Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Neurowissenschaft und traditionellen oralen Medizin Forschungsfelder über Screening für neuroprotektive natürliche Verbindungen relevant für das Modell zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die höhere Produzierbarkeit des Infektionsvolumens in Übereinstimmung mit ischämischer Timing-Dosis ist. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es typisch ist, ein sehr dünnes Gerät mit einem sterilen Mikroskop in das Original, die mittlere Kleinhirnarterie, einzufügen.
Demonstriert wird das Verfahren von Se-Eun Lee, einer Klasse, die in meinem Labor studiert. Um den Glycyrrhizae Radix et Rhizome Extrakt, oder GRex vorzubereiten, fügen Sie zuerst 200-Gramm Glycyrrhizae Radix et Rhizome, oder GR, zu zwei LiterMethanol für eine fünftägige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Am Ende der Inkubation die Lösung durch 0,26 Millimeter dickes Filterpapier mit einer Porengröße von fünf Mikrometern abseihen.
Fügen Sie den GR-Rückstand in einen Liter frisches Methanol ein und filtern Sie die Lösung erneut. Kombinieren Sie die beiden Filtrate und belasten Sie sie durch ein neues Stück Filterpapier. Konzentrieren Sie den Extrakt dann unter Vakuum, bevor Sie die Trocknung einfrieren, um GRex zu produzieren.
Um den GRex für die Verabreichung vorzubereiten, lösen Sie das gefriergetrocknete Produkt in Dimethylsulfoxid auf und verdünnen Sie das Gemisch mit 0,9% physiologischer Salzin. Filtern Sie die Lösung dann durch einen 0,45-Mikrometer-Spritzenfilter, und stellen Sie die endgültige Konzentration von DMSO auf weniger als 5%Um eine Maus mittlere Zerebralparese Okklusion Modell, oder MCAO, bestätigen einen Mangel an Reaktion auf Schwanz Stimulus in einem anästhesierten sechs Wochen alten 22 bis 25-Gramm-Männchen C57BL/6 Maus, und legen Sie die Maus auf eine 36,5-Grad-Celsius Körpertemperatur-Haltedecke, verbunden mit einem Thermometer. Nachdem Sie alle Haare von der Brust und dem Hals der Maus durch Rasier- und Enthaarungscreme entfernt haben, legen Sie die Maus unter ein Stereomikroskop und machen Sie einen zwei Zentimeter großen Hautschnitt in der Mitte des Halses.
Isolieren Sie vorsichtig die linke gemeine Halsschlagader, die äußere Halsschlagader und den Ast der inneren Halsschlagader von den umgebenden Bindegeweben, und verwenden Sie eine 4,0-Seidennaht, um die äußere Halsschlagader und die gemeinsame Halsschlagader mit einem Halbschlagknoten vorübergehend zu blockieren, um den Blutfluss in die innere Karotisarterie vorübergehend zu blockieren. Legen Sie eine 0,1 bis 0,12 Millimeter dicke 11 Millimeter lange silikonbeschichtete 8,0-Monofilament-Nähte 4,0-Seiden durch die innere Halsschlagader zum Ursprung der linken mittleren Hirnarterie ein und verwenden Sie einen Laser-Doppler-Durchflussmesser, um die Abnahme der relativen zerebralen Blutflussarterie zu messen. Fixieren Sie das eingelegte Filament für zwei Stunden am Blutgefäß, während die Hirnschlagader verschlossen ist.
Am Ende der Okklusionszeit ziehen Sie das Filament sorgfältig zurück, um den Blutfluss für 22 Stunden Reperfusion wiederherzustellen. Und verwenden Sie 3,0-Seiden-Nähte, um die Haut an fünf Stellen mit zwei halben Knötchen Knoten zu verneinen. Dann kehren Sie die Maus in ihren Käfig für die Anästhesie-Wiederherstellung zurück.
Eine Stunde nach dem Ende der Reperfusion, verabreichen 300 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht GRex an die Versuchstiere, nur durch orale Gavage. 24 Stunden nach dem Beginn von MCAO, machen Einen Schnitt in der mittleren Haut des Kopfes jedes Versuchstiers, und brechen Sie die parietalen Knochen mit abgewinkelten Zangen, während Sie die Dura mater abschälen. Isolieren Sie das Gehirn vorsichtig vom Schädel und verwenden Sie eine Maus-Gehirnmatrix, um das ausgeschnittene Gewebe in ein Millimeter dicke Abschnitte zu schneiden.
