Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la recherche en neurosciences et en médecine buccale traditionnelle sur le dépistage des composés naturels neuroprotecteurs pertinents au modèle. Le principal avantage de cette technique est que la production plus élevée du volume d’infection est conforme à la dose de synchronisation ischémique. Démonstration visuelle de cette méthode est critique car il est typique d’insérer un outil très mince dans l’original, l’artère cerebellar moyen à l’aide d’un microscope stérile.
La démonstration de la procédure sera Se-Eun Lee, un élève de première année qui étudie dans mon laboratoire. Pour préparer l’extrait de Glycyrrhizae Radix et Rhizome, ou GRex, ajoutez d’abord 200 grammes de Glycyrrhizae Radix et Rhizome, ou GR, à deux litres de méthanol pour une incubation de cinq jours à température ambiante. À la fin de l’incubation, filtrer la solution à travers du papier filtre de 0,26 millimètre d’épaisseur avec une taille de pore de cinq micromètres.
Ajouter les résidus gr à un litre de méthanol frais, et filtrer la solution à nouveau. Combinez les deux filtrates et filtrez-les à travers un nouveau morceau de papier filtre. Ensuite, concentrez l’extrait sous vide avant de le congeler pour produire du GRex.
Pour préparer le GRex à l’administration, dissoudre le produit lyophilisé dans du diméthylsulfoxyde et diluer le mélange avec une solution saline physiologique de 0,9 %. Filtrez ensuite la solution à travers un filtre à seringues de 0,45 micromètre, et ajuster la concentration finale de DMSO à moins de 5 % Pour mettre en place un modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne de la souris, ou MCAO, confirmer un manque de réactivité au stimulus de la queue dans une souris mâle de 22 à 25 grammes de 22 à 25 grammes, et placer la souris sur une couverture de fixation de température corporelle de 36,5 degrés Celsius, reliée à un thermomètre. Après avoir enlevé tous les cheveux de la poitrine et du cou de la souris en rasant et en dépilant la crème, placez la souris sous un stéréomicroscope et faites une incision cutanée de deux centimètres au centre du cou.
Isoler soigneusement l’artère carotide commune gauche, l’artère carotide externe, et la branche de l’artère carotide interne des tissus conjonctifs environnants, et employer une suture de 4,0 soie pour ligate l’artère carotide externe et l’artère carotide commune avec un noeud de demi-attelage pour bloquer temporairement le flux sanguin dans l’artère carotide interne. Insérez une suture de 0,1 à 0,12 millimètre d’épaisseur de 11 millimètres de long recouverte de silicone de 8,0 monofilaments 4,0 de soie à travers l’artère carotide interne à l’origine de l’artère cérébrale moyenne gauche, et utilisez un débitmètre laser Doppler pour mesurer la diminution de l’artère sanguine cérébrale relative. Fixer le filament inséré au vaisseau sanguin pendant deux heures pendant que l’artère cérébrale est occluse.
À la fin de la période d’occlusion, retirez soigneusement le filament pour rétablir le flux sanguin pendant 22 heures de reperfusion. Et utilisez des sutures de soie 3.0 pour suturer la peau en cinq endroits avec deux demi-nœuds d’attelage. Ensuite, retournez la souris dans sa cage pour une récupération anesthésique.
Une heure après la fin de la reperfusion, administrer 300 milligrammes par kilogramme de poids corporel GRex aux animaux expérimentaux, seulement par gavage oral. 24 heures après le début du MCAO, faire une incision dans la peau du milieu de la tête de chaque animal expérimental, et briser les os pariétals avec des forceps inclinés, tout en épluchant le mater dura. Isolez soigneusement le cerveau du crâne et utilisez une matrice cérébrale de souris pour couper le tissu excisé en sections d’un millimètre d’épaisseur.
Tacher les sections pendant 17 minutes dans la solution 2%TTC, selon les protocoles standard. Et fixer les sections en formaline à 10% pendant au moins 2 heures avant d’imaginer les échantillons avec un appareil photo numérique. Ensuite, analyser et quantifier la zone infarctus cérébrale de chaque section à l’aide d’ImageJ.
Au point de temps expérimental approprié post-MCAO, perfuser chaque animal expérimental euthanasié transcardially avec 10 millilitres de PBS, suivi de 10 millilitres de 4% paraformaldéhyde. Après avoir isolé le cerveau comme il vient de le démontrer, immerger les organes récoltés dans 10 millilitres de saccharose 30% pendant la nuit. Le lendemain matin, intégrir les échantillons de tissu cérébral dans le composé optimal de température de coupe.
Et couper les tissus coronally en sections de 15 micromètres d’épaisseur sur un cyrostat. Montez les sections sur des glissières en verre et submergez les sections dans 80% d’éthanol pendant 1 minute. Pour la coloration H&E, étiquetez les échantillons avec la solution Hématoxyline pendant 5 minutes, suivis de deux trempettes dans de l’alcool acide à 1 %.
Ensuite, immerger les diapositives dans la solution saturée de carbonate de lithium pendant 30 secondes, suivie d’un lavage de 30 secondes dans l’eau du robinet, et 30 secondes de contre-coloration avec la solution Eosin. Retirez l’excès de solution Eosin à l’aide d’un lavage à l’eau du robinet et déshydratez les glissières avec des immersions ascendantes d’une minute dans 95 puis 100 % d’éthanol. Ensuite, aérodry les diapositives, les effacer en xylène pendant au moins 10 minutes, et monter les coverslips avec le milieu de montage.
Pour les taches de violette cresyl, placez les glissières traitées à 80 % à l’éthanol sur un chauffe-glissière pendant au moins une heure, suivies d’une immersion dans 50 % d’éthanol dilué avec du chloroforme pendant la nuit. Le lendemain matin, tacher les toboggans avec 0,1% de violette cresyl pendant 10 minutes dans un four sec de 40 degrés Celsius, suivie d’une déshydratation à 95% d’éthanol pendant 30 minutes, et de deux immersions de cinq minutes à 100% éthanol. Ensuite, dégagez les diapositives deux immersions de xylène de cinq minutes, suivies d’un séchage à l’air.
Montez ensuite les diapositives avec un support de montage pour la visualisation par microscopie légère. Dans les groupes normaux simulés, aucun infarctus cérébral n’est observé; tandis que chez les animaux MCAO témoins et non traités, on observe un éventail relativement large de zones endommagées. Chez les souris modèles traitées au GRex de 300 milligrammes par kilogramme, on observe une réduction statistiquement significative des tissus endommagés.
L’analyse histologique des sections h&e et crésyl des tissus tachés de violette fournit un indice de survie cellulaire. En effet, les intensités de coloration de violette de H&E et de cresyl diminuent sensiblement dans le groupe témoin, non traité de MCAO par rapport au groupe normal sham-operated. Les animaux GRex-traités, d’autre part, montrent une plus grande intégrité histologique, impliquant moins de mort neuronale de cellules que les deux groupes de contrôle, non traités et sham-operated, suggérant un effet neuroprotecteur puissant de l’extrait contre des dommages de cerveau reperfusion-induits d’ischémie.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de surveiller le flux sanguin cerebellar relatif pendant cette période. Et les conducteurs de processus très soigneusement pour minimiser les dommages aux couches endothéliales de la
