שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח ובתחומי המחקר המסורתיים של רפואת הפה על הקרנה של תרכובות טבעיות נוירו-פרוטקטיביות הרלוונטיות למודל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי producibility גבוה יותר של נפח הזיהום הוא בהתאם מינון תזמון איסכמי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כפי שהוא אופייני להכניס יישום דק מאוד לתוך העורק המקורי, המוח הקטן באמצע באמצעות מיקרוסקופ סטרילי.
הדגמת ההליך תהיה Se-Eun לי, תלמיד בית ספר בכיתה לומד במעבדה שלי. כדי להכין את תמצית Glycyrrhizae Radix et Rhizome, או GRex, תחילה להוסיף 200 גרם של Glycyrrhizae Radix et Rhizome, או GR, לשני ליטרים של מתנול עבור דגירה של חמישה ימים בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מסננים את הפתרון באמצעות נייר מסנן בעובי 0.26 מ"מ עם גודל נקבובית של חמישה מיקרומטר.
הוסף את שאריות GR לליטר אחד של מתנול טרי, וסנן את הפתרון שוב. שלב את שני filtrates, ומאמץ אותם דרך פיסת נייר סינון חדשה. לאחר מכן לרכז את התמצית תחת ואקום לפני הקפאה ייבוש כדי לייצר GRex.
כדי להכין את GRex לניהול, להמיס את המוצר מיובש בהקפאה ב dimethylsulfoxide, ולדלל את התערובת עם 0.9% מלוחים פיזיולוגיים. לאחר מכן סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר, ולהתאים את הריכוז הסופי של DMSO לפחות מ 5%כדי להגדיר מודל העורק המוחי באמצע העכבר, או MCAO, לאשר חוסר תגובה לגירוי הזנב ב 22-25 גרם זכר C57BL/6 עכבר, ולמקם את העכבר על 36.5 מעלות צלזיוס טמפרטורת הגוף מחזיק שמיכה, מחובר לאחר הסרת כל השיער מן החזה והצוואר של העכבר על ידי גילוח קרם depilatory, מניחים את העכבר תחת stereomicroscope ולעשות חתך בעור שני סנטימטרים במרכז הצוואר.
מבודדים בזהירות את העורק הראשי המשותף השמאלי, את העורק הראשי החיצוני ואת ענף העורק הראשי הפנימי מרקמות החיבור שמסביב, ולהשתמש בתפר משי 4.0 כדי לקשור את העורק הראשי החיצוני ואת העורק הראשי המשותף עם קשר חצי תקלה כדי לחסום באופן זמני את זרימת הדם לתוך העורק הראשי הפנימי. הכנס 0.1 עד 0.12 מילימטר עבה 11 מילימטר ארוך סיליקון מצופה 8.0-monofilament 4.0-תפר משי דרך העורק הראשי הפנימי למקור של עורק המוח באמצע שמאל, ולהשתמש מד זרימה דופלר לייזר כדי למדוד את הירידה עורק זרימת הדם המוחית יחסית. לתקן את התסיסה מוכנס לכלי הדם במשך שעתיים בעוד העורק המוחי הוא occluded.
בסוף תקופת ההסחה, בזהירות למשוך את התסיסה כדי לשחזר את זרימת הדם במשך 22 שעות של רפרפוזיה. ולהשתמש בתפרים משי 3.0 כדי לתפור את העור בחמישה מקומות עם שני קשרים חצי תקלות. ואז להחזיר את העכבר לכלוב שלה להתאוששות הרדמה.
שעה לאחר תום ההתהשלכות, יש לתת 300 מיליגרם לקילוגרם משקל גוף GRex לבעלי החיים הניסיוניים, רק באמצעות גבאז' אוראלי. 24 שעות לאחר תחילת MCAO, לעשות חתך בעור האמצעי של הראש של כל חיה ניסיונית, ולשבור את העצמותקודיות עם מטלפים זוויתיים, תוך קילוף את מאטר דורה. מבודדים בזהירות את המוח מהגולגולת, ולהשתמש במטריצת מוח של עכבר כדי לחתוך את הרקמה המגולקת לחלקים בעובי של מילימטר אחד.
