cultura sotto cappa a flusso laminare. Per un riuscito recupero del GC, devono essere trattati immediatamente dopo lo scongelamento.</li>
	<li>
Preparare i seguenti supporti.
	<ol>
<li>Supplemento mezzo essenziale α-Minimal (α-MEM) con 2 mM L-Glutammina, 0,084% di bicarbonato di sodio, 0,1% albumina di siero bovino (BSA), 20 mM HEPES, selenito di sodio 4 ng/mL, transferrina di 5 µ g/mL, 10 ng/mL insulina e gli amminoacidi non essenziali di 1 mM.</li>
		<li>Inoltre, è possibile aggiungere 100 UI di penicillina e 0,1 mg/mL di streptomicina ai media. Nota: Gli antibiotici, una volta riscaldati, sono stabili per circa 48 ore. Di conseguenza, aliquotare la quantità desiderata di media per il set-up cultura e media previsto scambio. Pre-riscaldare solo le aliquote di media a 37 ° C in un bagno d'acqua. I media preparati possono essere memorizzati a 4 ° C per non più di 3 mesi.</li>
		<li>Per indurre l'attività steroide in GC bovina coltivate, integrare il α-MEM ulteriormente con 20 ng/mL ormone follicolostimolante (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 e 2 µM androstenedione. Nota: Completare sempre questi componenti poco prima dell'inizio di uno scambio di cultura o supporti. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento per soluzioni di riserva di FSH e di IGF-1, in quanto ciò potrebbe compromettere l'attività steroide.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cellula cultura lavoro
<ol><li>Scongelare le cellule rapidamente in un bagno di acqua a 37 ° C per 3-4 min e trasferire la sospensione cellulare in α-MEM pre-riscaldato di 37 ° C (senza supplemento dell'ormone). Per centrifugazione, è consigliato un volume finale di 10 mL.</li>
	<li>Centrifugare il GC per 3 min a temperatura ambiente e a 500 x g. Scartare il surnatante. Aggiungere il α-MEM pre-riscaldato e completati e risospendere le cellule con attenzione.</li>
	<li>Seme del GC ad una densità di 1 x 105 o 1 x 106 cellule per pozzetto in un volume finale di 500 µ l. includono tecniche repliche di almeno tre pozzi di cultura a condizione.</li>
	<li>Incubare la coltura delle cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per 8 d.</li>
	<li>Eseguire un cambio di media ogni altro giorno. Sostituire solo i due terzi dei terreni di coltura per ridurre lo stress e per facilitare l'adattamento delle cellule ai media freschi. Nota: Il GC formano un fenotipo tipico di fibroblasto-come dopo un paio di giorni nella cultura e tendono a raggrupparsi insieme. Nella coltura delle cellule-ad alta densità, cluster di grandi dimensioni si trovano più frequentemente rispetto la cultura di densità normale GC (Figura 1, sinistra vs pannello di destra).</li>
</ol>6. la successiva analisi delle cellule della Granulosa coltivate
<ol><li>Per eseguire l'analisi dell'ormone steroide, raccogliere i media e congelare a-20 ° C. Utilizzare metodi appropriati per analizzare la concentrazione di estradiolo e progesterone nella media abbiamo trascorso [ad es., radioimmunoanalisi (RIA)]14.</li>
	<li>Per la successiva analisi di molecole differenti target (RNA, DNA, proteine, ecc.), lisare le cellule direttamente nella piastra di coltura con un appropriato agente lisante come consigliato dal fornitore. Nota: Per la maggior parte delle procedure di isolamento, è possibile interrompere il protocollo qui, come le cellule lisate possono essere conservate a-20 ° C per fino a 1 settimana. Per conservarli più a lungo, le cellule devono essere conservate a-80 ° C.</li>
	<li>Per determinare l'abbondanza di trascrizione, sintetizzare cDNA e misurare specifici trascritti da quantitativa in tempo reale della polimerasi reazione a catena (qPCR) tecniche15. Una valutazione statistica deve includere almeno tre repliche di culture differenti delle cellule, ha provenute da preparazioni di cellule diverse (replica biologici).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro.">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li><li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture.">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li><li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex.">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li><li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resource:+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes.">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li><li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+granulosa+cell+lines.">Ovarian granulosa cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).</li><li>Bernath, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+inhibits+fibronectin+gene+expression+in+a+newly+developed+granulosa+cell+line+by+a+mechanism+that+suppresses+cAMP-responsive+element-dependent+transcriptional+activation.">Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).</li><li>Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+between+freshly+isolated+and+spontaneously+immortalized+bovine+granulosa+cells:+protein+secretion,+steroid+metabolism,+and+responsiveness+to+growth+factors.">Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).</li><li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system:+induction+and+maintenance+of+estradiol+production,+response+to+follicle-+stimulating+hormone,+and+morphological+characteristics.">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li><li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media.">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li><li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell,+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited.">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li><li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro.">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li><li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells.">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells.">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li><li>Schneider, F., Br&#252;ssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts.">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li><li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density.">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage.">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).</li><li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions.">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li><li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il modello della coltura cellulare presentato fornisce uno strumento per analizzare di differenziazione delle cellule della granulosa in vitro. Diversi studi hanno mostrato che una coltura privo di siero è un prerequisito per il mantenimento dell'attività steroide in coltivate bovina GC o GC di altre specie8,9. Inoltre, rivestimento piastra di coltura con componenti della matrice extracellulare (ad es., collagene R)13, migliorato significativamente l'allegato delle cellule. Un'altra caratteristica importante è il periodo di coltura prolungata. Recentemente, è stato dimostrato che una coltura a lungo termine è necessaria ottenere sufficiente attività steroidogenica e un'espressione equilibrata di granulosa cella identità marcatori17. Sembra che il GC richiede il tempo per riprendersi dallo stress fisico durante la procedura di isolamento.
I supplementi di media FSH, IGF-1 e androstenedione sono conosciuti per indurre l'attività di aromatasi in coltivate GC. Soprattutto, il completamento con androstenedione è assolutamente necessario, come il GC bisogno un precursore per la sintesi di estradiolo. Questo è stato pubblicato in precedenza11,18 e, pertanto, non è stato ulteriormente studiato durante lo studio presente. Tuttavia, un adattamento del FSH, IGF-1 e concentrazioni di androstenedione potrebbe essere necessario per altre configurazioni sperimentali.
La tecnica di crioconservazione descritta qui può aiutare a migliorare l'organizzazione di esperimenti di coltura di tessuti rendendoli più indipendente dall'alimentazione varia con le ovaie. Secondo i test precedenti, crioconservazione non influisce il fenotipo GC o la produzione di steroidi nella cultura. Inoltre, l'abbondanza delle trascrizioni di marcatore in cellule coltivate non ha rivelato differenze significative confrontando campioni preparati dalle cellule di recente isolate con quelli precedentemente sottoposti a crioconservazione16.
Un parametro cruciale per l'attuale modello di cultura di GC è la cella densità di placcatura. Come dimostrano i Risultati di rappresentante, aumentando la densità di placcatura ha indotto notevoli cambiamenti delle caratteristiche fisiologiche e molecolari. Diversi geni sono regolati in modo specifico, le modifiche indotte da stimolazione della LH in vivo4,19di somiglianza. Il fatto che un aumento della densità delle cellule può guidare i processi di differenziazione-come in GC bovina coltivate è da considerarsi meticolosamente in questo modello in vitro di GC per evitare risultati conflittuali tra repliche. Di conseguenza, risultati contraddittori con altri studi potrebbero essere attribuiti alle densità differenti delle cellule e dovrebbero essere esaminati più da vicino.
Il modello di cultura descritto qui ha rivelato di essere non-responsivi agli LH, come le trascrizioni del recettore LHCGR sono vicini al limite di rilevazione. Quindi, una simulazione di limpulso del LH sia la situazione in vivo non è riuscito a indurre differenziazione13. Tuttavia, questo modello fornisce uno strumento utile per studiare i GC di estradiolo-attivo nella cultura primaria, in particolare come nessun funzionale bovina GC linee esistono allo stato attuale.
Protocolli di trattamento differenti possono essere testati nell'attuale modello di cultura di GC che aiutano a svelare i meccanismi di regolazione della produzione di steroidi o differenziazione di GC. Ulteriori, singoli fattori che sono coinvolti in processi di sviluppo possono essere analizzati separatamente. Pertanto, questo modello di cultura fornisce una base per molte applicazioni differenti.

