Nous remercions Veronica Schreiter pour son excellente assistance technique et les modifications utiles du modèle de culture technique et cellule cryoconservation établies. En outre, nous aimerions remercier Maren Anders et Swanhild Rodewald pour leur excellente assistance technique dans l’analyse qui suit.

Remarque : Les ovaires Bovine ont été obtenues dans un abattoir commercial. La collecte des sous-produits de l’abattoir n’exige pas une approbation éthique selon le droit allemand.
1. Conditions de travail et préparations
<ol><li>Afin de garantir la stérilité, effectuer tous les supports et préparation du tissu, mais aussi toute la culture travaille dans un laboratoire de culture de cellules spécialisées à l’aide d’un banc de flux laminaire.</li>
	<li>Préparer 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4), additionnée de 100 UI de pénicilline, 0,1 mg/mL de streptomycine et 0,5 µg/µL amphotéricine pour le transport des ovaires. Remarque : La durée maximale entre la réception des ovaires et isoler le GC est de 2 h dans ce set-up.</li>
</ol>2. isolement des cellules de la Granulosa Bovine
<ol><li>
Laver les ovaires plusieurs fois dans du PBS 1 x (avec 100 UI de pénicilline, 0,1 mg/mL de streptomycine et 0,5 µg/µL amphotéricine) pour enlever le sang de la surface avant de commencer la procédure d’isolement. Utiliser un bécher, placer les ovaires à l’intérieur, remplissez-le avec du PBS 1 x et jeter les PBS à nouveau.
	<ol>
<li>Répétez cette étape de lavage 3 – 4 x, jusqu'à ce que les ovaires sont nettoyés de tout sang restant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Essuyer un ovaire utilisant un laboratoire imbibé d’alcool à 70 %, afin de minimiser les contaminations possibles.</li>
	<li>Avec une seringue de 3 mL et une aiguille 18 G, aspirer la GC par ponction des follicules de taille petite à moyenne (< 6 mm, mesuré avec une règle) et mettre en commun le liquide folliculaire dans un tube à centrifuger 50 mL. Remarque : Pour humidifier la seringue, prendre une petite quantité de PBS 1 x (avec 100 UI la pénicilline, 0,1 mg/mL de streptomycine et 0,5 µg/µL amphotéricine). Cela aide à percevoir de petits montants de liquide folliculaire et empêche les cellules de s’en tenir à l’intérieur de la seringue.</li>
	<li>Après perforation de plusieurs follicules, rincer la seringue et l’aiguille avec 1 x PBS pour le nettoyage intermédiaire.</li>
</ol>3. la cryoconservation des cellules
<ol><li>
Utiliser une coloration bleu trypan et compter les cellules sous un hémocytomètre.
	<ol>
<li>Pour compter le nombre de cellules viables, préparer un tube avec 1,5 µL d’une solution de bleu de trypan de 0,25 %. Remarque : Les cellules vivantes restera sans tache parce que le bleu trypan ne peut accéder à la barrière cellulaire des cellules mortes, qui apparaissent alors en bleu.</li>
		<li>Ajoutez 15 µL de la suspension de cellules de la granulosa à la solution de bleu de trypan et mélanger doucement.</li>
		<li>Placer le mélange dans les deux chambres un hémocytomètre. Compter le nombre de vie (p. ex., non souillées enregistré) de cellules dans une grande place par chambre. Remarque : Bien que certaines cellules sanguines peut être vu, ils se distingués par leur très petite taille.</li>
		<li>Calculer le nombre de cellules vivantes avec la moyenne des deux carrés de chambre selon les orientations générales ; la proportion de cellules vivantes peut varier entre ovaires mais devrait dépasser 60 %13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prélever un échantillon provenant du pool de cellules de granulosa fraîchement isolées comme une référence pour une analyse ultérieure.
	<ol>
<li>Selon le nombre d’éléments du CG isolé, mis de côté un nombre adéquat de cellules sous forme d’échantillons de référence pour ARN, ADN ou préparation de protéine. Remarque : Pour l’ARN et l’évaluation ultérieure de l’expression génique, 1 x 105 cellules sont suffisantes, alors que d’autres analyses subséquentes peuvent nécessiter le nombre de cellules différentes, généralement plus élevés.</li>
		<li>Placez une ou plusieurs parties aliquotes des cellules de référence dans un nouveau tube et il Centrifuger pendant 1 min à température ambiante et la vitesse maximale (12 000 x g) pour obtenir un culot cellulaire. Jeter le surnageant.</li>
		<li>Immédiatement-congélation des échantillons dans l’azote liquide. Conserver l’échantillon à-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Effectuer la cryoconservation comme suit.
	<ol>
<li>Préparer le milieu de congélation à l’aide de 80 % de sérum de veau foetal (FCS) et 20 % de diméthyl sulfoxide (DMSO).</li>
		<li>Pour doucement à pellets le GC, centrifuger le GC pendant 3 min à température ambiante et 500 x g.</li>
		<li>Retirez le surnageant soigneusement et doucement remettre les cellules en suspension dans 100 % FCS (p. ex., 1 mL) jusqu'à ce qu’aucune cellule plus massifs sont visibles.</li>
		<li>Ajouter 1 volume (p. ex., 1 mL) du médium gel préparé à la suspension cellulaire et transférer le mélange dans un flacon cryogénique. Remarque : La concentration finale des médias cryo-protection sera 90 % FCS et 10 % DMSO.</li>
		<li>Placez la cuvette cryogénique dans un conteneur de congélation (disponible dans le commerce) spécialisé qui empêche la congélation rapide. Le taux de refroidissement des échantillons ne doit pas dépasser-1 ° C/min. transfert du conteneur congélation dans un congélateur-80 ° C pendant au moins 4 h.</li>
		<li>Pour une conservation plus longue, placez les coupes cryogéniques dans les conteneurs d’ultra basse température (par exemple, conteneurs d’azote liquide phase). Remarque : Le protocole peut être arrêté ici, car la cryoconservation permet une conservation plus longue.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. préparation des supports et plaques de Culture pour la Culture cellulaire
<ol><li>
Enduire les plaques de culture cellulaire avec 0,02 % collagène R. Remarque : Le collagène R est connu pour être indispensable pour une meilleure saisie des GC dans la culture.<ol>
<li>Préparer une solution de R de collagène de 0,02 % à l’eau purifiée pour culture cellulaire.</li>
		<li>Ajouter 150 µL / puits dans une plaque 24 puits (= 2 cm2/bien) et s’assurer que la surface entière de la culture est bien couvert avec la solution de collagène R.</li>
		<li>Laissez la solution sécher avec le couvercle ouvert pendant quelques heures ou toute la nuit dans la hotte à flux laminaire.</li>
		<li>Lorsque les plaques de culture sont complètement sèches, elles irradient avec lumière UV pendant 10-15 min minimiser la contamination.</li>
		<li>Si nécessaire, stocker les plaques à 4 ° C pendant 2 mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer les médias et les suppléments pour la culture sous une hotte à flux laminaire. Pour une récupération réussie de la GC, elles doivent être traitées immédiatement après décongélation.</li>
	<li>
Préparer les supports suivants.
	<ol>
<li>Compléter un milieu essentiel α-Minimal (α-MEM) avec 2 mM de L-glutamine, bicarbonate de sodium de 0,084 %, 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA), 20 mM HEPES, sélénite de sodium 4 ng/mL, 5 transferrine µg/mL, 10 ng/mL d’insuline et des acides aminés non essentiels 1 mM.</li>
		<li>En outre, ajouter 100 UI la pénicilline et 0,1 mg/mL de streptomycine aux médias. Remarque : Les antibiotiques, une fois réchauffés, sont stables pendant environ 48 heures. Par conséquent, aliquote la quantité désirée de médias pour la mise en place de la culture et des médias prévues d’échange. Réchauffez seulement les aliquotes de médias à 37 ° C dans un bain d’eau. Les supports préparés peuvent être stockés à 4 ° C pendant pas plus de 3 mois.</li>
		<li>Pour induire l’activité stéroïde en élevage bovin GC, Supplément le α-MEM en outre avec l’hormone de 20 ng/mL folliculo - stimulante (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 et 2 µM androstènedione. NOTE : Toujours compléter ces composants peu avant le début d’un échange de culture ou des médias. Éviter les cycles de gel-dégel répétés pour des solutions mères FSH et d’IGF-1, car cela pourrait compromettre l’activité stéroïde.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cellule Culture travail