הכתם את המקטעים במשך 17 דקות בפתרון 2%TTC, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. ולתקן את הסעיפים ב 10% פורמלין לפחות 2 שעות לפני הדמיה הדגימות עם מצלמה דיגיטלית. לאחר מכן לנתח ולמת את האזור אוטם מוחי של כל קטע באמצעות ImageJ.
בנקודת הזמן הניסיונית המתאימה שלאחר מקאו, תפלל כל חיה ניסיונית המתת דם באופן טרנסקרדיאלי עם 10 מיליליטר של PBS, ואחריו 10 מיליליטר של 4% paraformaldehyde. לאחר בידוד המוח כפי שהוכח רק, לטבול את האיברים שנקטפו 10 מיליליטר של 30% סוכרוז לילה. למחרת בבוקר, להטמיע את דגימות רקמת המוח בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית.
וחותכים את הרקמות לחתיכות בעובי 15 מיקרומטר על צירוסטאט. הר את החלקים על מגלשות זכוכית וטביע את החלקים ב 80%אתנול במשך דקה אחת. עבור כתמי H&E, סמן את הדגימות בתת פתרון Hematoxylin במשך 5 דקות, ואחריו שני מטבלים ב 1% אלכוהול חומצה.
לאחר מכן, לטבול את השקופיות בתווית ליתיום קרבונט רווי במשך 30 שניות, ואחריו לשטוף 30 שניות במי ברז, ו 30 שניות של כתם נגדי עם פתרון Eosin. הסר את תסכול האאוסין העודף עם שטיפת מי ברז, וייבש את המגלשות עם טבילות עולות של דקה אחת ב-95 ואז 100%אתנול. לאחר מכן, airdry את השקופיות, לנקות אותם קסילן לפחות 10 דקות, ולהרים את כיסויים עם מדיום הרכבה.
עבור כתמים סגולים cresyl, למקם את שקופיות 80%אתנול מטופלים על שקופית חם במשך שעה אחת לפחות, ואחריו טבילה 50% אתנול מדולל עם כלורופורם לילה. למחרת בבוקר, להכתים את המגלשות עם 0.1% cresyl סגול במשך 10 דקות בתנור יבש 40 מעלות צלזיוס, ואחריו התייבשות ב 95% אתנול במשך 30 דקות, ושתי חמש דקות 100% טבילות אתנול. לאחר מכן, לנקות את השקופיות שתי טבילות קסילן חמש דקות, ואחריו ייבוש אוויר.
לאחר מכן תן את השקופיות עם מדיום הרכבה להדמיה על-ידי מיקרוסקופיה קלה. בקבוצות נורמליות המופעלות על ידי תרמית, לא נצפתה אוטם מוחי;ואילו בשליטה, בעלי חיים MCAO מטופלים, מגוון רחב יחסית של אזורים פגומים נצפתה. בעכברי מודל שטופלו ב-GRex ב-300 מיליגרם לקילוגרם, נצפית ירידה מובהקת סטטיסטית ברקמה הפגועה.
ניתוח היסטולוגי של קטעי רקמות מוכתמות H&E וקרסיל סגול מספק אינדקס של הישרדות תאים. ואכן, ה-H&E ו-cresyl Violet מכתימים את הלחץ באופן משמעותי בשליטה, קבוצת MCAO לא מטופלת ביחס לקבוצה הנורמלית המופעלת על ידי זיופים. בעלי החיים שטופלו ב-GRex, לעומת זאת, מפגינים שלמות היסטולוגית גדולה יותר, מה שמרמז על מוות תאי פחות עצבי מאשר הקבוצות המופקדות, הלא מטופלות והתפעול המזויף, מה שמרמז על השפעה נוירו-פרוטקטיבית חזקה של התמצית נגד פגיעה מוחית הנגרמת על ידי כתוצאה מזיכומיה.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לפקח על זרימת הדם המוחית היחסית במהלך תקופה זו. ומוליכי תהליכים בזהירות רבה כדי למזער את הנזקים לשכבות ה אנדותל של