Luteinization e ovulazione successo dipendono finemente sintonizzate e ben orchestrate alterazioni molecolari in tipi differenti delle cellule follicolari somatico. Poiché i dettagli di questi processi di sviluppo ancora completamente non sono capiti, sono necessari maggiori chiarimenti. Approcci in vivo sono elaborati e costosi e, in particolare, non riescono a meccanismi molecolari specifici di indirizzo che si verificano durante la follicologenesi. Di conseguenza, riduttivistico in vitro modelli sono necessari inoltre, per fornire la comprensione nei dettagli molecolari e cellulari. Diversi studi descrivono la cultura dei follicoli tutto nel contesto di in vitro fertilizzazione tecniche1,2,3. Perché i ricercatori sono interessati nei meccanismi di differenziazione, molti studi si concentrano su GC follicolare. Queste cellule, direttamente connesse con l'ovocita, sono le principali fonti di produzione di estrogeni e, pertanto, svolgono un ruolo essenziale in tutto follicologenesi e luteinization4.
Immortalata cella da diverse specie sono state sviluppate linee di GC. La maggior parte di loro, tuttavia, non mostrano un sufficiente ormone steroide produzione5. Finora, solo una varietà di cellula di bovini che GC è stata stabilita6, ma questa linea ha perso la sua attività steroidogenica dopo diversi passaggi7. Pertanto, poiché la steroidogenesi e, in particolare, produzione di estradiolo è una caratteristica essenziale delle funzionalità di GC, si consiglia di studiare questi aspetti in modelli di coltura cellulare primaria. Negli studi precedenti, è stato dimostrato che una produzione considerevole di estradiolo possa essere osservata solamente sotto coltura privo di siero circostanze8,9. Ulteriormente, il completamento di un precursore della sintesi di estradiolo è un altro requisito, come GC non riescono ad esprimere l'enzima necessario che può convertire il progesterone in androstenedione10. Inoltre, l'effetto sinergico di FSH e IGF-1 il completamento in vitro ha rivelato un'attività ottimizzata dell'aromatasi, l'enzima chiave della sintesi di estradiolo11. Nel presente protocollo, altri importanti fattori che hanno un impatto sostanziale sul modello GC cultura inoltre sono descritti. In particolare, la cella densità di placcatura ha enormi effetti sull'esito dell' esperimento12. Inoltre, una tecnica di crioconservazione di bovino GC che non interferisce significativamente con la fisiologia di GC nella cultura potrebbe essere stabilita. Questa tecnica aiuta a migliorare l'organizzazione del lavoro della coltura delle cellule e per ottimizzare la densità di placcatura preferito.

