이 방법은 모델과 관련된 신경 보호 천연 화합물에 대한 스크리닝에 대한 신경 과학 및 전통적인 구강 의학 연구 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 감염 부피의 높은 확률성이 허혈성 타이밍 복용량에 따른다는 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 멸균 현미경을 사용하여 원래, 중간 소뇌 동맥에 매우 얇은 구현을 삽입하는 것이 일반적이기 때문에 중요합니다.
이 절차를 시연하는 것은 제 실험실에서 공부하는 학교 학생인 이세은이될 것입니다. 글리시리자에 라딕스 에 Rhizome 추출물 또는 GRex를 준비하려면 먼저 200그램의 글리시리자에 라딕스 에 리조메(GR)를 실온에서 5일 간 배양하기 위해 메탄올 2리터에 넣습니다. 인큐베이션의 끝에서, 5 마이크로 미터 모공 크기로 0.26 밀리미터 두께의 필터 용지를 통해 솔루션을 변형.
GR 잔류물을 신선한 메탄올 1리터에 넣고 솔루션을 다시 필터링합니다. 두 개의 여과를 결합하고 새로운 필터 용지를 통해 변형시면 됩니다. 그런 다음 동결 건조 전에 진공 상태에서 추출물을 농축하여 GRex를 생산합니다.
GRex를 투여하기 위해 동결 건조 된 제품을 디메틸 설플옥사이드에 녹이고 혼합물을 0.9 %의 생리적 식염수로 희석하십시오. 그런 다음 0.45 마이크로미터 주사기 필터를 통해 용액을 필터링하고, DMSO의 최종 농도를 5% 미만으로 조정하여 마우스 중간 뇌동맥 폐색 모델 또는 MCAO를 설정하고, 마취6주 된 22~25그램 남성 C57BL/6 마우스에서 꼬리 자극에 반응성이 없음을 확인하고, 마우스를 36.5도 의 온도에 연결하여 열계에 연결시켰다. 면도 및 탈약 크림에 의해 마우스의 가슴과 목에서 모든 머리를 제거 한 후, 스테레오 현미경 아래에 마우스를 배치하고 목의 중심에 2 센티미터 피부 절개를합니다.
왼쪽 공통 경동맥, 외부 경동맥 및 내부 경동맥을 주변 결합 조직으로부터 조심스럽게 분리하고, 4.0 실크 봉합사를 사용하여 외부 경동맥과 일반적인 경동맥을 반히치 매듭으로 분리하여 내부 경동맥으로의 혈류를 일시적으로 차단한다. 0.1~0.12밀리미터 두께의 11mm 길이의 실리콘 코팅 8.0-모노피라멘트 4.0 실크 봉합사를 내부 경동맥을 통해 좌중뇌동맥의 기원까지 삽입하고, 레이저 도플러 유량계를 사용하여 상대대뇌 혈류 동맥의 감소를 측정한다. 뇌동맥이 가려지는 동안 삽입된 필라멘트를 혈관에 2시간 동안 고정합니다.
폐색 기간이 끝나면 필라멘트를 조심스럽게 철회하여 22시간 동안 혈류를 회복합니다. 그리고 3.0 실크 봉합사를 사용하여 두 개의 반 히치 매듭이있는 5 개 소에서 피부를 봉합합니다. 그런 다음 마취 복구를 위해 마우스를 케이지로 반환합니다.
레퍼퓨전이 끝난 후 1시간 후, 킬로그램당 체중 GRex를 실험 동물에게 투여하면 구강 개비에 의해서만 투여하십시오. MCAO가 발병한 지 24시간 후, 각 실험 동물의 머리 의 중간 피부에 절개를 하고, 각진 집게로 정수리 뼈를 부러뜨리고, 두라 메이트를 벗겨냅니다. 조심스럽게 두개골에서 뇌를 분리하고, 마우스 뇌 매트릭스를 사용하여 절제된 조직을 1mm 두께의 섹션으로 자른다.