<ol><li>Décongeler les cellules rapidement dans un bain-marie à 37 ° C pendant 3 à 4 min et transférer la suspension cellulaire à 37 ° C préchauffé α-MEM (sans supplément d’hormone). Pour la centrifugation, un volume de 10 mL est recommandé.</li>
	<li>Centrifuger le GC pendant 3 min à température ambiante et à 500 x g. Jeter le surnageant. Ajouter le α-MEM préchauffé et complétée et remettre en suspension les cellules soigneusement.</li>
	<li>Semences du GC à une densité de 1 x 105 ou 1 x 106 cellules / puits dans un volume final de 500 µL. incluent réplicats techniques d’au moins trois puits de culture par l’État.</li>
	<li>Incuber la culture de cellules dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 8 jours.</li>
	<li>Effectuer un échange de médias tous les deux jours. Remplacer seulement les deux tiers des milieux de culture pour réduire le stress et pour faciliter l’adaptation des cellules pour les supports neufs. Remarque : Le CG forment un phénotype typique de fibroblastes-comme après quelques jours de culture et ont tendance à se regrouper ensemble. Dans la culture de cellule haute-densité, clusters plus importants sont trouvent plus fréquemment par rapport à la culture de densité normale GC (Figure 1, panneau de droite gauche vs ).</li>
</ol>6. analyse des cellules de la Granulosa cultivées
<ol><li>Pour effectuer une analyse des hormones stéroïdiennes, recueillir les médias et le congeler à-20 ° C. Utiliser des méthodes appropriées pour analyser la concentration d’estradiol et de progestérone dans le médias usé [par exemple, le dosage radio-immunologique (RIA)]14.</li>
	<li>Pour l’analyse ultérieure des molécules cibles différentes (ARN, ADN, protéines, etc.), lyser les cellules directement dans la boîte de Petri avec un agent de lyse approprié tel que recommandé par le fournisseur. Remarque : Pour la plupart des procédures d’isolement, il est possible d’arrêter le protocole ici, comme les cellules lysées peuvent être stockés à-20 ° C pendant 1 semaine. Une conservation plus longue, les cellules doivent être conservés à-80 ° C.</li>
	<li>Pour déterminer l’abondance de la transcription, synthèse de cDNA et mesurer les transcriptions précises par quantitative Real-Time polymerase chain réaction (qPCR) techniques15. Une évaluation statistique doit inclure au moins trois répétitions de cultures de cellules différentes, originaires de préparations de cellules différentes (réplique biologique).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro.">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li><li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture.">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li><li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex.">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li><li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resource:+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes.">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li><li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+between+freshly+isolated+and+spontaneously+immortalized+bovine+granulosa+cells:+protein+secretion,+steroid+metabolism,+and+responsiveness+to+growth+factors.">Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).</li><li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system:+induction+and+maintenance+of+estradiol+production,+response+to+follicle-+stimulating+hormone,+and+morphological+characteristics.">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li><li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media.">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li><li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell,+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited.">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li><li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro.">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li><li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells.">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells.">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li><li>Schneider, F., Br&#252;ssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts.">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li><li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density.">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage.">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).</li><li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions.">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li><li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le modèle de culture cellulaire présenté fournit un outil pour analyser la granulosa de différenciation cellulaire in vitro. Plusieurs études ont montré qu’une culture sans sérum est une condition sine qua non pour maintenir l’activité stéroïde en élevage bovin GC ou GC autres espèces8,9. En outre, revêtement de la boîte de Pétri avec les composants de la matrice extracellulaire (p. ex., collagène R)13, la fixation des cellules considérablement améliorée. Une autre caractéristique importante est la période de culture prolongée. Récemment, il a été démontré qu’une culture à long terme est nécessaire pour obtenir une activité stéroïdogène suffisante et une expression équilibrée de la granulosa cellule identité marqueurs17. Il semble que le GC nécessite le temps de récupérer du stress physique au cours de la procédure d’isolement.
Les suppléments de médias FSH, IGF-1 et l’androstènedione sont connus pour induire l’activité d’aromatase dans culture GC. En particulier, la supplémentation en androstènedione est absolument nécessaire, comme le GC besoin un précurseur pour la synthèse de l’estradiol. Cela a été publié précédemment11,18 et, par conséquence, n’a pas encore examiné au cours de la présente étude. Cependant, une adaptation des concentrations de l’androstènedione, IGF-1 et FSH peut être nécessaire pour les autres montages expérimentaux.
La technique de cryoconservation décrite ici peut aider à améliorer l’Organisation des expériences de culture de tissu en les rendant plus indépendantes de l’alimentation variable avec les ovaires. Selon des analyses précédentes, cryoconservation n’affecte pas le phénotype GC ou la production de stéroïdes dans la culture. En outre, l’abondance des transcriptions de marqueur dans les cellules cultivées n’a pas révélé des différences significatives en comparant les échantillons préparés à partir des cellules fraîchement isolées avec ceux précédemment soumises à la cryoconservation16.
Un paramètre déterminant pour le présent modèle de culture de GC est la cellule densité de placage. Comme en témoignent les Résultats de représentant, augmentant la densité placage induit des changements remarquables caractéristiques physiologiques et moléculaires. Plusieurs gènes sont régulés de manière spécifique, ressemblant à des changements qui sont induits par la stimulation de LH en vivo4,19. Le fait qu’une augmentation de la densité cellulaire peut piloter des processus de différenciation-comme dans l’élevage bovin GC est à considérer méticuleusement ce modèle de in vitro GC afin d’éviter des résultats contradictoires entre les répétitions. Par conséquent, des résultats contradictoires avec d’autres études pourraient être attribuées à des densités cellulaires différentes et doivent être examinées de plus près.
Le modèle de culture décrit ici révélé être irrecevable à LH, comme les transcriptions du récepteur LHCGR sont proches de la limite de détection. Par conséquent, une simulation de la LH tant la situation in vivo n’a provoqué aucune différenciation13. Néanmoins, ce modèle fournit un outil utile pour étudier l’estradiol active GC en culture primaire, en particulier car aucune fonctionnelle bovine GC lignes existent à l’heure actuelle.
Protocoles de traitement différents peuvent être testés dans le présent modèle de culture GC qui contribuent à élucider les mécanismes de régulation de la production de stéroïdes ou de différenciation de la GC. En outre, seul des facteurs qui participent au processus de développement peuvent être analysés séparément. Par conséquent, ce modèle de culture fournit une base pour de nombreuses applications.