<table><tbody><tr><td>PBS Instamed w/o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 182-05</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &amp;micro;g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2213</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>amphotericin (250 &amp;micro;g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2612</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>3 mL syringe (Omnifix Luer)</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>18 G needle</td><td>Roth</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Merck-Millipore</td><td>S 0115</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>cryo-preservation vials (2 mL)</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 89020</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX cell freezing container</td><td>Corning</td><td>432004</td><td></td></tr><tr><td>culture dish, 24-well, flat bottom</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 92424</td><td></td></tr><tr><td>collagen R (0.2 %)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Merck-Millipore</td><td>F 0915</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0282</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1713</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1603</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>dissolved in sterile water</td></tr><tr><td>transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td>dissolved in sterile water</td></tr><tr><td>insulin (10 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>dissolved in 1x PBS</td></tr><tr><td>NEA</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0293</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma</td><td>F4021</td><td>we prefer to use a stock solution of 2 &amp;micro;g/mL, diluted in 0.9 % NaCl</td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Sigma</td><td>I1146</td><td>we use a stock solution of 2 &amp;micro;g/mL, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/mL BSA</td></tr><tr><td>androstenedione</td><td>Sigma</td><td>46033</td><td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td></tr></tbody></table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

Cellule della granulosa ovarica (GC) sono la fonte principale di sintesi di estradiolo. Indotto dall'ondata preovulatorio dell'ormone luteinizzante (LH), le cellule della teca e, in particolare, dello strato delle cellule della granulosa profondamente cambiano le loro caratteristiche morfologiche, fisiologiche e molecolari e formano il corpus della produzione di progesterone luteo che è responsabile per il mantenimento della gravidanza. Modelli di coltura cellulare sono strumenti essenziali per studiare i meccanismi normativi coinvolti nella trasformazione folliculo-luteale. Il protocollo presentato si concentra sulla procedura di isolamento e criopreservazione di bovino GC da follicoli di piccole e medie dimensioni (< 6 mm). Con questa tecnica, una popolazione quasi pura di GC possa essere ottenuta. La procedura di crioconservazione facilita notevolmente il tempo di lavoro indipendente di una fornitura di tessuto (ovaie) diretta primaria gestione della coltura delle cellule. Questo protocollo descrive un modello di coltura privo di siero cellulare che simula lo stato di estradiolo-attivo di bovino GC. Condizioni importanti che sono essenziali per una cultura di successo steroide-attivo delle cellule sono discussi in tutto il protocollo. È dimostrato che aumentando la densità di placcatura delle cellule induce una risposta specifica, come indicato da una produzione dell'ormone e del profilo di espressione gene alterato. Inoltre, questo modello fornisce una base per ulteriori studi sulla differenziazione di GC e altre applicazioni.