표준 프로토콜에 따르면 2% TTC 솔루션에서 17분 동안 섹션을 얼룩지게 합니다. 그리고 디지털 카메라로 샘플을 이미징하기 전에 적어도 2 시간 동안 10 % 포르말린으로 섹션을 수정합니다. 그런 다음 ImageJ를 사용하여 각 섹션의 대뇌 경색 영역을 분석하고 정량화합니다.
적절한 실험 시점 포스트 MCAO에서 각 안락사 된 실험 동물트랜스카디어와 PBS의 10 밀리리터, 4 %의 파라 포름알데히드의 10 밀리리터가 뒤따릅니다. 방금 입증 된 대로 뇌를 고립 한 후, 수확 된 장기를 10 밀리리터에 하룻밤 사이에 담급하십시오. 다음 날 아침, 최적의 절삭 온도 화합물에 뇌 조직 샘플을 포함.
그리고 조직을 시로스타트의 15마이크로미터 두께섹션으로 관상으로 슬라이스합니다. 유리 슬라이드에 섹션을 마운트하고 1 분 동안 80 %에탄올에 섹션을 잠급니다. H&E 염색의 경우, 헤마톡시린 용액으로 샘플을 5분간 라벨링한 다음 1%의 산성 알코올로 2회 딥을 넣습니다.
다음으로, 포화 리튬 탄산염 용액에 슬라이드를 30초 간 담그고, 수돗물로 30초 세척하고, 에오신 용액으로 30초의 반염색을 합니다. 수돗물로 과도한 Eosin 용액을 제거하고 1 분 상승 몰입으로 슬라이드를 탈수 한 다음 100 % 에탄올. 그런 다음 슬라이드를 에어드라이하고 자일렌으로 10분 이상 청소하고 장착 매체로 커버립을 장착합니다.
크레실 바이올렛 염색의 경우 80% 에탄올 처리 슬라이드를 슬라이드 워머에 1시간 이상 놓고, 하룻밤 사이에 클로로폼으로 희석된 50%에탄올에 침지합니다. 다음날 아침, 40도 건조 오븐에서 10분 동안 0.1%의 크레실 바이올렛으로 슬라이드를 염색하고, 30분 동안 95%에탄올로 탈수, 5분 100% 에탄올 몰입도가 있습니다. 다음으로, 슬라이드 25분 자일렌 몰입을 제거하고 공기 건조를 합니다.
그런 다음 가벼운 현미경으로 시각화를 위해 장착 매체로 슬라이드를 장착합니다. 가짜 작동 정상 그룹에서는 대뇌 경색이 관찰되지 않습니다.대조군, 치료되지 않은 MCAO 동물은 상대적으로 광범위한 손상된 영역이 관찰됩니다. 킬로그램 GRex 처리 모형 마우스 당 300 밀리그램에서, 손상된 조직에 있는 통계적으로 유의한 감소가 관찰됩니다.
H&E 및 크레실 바이올렛 스테인드 조직 섹션의 조직학적 분석은 세포 생존지수를 제공한다. 실제로, H&E와 크레실 바이올렛 스테인딩 강도는 대조군에서 현저히 감소하며, 처리되지 않은 MCAO 그룹은 샴 조작 된 정상 그룹에 비해. GRex 처리된 동물은, 다른 한편으로는, 더 중대한 조직학적 무결성을 전시합니다, 대조군, 처리되지 않은 및 sham 조작 단 둘 다 보다는 더 적은 신경 세포 죽음을 암시하는, 허혈 재구주입 유도한 두뇌 상해에 대하여 추출의 강력한 신경 보호 효력을 건의합니다.
이 절차를 시도하는 동안, 이 기간 도중 상대적인 소뇌 혈류를 감시하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그리고 공정의 도체는 매우 신중하게 내피 층의 손상을 최소화하기 위해