Luteinization et ovulation réussie dépendent des altérations moléculaires finement à l’écoute et bien orchestrées dans types de différentes cellules folliculaires somatique. Étant donné que les détails de ces processus de développement ne sont pas encore bien compris, outre des précisions sont nécessaires. Des approches in vivo sont complexes et coûteuses et, en particulier, ne sont pas des mécanismes moléculaires spécifiques adresse qui se produisent au cours de la folliculogenèse. Par conséquent, réductionniste dans vitro modèles sont nécessaires en outre, pour donner un aperçu des détails cellulaires et moléculaires. Différentes études décrivent la culture des follicules ensemble dans le contexte de in vitro fertilization techniques1,2,3. Parce que les chercheurs s’intéressent aux mécanismes de la différenciation, de nombreuses études se concentreront sur GC folliculaire. Ces cellules, directement associées à l’ovocyte, sont les principales sources de production d’oestrogènes et, ainsi, jouent un rôle essentiel tout au long de la folliculogenèse et luteinization4.
Immortalisée cell lines de GC ont été développés de différentes espèces. La plupart d'entre eux, cependant, ne montre pas une suffisante hormone stéroïde production5. Jusqu'à présent, qu’une seule lignée de bovins que GC a été établie6, mais cette ligne a perdu son activité stéroïdogène après plusieurs passages7. C’est pourquoi, depuis la stéroïdogenèse et, en particulier, production d’estradiol est une caractéristique essentielle de la fonctionnalité de GC, il est conseillé d’étudier ces aspects dans les modèles de culture de cellules primaires. Dans des études antérieures, il a été démontré qu’une production considérable d’estradiol ne peut être observée sous des conditions de culture sans sérum8,9. Plus loin, lorsqu’il s’agit d’un précurseur de la synthèse de l’estradiol est une autre condition préalable, comme le GC ne parviennent pas à exprimer l’enzyme nécessaire qui peut convertir la progestérone en androstènedione10. De plus, l’effet synergique de FSH et IGF-1 supplementation in vitro ont démontré une activité optimisée de l’aromatase, l’enzyme clé de l’estradiol de synthèse11. Dans le présent protocole, les autres facteurs importants qui ont un impact important sur le modèle de culture de GC sont également décrites. En particulier, la cellule placage densité a des effets considérables sur les résultats de l’expérience de12. En outre, une technique de cryoconservation de GC bovine qui n’interfère pas significativement avec la physiologie de la GC dans la culture pourrait être créée. Cette technique permet d’améliorer l’Organisation des travaux de culture de cellules et d’optimiser la densité placage préféré.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 182-05</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin (250 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2612</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe (Omnifix Luer)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>Roth</td>
			<td>C724.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-preservation vials (2 ml)</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 89020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX cell freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture dish, 24-well, flat bottom</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen R (0.2 %)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>F 0915</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin (200 mM)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1713</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1603</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin (10 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516</td>
			<td>dissolved in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEA</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0293</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4021</td>
			<td>we prefer to use a stock solution of 2 &#181;g/ml, diluted in 0.9 % NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR3-IGF-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1146</td>
			<td>we use a stock solution of 2 &#181;g/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>androstenedione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46033</td>
			<td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