GC placcati al display di 1 x 105 cellule/pozzetto un aspetto tipico del fibroblasto-come in quanto formano un'estensione di cella paragonabile ai fibroblasti e tendono a costruire cluster (Figura 1a e 1C). Aumentando la densità di placcatura di 10 volte a 1 x 106 cellule/pozzetto non cambiare la morfologia ma più mazzi delle cellule possono essere osservati (Figura 1b e 1D, frecce). Come già indicato in una precedente pubblicazione, il rivestimento di collagene i piatti di cultura in gran parte migliorata l'allegato delle cellule13.
Crioconservazione iniziale non ha cambiato notevolmente le caratteristiche fisiologiche delle cellule in cultura rispetto a quelli coltivati direttamente da campioni di recente isolati. Questo è illustrato nella Figura 2 come l'abbondanza di trascrizione (misurato da qPCR) del marcatore diversi geni non hanno differito quando confrontando le cellule coltivate derivate dalle piscine appena isolate o congelate.
Figura 3 Mostra risultati rappresentativi dell'analisi dell'ormone steroide (misurato da RIA) in bovini GC coltivate a normale vs ad alta densità. La concentrazione di estradiolo è diminuita significativamente nella cultura ad alta densità rispetto alla cultura normale-densità, mentre la produzione di progesterone hanno teso ad essere più alto.
Un'analisi comparativa dei diversi geni (misurato da qPCR) in alto - vs culture normale densità ha rivelato un effetto significativo (Figura 4). CYP19A1, codifica l'enzima chiave della biosintesi di estradiolo aromatasi, come pure il recettore di gonadotropina FSHR, erano significativamente giù-regolato. Al contrario, i geni RGS2 e VNN2 hanno mostrato un su-regolamento significativo. Questi risultati indicano chiaramente che specifici processi di differenziazione cellulare sono indotta aumentando la densità di placcatura di cella.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Figura 1: coltivate le cellule della granulosa bovina a normale (pannelli a sinistra) e delle cellule ad alta densità (pannelli di destra). (a e c) cellule coltivate ad una densità di 1 x 105 cellule/pozzetto visualizzato un tipico del fibroblasto-come il fenotipo. (b e d) GC coltivate a una placcatura ad alta densità (1 x 106 cellule/pozzetto) tendeva a formare ammassi a grandi cellule (frecce) più frequentemente rispetto alle cellule sotto una densità normale (pannello di sinistra). Scala bar = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Figura 2: confronto delle cellule coltivate direttamente dopo l'isolamento e dopo crioconservazione. Le cellule sono state coltivate ad una densità di 1 x 105 cellule per pozzetto. L'espressione genica di diverse trascrizioni di marcatore è stata valutata e non rivelato alcuna differenza tra cellule coltivate con o senza un iniziale crioconservazione. Il boxplot Mostra la mediana di n = 3. Di due code Student t-test, il p-valori sono inclusi. Questa figura è riprodotto dal Baufeld e Vanselow imperiale16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Figura 3: concentrazione di ormone steroide in cellule della granulosa coltivate a densità differente di placcatura. La concentrazione di estradiolo (E2) è diminuito significativamente quando il GC sono state coltivate ad una densità elevata delle celle, mentre la concentrazione di progesterone (P4) solo ha teso ad essere più alto. La concentrazione di ormone è stato corretto per il contenuto di DNA normalizzare per i numeri di cellulari diversi. La media e la SEM di n = 3 sono mostrati. p > 0.05, di due code Student t-test. Questa figura è riprodotto dal Baufeld et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Figura 4: Abbondanza di trascritti funzionali chiave nelle cellule della granulosa coltivate a un normale vs una densità alta placcatura. Bovina GC coltivato nelle circostanze senza siero per 8 d ha rivelato un regolamento specifico dei diversi geni marcatori selezionati. Il boxplot Mostra la mediana di n = 3 ripetizioni individuali. p < 0.05, di due code Student t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

È descritto un modello di coltura a lungo termine delle cellule della granulosa bovina nelle circostanze senza siero. Questo modello permette ai ricercatori di studiare gli effetti dei diversi fattori e condizioni come densità differente di placcatura sulle caratteristiche della produzione di estrogeno delle cellule della granulosa bovina.