Stain die Abschnitte für 17 Minuten in 2%TTC-Lösung, nach Standard-Protokolle. Und fixieren Sie die Abschnitte in 10%formalin für mindestens 2 Stunden, bevor Sie die Proben mit einer Digitalkamera bebildern. Analysieren und quantifizieren Sie dann den Hirninfarktbereich jedes Abschnitts mit ImageJ.
Zum entsprechenden Versuchszeitpunkt nach der MCAO durchdringen Sie jedes eingeschläferte Versuchstier transkardial mit 10 MilliliterPBS, gefolgt von 10 Millilitern 4%Paraformaldehyd. Nachdem Sie die Gehirne isoliert haben, wie gerade gezeigt, tauchen Sie die geernteten Organe über Nacht in 10-Milliliter von 30% Saccharose ein. Am nächsten Morgen, einbetten Sie die GehirngewebeProben in optimale Schnitttemperatur Verbindung.
Und schneiden Sie das Gewebe koronal in 15 Mikrometer dicke Abschnitte auf einem Cyrostat. Montieren Sie die Abschnitte auf Glasrutschen und tauchen Sie die Abschnitte 1 Minute lang in 80% Ethanol ein. Für H&E Färbung die Proben mit Hematoxylin-Lösung für 5 Minuten, gefolgt von zwei Dips in 1%säurealkohol.
Als nächstes tauchen Sie die Dias für 30 Sekunden in gesättigte Lithiumcarbonat-Lösung ein, gefolgt von einer 30-Sekunden-Wäsche in Leitungswasser und 30 Sekunden Gegenfärbung mit Eosin-Lösung. Entfernen Sie die überschüssige Eosin-Lösung mit einer Leitungswasserwäsche, und dehydrieren Sie die Dias mit einminütigen aufsteigenden Eintauchen in 95 dann 100% Ethanol. Anschließend die Dias lüften, mindestens 10 Minuten in Xylol löschen und die Abdeckungen mit Montagemedium montieren.
Für Cresylviolett-Färbung die 80%Ethanol-behandelten Dias mindestens eine Stunde lang auf einen Rutschwärmer legen, gefolgt von einem Eintauchen in 50% Ethanol, das über Nacht mit Chloroform verdünnt wird. Am nächsten Morgen die Dias mit 0,1% Cresylviolett für 10 Minuten in einem 40-Grad-Celsius-Trockenofen, gefolgt von einer Austrocknung in 95% Ethanol für 30 Minuten und zwei fünfminütigen 100%Ethanol-Eintauchen. Als nächstes löschen Sie die Dias zwei fünfminütige Xylol-Eintauchen, gefolgt von der Lufttrocknung.
Dann montieren Sie die Dias mit Montagemedium zur Visualisierung mittels Lichtmikroskopie. In scheinbetriebenen normalen Gruppen wird kein Hirninfarkt beobachtet; während bei der Kontrolle unbehandelte MCAO-Tiere eine relativ breite Palette von geschädigten Bereichen beobachtet werden. Bei 300 Milligramm pro Kilogramm GRex-behandelter Modellmäuse wird eine statistisch signifikante Reduktion des geschädigten Gewebes beobachtet.
Die histologische Analyse der H&E- und Cresylviolett-gefärbten Gewebeabschnitte liefert einen Index des Zellüberlebens. Tatsächlich verringern h&E und Cresylviolett-Färbungsintensitäten in der Kontrollgruppe, der unbehandelten MCAO-Gruppe im Vergleich zur scheinbetriebenen normalen Gruppe, signifikant. Die GRex-behandelten Tiere hingegen weisen eine größere histologische Integrität auf, was weniger neuronalen Zelltod impliziert als die Kontroll-, unbehandelte und scheinbetriebene Gruppen, was auf eine starke neuroprotektive Wirkung des Extrakts gegen ischmiareperfusionsinduzierte Hirnverletzungen hindeutet.
Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, den relativen Kleinhirn-Blutfluss während dieser Zeit zu überwachen. Und Leiter von Prozessen sehr sorgfältig, um Schäden an den endotheliale Schichten der