Cellules de la granulosa ovarienne (GC) sont la principale source de la synthèse de l’estradiol. Induite par l’augmentation pré-ovulatoire l’hormone lutéinisante (LH), les cellules de la thèque et, en particulier, de la couche de cellules de la granulosa profondément modifier leurs caractéristiques morphologiques, physiologiques et moléculaires et forment le corpus de la production de progestérone jaune qui est responsable du maintien de la grossesse. Modèles de culture de cellules sont des outils indispensables pour étudier les mécanismes de régulation sous-jacents impliqués dans la transformation folliculo-lutéale. Le protocole présenté met l’accent sur la méthode d’isolement et la cryoconservation des bovin GC de follicules de taille petite à moyenne (< 6 mm). Avec cette technique, on trouvera une population presque pure de GC. La procédure de cryoconservation facilite grandement le temps de gestion de la culture cellulaire fonctionner indépendamment de la fourniture de tissus (ovaires) direct primaire. Ce protocole décrit un modèle de culture sans sérum cellulaire qui imite le statut d’estradiol active de GC bovine. Des conditions importantes qui sont essentielles pour une culture réussie stéroïde-actif cellulaire sont discutées dans tout le protocole. Il est démontré qu’augmentant la densité de placage des cellules induit une réponse spécifique comme indiqué par une production de profil et de l’hormone d’expression gène altéré. En outre, ce modèle offre une base pour poursuivre ses études sur la différenciation des GC et autres applications.