Un modello di coltura del tessuto della produzione di estrogeno primario bovina Granulosa Cells

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

a-tissue-culture-model-estrogen-producing-primary-bovine-granulosa

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Views.  Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN). È descritto un modello di coltura a lungo termine delle cellule della granulosa bovina nelle circostanze senza siero. Questo modello permette ai ricercatori di studiare gli effetti dei diversi fattori e condizioni come densità differente di placcatura sulle caratteristiche della produzione di estrogeno delle cellule della granulosa bovina.

Video: A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Eterotipica tridimensionale<em&gt; In Vitro</emModellazione&gt; di stromale-epiteliali interazioni Durante iniziazione e la progressione del cancro ovarico

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Ricerca

Medicina

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Coltura del tessuto ovarico per visualizzare fenomeni nell'ovaia di Mouse

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Biologia dello sviluppo

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

A Three-dimensional Tissue Culture modello per studiare Primario Osso Osseo e le sue Malignità

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

Una cultura Modello 3D Ormone-sensibile della Human ghiandola mammaria Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Bioingegneria

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Generazione di organoidi endometriali primari umani multicellulari

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

Strategia di coltura in vitro per oociti dal follicolo antralico precoce nel bestiame

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Istituzione di un monostrato 2D da coltura enteroide ileale bovina 3D

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating drug efficacy and toxicity, and tissue bioengineering. However, applying these models for the described reasons may be limited because of the three-dimensional (3D) nature of these models. For example, using 3D enteroid culture systems to study digestive diseases is challenging due to the inaccessibility of the intestinal lumen and its secreted substances. Indeed, stimulation of 3D organoids with pathogens requires either luminal microinjection, mechanical disruption of the 3D structure, or generation of apical-out enteroids. Moreover, these organoids cannot be co-cultured with immune and stromal cells, limiting in-depth mechanistic analysis into pathophysiological dynamics. To circumvent this, we optimized a bovine primary cell two-dimensional (2D) enteroid-derived monolayer culture system, allowing co-culture with other relevant cell types. Ileal crypts isolated from healthy adult cattle were cultured to generate 3D organoids that were cryopreserved for future use. A 2D monolayer was created using revived 3D enteroids that were passaged and disrupted to yield single cells, which were seeded on basement membrane extract-coated transwell cell culture inserts, thereby exposing their apical surface. The intestinal monolayer polarity, cellular differentiation, and barrier function were characterized using immunofluorescence microscopy and measuring transepithelial electrical resistance. Stimulation of the apical surface of the monolayer revealed the expected functionality of the monolayer, as demonstrated by cytokine secretion from both apical and basal compartments. The described 2D enteroid-derived monolayer model holds great promise in investigating host-pathogen interactions and intestinal physiology, drug development, and regenerative medicine.

Autore in primo piano: Modello enteroide avanzato per lo studio delle interazioni ospite-patogeno 

Enteroids are emerging as a novel model for studying tissue physiology and pathophysiology, drug development, and regenerative medicine. Here, we describe a bovine primary cell 2D enteroid-derived culture system that permits co-culture with relevant tissue cell types. This model offers a translational advantage for gastrointestinal research modeling.

Generazione di un sistema di coltura monostrato bidimensionale di derivazione enteroide primaria bovina per applicazioni nella ricerca biomedica traslazionale

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

Un modello di coltura del tessuto della produzione di estrogeno primario bovina Granulosa Cells

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Eterotipica tridimensionale

Coltura del tessuto ovarico per visualizzare fenomeni nell'ovaia di Mouse

A Three-dimensional Tissue Culture modello per studiare Primario Osso Osseo e le sue Malignità

Una cultura Modello 3D Ormone-sensibile della Human ghiandola mammaria Epithelium

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all'interno di matrice extracellulare

Generazione di organoidi endometriali primari umani multicellulari

Strategia di coltura in vitro per oociti dal follicolo antralico precoce nel bestiame

Generazione di un sistema di coltura monostrato bidimensionale di derivazione enteroide primaria bovina per applicazioni nella ricerca biomedica traslazionale

Generazione di un sistema di coltura monostrato bidimensionale di derivazione enteroide primaria bovina per applicazioni nella ricerca biomedica traslazionale

Generazione di un sistema di coltura monostrato bidimensionale di derivazione enteroide primaria bovina per applicazioni nella ricerca biomedica traslazionale