GC plaqué à 1 x 105 cellules/puits Visualisez une apparence typique de fibroblastes car elles constituent un prolongement cellulaire comparable aux fibroblastes et ont tendance à construire des clusters (Figure 1 a et 1C). Augmente la densité bordé par un facteur 10 à 1 x 106 cellules/puits n’a pas changé la morphologie mais on peuvent observer plusieurs agrégats cellulaires (Figure 1 b et 1D, flèches). Comme déjà indiqué dans une publication précédente, la couche de collagène de la vaisselle de la culture a largement amélioré l’attachement des cellules13.
Cryoconservation initiale n’a pas considérablement changé les caractéristiques physiologiques des cellules en culture par rapport à celles cultivées directement des échantillons fraîchement isolées. Cela est montré dans la Figure 2 que l’abondance de transcription (mesuré par qPCR) du marqueur plusieurs gènes ne différaient pas quand en comparant des cellules dérivées de piscines soit congelés soit fraîchement isolées.
La figure 3 montre des résultats représentatifs de l’analyse de l’hormone stéroïde (mesuré par RIA) en GC bovine cultivée à normal vs haute densité. La concentration d’estradiol est significativement diminuée dans la culture haute densitée par rapport à la culture de densité normale, alors que la production de progestérone ont tendance à être plus élevé.
Une analyse comparative de plusieurs gènes (mesuré par qPCR) en haute - vs densité normale cultures révèle un effet significatif (Figure 4). CYP19A1, codant l’enzyme clé de l’aromatase biosynthèse d’estradiol, ainsi que le récepteur de gonadotrophine FSHR, étaient significativement diminuées. En revanche, les gènes RGS2 et VNN2 ont montré une régulation significative. Ces résultats indiquent clairement que les procédés spécifiques de la différenciation cellulaire sont induits en augmentant la cellule densité de placage.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Figure 1 : cultivé des cellules de la granulosa bovin normal (panneaux de gauche) et haute densité cellulaire (panneaux de droite). (a et c) cellules cultivées à une densité de 1 x 105 cellules/puits affichent un phénotype typique de fibroblastes-like. (b et d) GC cultivé à une densité de placage haut (1 x 106 cellules/puits) tendance à former des grappes de grandes cellules (flèches) plus fréquemment par rapport à des cellules dans une densité normale (panneau de gauche). Barreaux de l’échelle = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Figure 2 : comparaison des cellules cultivées directement après l’isolement et après cryoconservation. Les cellules sont cultivées à une densité de 1 x 105 cellules par puits. L’expression des gènes de plusieurs transcriptions de marqueur a été évaluée et a révélé aucune différence entre les cellules cultivées avec ou sans une cryoconservation initiale. La boxplot montre la médiane de n = 3. De l’étudiant à deux t-test, les p-valeurs sont incluses. Cette figure est reproduite de Baufeld et Véronique16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Figure 3 : concentration d’hormones stéroïdes dans les cellules de la granulosa cultivées à placage à différentes densités. La concentration d’oestradiol (E2) diminue significativement quand GC ont été cultivées à une densité cellulaire élevée, alors que la concentration de progestérone (P4) seulement tendance à être plus élevé. La concentration de l’hormone a été corrigée pour le contenu en ADN normaliser pour nombre de cellules différentes. La moyenne et la SEM de n = 3 sont indiquées. p > 0,05, à deux points de l’étudiant t-test. Cette figure est reproduite de Baufeld et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Figure 4 : Abondance de fonctionnels clés transcrits dans les cellules de la granulosa cultivées à une normale par rapport à une densité placage haut. Bovine GC cultivée dans des conditions sans sérum pendant 8 jours ont révélé un règlement spécifique de plusieurs gènes sélectionnés. La boxplot affiche la valeur médiane de n = 3 répétitions individuelles. p < 0,05, à deux points de l’étudiant t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

On décrit un modèle de culture à long terme des cellules de la granulosa bovine dans des conditions sans sérum. Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier les effets de divers facteurs et conditions comme placage à différentes densités sur les caractéristiques de la production d’oestrogène les cellules granuleuses bovine.

Un modèle de Culture tissulaire d’oestrogène-production primaire Bovine Granulosa cellules

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

a-tissue-culture-model-estrogen-producing-primary-bovine-granulosa

Research

JoVE Journal

Biology

9.0K vues.  Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN). On décrit un modèle de culture à long terme des cellules de la granulosa bovine dans des conditions sans sérum. Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier les effets de divers facteurs et conditions comme placage à différentes densités sur les caractéristiques de la production d’oestrogène les cellules granuleuses bovine.

Vidéo: A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Recherche

Biologie

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

Culture primaire de cellules Corticosurrénaliennes Rat et tests des fonctions Stéroïdogéniques

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique tissue important for proper function of the synovial joint and is constituted by a dense extracellular matrix (ECM), rich in proteoglycan and type II collagen. Chondrocytes are the only cell type present within cartilage and are widespread and relatively low in number. Altered external stimuli and cellular signalling can lead to changes in ECM composition and deterioration, which are important pathological hallmarks in diseases such as osteoarthritis (OA) and rheumatoid arthritis.
Ex vivo cartilage models allow 1) profiling of chondrocyte mediated alterations of cartilage tissue turnover, 2) visualizing the cartilage ECM composition, and 3) chondrocyte rearrangement directly in the tissue. Profiling these alterations in response to stimuli or treatments are of high importance in various aspects of cartilage biology, and complement in vitro experiments in isolated chondrocytes, or more complex models in live animals where experimental conditions are more difficult to control.
Cartilage explants present a translational and easily accessible method for assessing tissue remodeling in the cartilage ECM in controllable settings. Here, we describe a protocol for isolating and culturing live bovine cartilage explants. The method uses tissue from the bovine knee, which is easily accessible from the local butchery. Both explants and conditioned culture medium can be analyzed to investigate tissue turnover, ECM composition, and chondrocyte function, thus profiling ECM modulation.

Here, we present a protocol describing isolation and culturing of cartilage explants from bovine knees. This method provides an easy and accessible tool to describe tissue changes in response to biological stimuli or novel therapeutics targeting the joint.

Un modèle de culture de tissu d'Ex Vivo du cartilage transformant dans les explants de genou de bovine

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Collection de tissus de chauves-souris pour -Analyses d'omics et culture cellulaire primaire

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Induction et détection d'apoptosis dans une culture primaire des cellules intestinales de concombre de mer

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Culture de tissu du cortex ovarien bovin

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Culture primaire de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes porcines

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...